Introduction
Det ihop och förnyelse av tissuesis en av themain mål medicinsk vetenskap eftersom en skada i en vävnad ororgan kan vara förlamande och, i vissa fall, dödliga. I sammanhanget är vårdpersonal och forskare ständigt söker tekniker, metoder och verktyg för att ge ny terapeutisk alternativesto främja det pair-regenereringsprocess av skadad vävnad. Därför har biomedicinska vetenskaperna inriktats på studier av mesenkymala stamceller (MSCs), särskilt vuxna stamceller, eftersom denna cellinje utgör en idealisk modell för att studera vävnadsregenereringsprocessen, på grund av dess potential att differentieras till ektodermalt, mesodermalt och endodermalt cellinjer Men för att göra behandlingen med MSC verklighet måste karakterisering av thetherapeutic potential MSC åtföljas av införandet av nya cellodlingstekniker använder biomaterial och cell byggnadsställningar som garanterar önskat beteende MSC i värdvävnaden.
Protocol
Denna forskning utfördes i enlighet med World Medical Association Helsingforsdeklarationen om etiska uppförande forskning som avser människor och godkändes av Research Ethic styrelse Facultad de Medicina, UNAM (projektnummer 101-2012).
1. Isolering av humana mesenkymala stamceller
- Beredning av reagens
- Förbered fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och komplettera med en% antibiotisk-antimykotisk lösning.
- Förbered Dulbeccos modifierade Eagles medium, hög glukos (HG-DMEM), och tillsätt 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotikum-antimykotikum solution.Sterilize denna odlingsmediet genom filtrering genom ett 0,2 pm filter.
- Förbered en kollagenas II lösning vid 100 U / ml i HG-DMEM utan FBS eller antibiotika-antimykotika lösning.
- Sterilisera följande kirurgiska instrument, som behövs för isolering, genom autoklavering: standard saxs, enkla dissekera pincett, fin-punkt och tandade pincett och en skalpell handtag (# 4).
- Isolering av mesenkymala stamceller av mänskligt amnionmembran
- Håll navelsträngen med en hand och med den andra handen, loss amnionmembran (AM), som ser ut som ett translucent ark, för att erhålla ett fragment om cirka 5 cm 2. Om chorion sektionen är närvarande i provet, separera den underliggande chorion genom manuell dissektion som chorion sektionen är tjockare än amnion.
- Avlägsna resterande blod med tre tvättar av 5 ml PBS och ta bort blodproppar med enkla pincett. Gör ett litet snitt i AM med skalpell för att generera fragment av ca 0,5 cm 2.
- Enzymatisk spjälkning av amnionmembran
- Inkubera AM med 5 ml 0,125% trypsin / 0,5 mM EDTA-lösning vid 37 ° C under 30 min i en 50 ml koniskt rör vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär. Centrifugera vid 250xg och 25 ° C under 5 min och sedan ta bort trypsin lösningen genom att kasta supernatanten.
- Tillsätt 15 ml kollagenas typ II-lösning och inkubera under 2 h vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär med tillfällig skakning enligt Leyva et al. 9
- Omedelbart efter digerering med kollagenas II, tillsätt 15 ml PBS och centrifugera vid 250 xg och 25 ° C under 10 min.
- Kasta bort supernatanten och tvätta den cellulära pelleten med 15 ml PBS-lösning och centrifugera vid 250 xg och 25 ° C under 15 min. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellulära pelleten i 10 ml HG-DMEM genom att skaka försiktigt.
- Expansion av mesenkymala stamceller
- Seed 2 ml cellsuspension (1 x 10 4 celler / cm 2) i odlingskolv och tillsätt 2 ml HG-DMEM och inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär. Eliminera icke vidhäftande cell genom att ändra odlingsmedium efter 5-7dagar.
- Efter denna tid, ändra odlingsmediet var 3 dagar under ytterligare 7-10 dagar för att erhålla en cellulär sammanflöde av 90%.
- Åter cellerna och inkubera dem under 5 min vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär med 0,125% trypsin / EDTA-lösning (trypsinisering).
- Omedelbart efter trypsinisering, samla celler med en pipett och överföra till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 250 xg under 5 minuter.
- Kasta bort supernatanten och suspendera den cellulära pelleten i 10 ml HG-DMEM.
- Kultur cellsuspensionen i två 75 cm 2 odlingsflaskor (5 ml i varje kolv), och bibehålla kulturen tills 90% sammanflödet.
- Upprepa steg 1.4.3. till 1.4.6, tills den 9: e passage eller subkultur.
- Åter cellerna genom trypsinisering som i steg 1.4.3 till 1.4.5 för flödescytometri eller andra studier.
2. Beredning av porösa Bone Matrix Disk (NKB)
- För att väta NKB diskar(Diameter 12 mm, tjocklek, 2 mm)., Inkubera varje skiva över natten med 3 ml HG-DMEM utan FBS i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C, enligt Fassina et al 5
- Efter bevätningsförloppet, placera skivan i ett 50 ml koniskt rör och centrifugera vid 250 xg under 5 min för att avlägsna överskott av odlingsmedium. Placera skivan i en 24 väl cellodlingsplatta.
- Lägg 500 pl av HG-DMEM och inkubera under 30 minuter vid 25 ° C. Se till att inga bubblor på NKB disken för att gynna den korrekta fördelningen av näringsämnen och celler.
- Om bubblor observeras på skivan, skaka och tillsätt 300 | il av odlingsmediet och inkubera under 15 min i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C. Efter denna tid avlägsna 300 | il odlingsmedium suger genom väggen av väl cellodling och bekräfta att inga bubblor bildas.
- Placera skivan i en ny 24-brunnars platta med användning av enkla pincett.
- Seed en cellulär suspension (5 x 10 05:00-hMSCs i 100 pl av HG-DMEM) från tre subkulturer, på ytan av den för-vätta biomaterial disk och inkubera under 30 min i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C. Utför detta steg långsamt och kontinuerligt på den övre ytan av biomaterialet för att tillåta cellerna att interagera med topografin av alla byggnadsställning. Notera: Denna procedur uppnår 60% av de celler fästa på biomaterialet som visas i Tabell 1.
- Lägg 1,5 ml HG-DMEM vid 37 ° C, och bibehålla kulturen för tre dagar i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C. Inte alstra turbulens i tillsats av odlingsmediet för att undvika att avsättningen av celler på botten av odlingsplattan skålen. Detta är första gången.
4. cellytmarkörer Karakterisering av Flow Cytometry
- Lossa cellerna från 9: e subkultur innan sådd dem på matrisen disken. Använd 0,25% trypsin / 1 mM EDTA och fixa dem i 30 minuter i iskallt 2% formaldehyd. Efter fixering, tvätta cellerna en gång med 0,05% PBS.
- Blockera icke-specifik bindning genom att inkubera cellerna med 20% humant immunglobulin för 3 min på is och inkubera 0,1 x 10 6 celler alikvoter med fykoerytrin (PerCP) -konjugerad MAb mot CD73, FITC-konjugerad MAb CD90, PE-konjugerade MAb mot CD34 , FITC-konjugerad MAb CD45 och PE-konjugerade Mab CD105 under 1 h vid 25 ° C i mörker. Isotypmatchad FITC-konjugerad MAb kommer PE-konjugerade Mab andPerCP-konjugerade Mab tjäna som negativa kontroller.
- Beräkna uttrycksnivåer av de ytmarkörer använder programvara för datainsamling och analys.
5. Cell Adhesion Detection med svepelektronmikroskopi
- Skölj cell disk prover vid 3 dagars odling två gånger med PBSoch fixthe prover med 4% (volym / volym) glutaraldehyd solutionin en 0,1 M Na-kakodylatbuffert (pH 7,2).
- Bereda proverna för mikroskopisk observation, som tidigare rapporterats av Rivera-N et al. 10 och observera med användning av ett svepelektronmikroskop vid en elektrisk potential av 15 kV och vid en förstoring av 500X och 2000X.
6. cellproliferationsanalys
- Till cell-skivprover innehållande 1,5 ml odlingsmedium, tillsätt 150 | il av vital färgämne (AB) enligt tillverkarens riktlinjer och inkubera cellerna i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C.
- Omedelbart efter tillsats av AB (0 h) och varje 24 h tills den når 7 dagars cellodling, mät absorbansen vid 570 nm med en referensvåglängd på 600 nm.
7. kolonibildande enhet (CFU) 11
- Kultur 100 celler per 100 mm vävnadskultur Diskin HG-DMEM och inkubera i 14dagar i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C.
- Tvätta odlingen med PBS och fläcken med 0,5% kristallviolett i metanol under 5 till 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta plattorna med PBS två gånger och räkna de synliga kolonier med användning av en hemocytometer.
Representative Results
Humant mesenkymal stamcell isolering
Efter mekanisk separation av AM från chorion använder dissektion (Figur 1), var en anhängare cellpopulation som erhållits genom trypsin och kollagenas II matsmältningen. Dessa cellpopulationer fästa i odlingsskålen presenta fibroblastliknande cellmorfologi vid 3 dagar efter isolering, såsom visas i det optiska mikrofotografiet (fig 2A) och svepelektronmikrofotografi (Figur 2B) .De moderkakor används i detta arbete erhölls från friska donator mödrar withprevious informerat medgivande.
Cell karakterisering med flödescytometri
Cellpopulationen som erhölls från AM var starkt reaktiv till ytan mesenkymala markörer CD90 + (93,5% ± 6,85) och CD73 + och CD105 + (79% ± 3,46) och visade en negativ reaktion på hematopoetiska markörer som CD34- och CD45. SålundaAM-hMSCs som används i detta arbete var mesenkymala i accordancewith information som tidigare rapporterats av Leyva et al. (Figur 3). Dessutom sammanfaller detta resultat med immunofenotyp egenskaper som fastställts av International Society for Cellular Therapy (ISCT) för mesenkymala stamceller.
Celladhesion på benmatrix
Skannings mikrografier visar beteendet hos de AM-hMSCs sju dagar efter skiktning på NKB. Den yta av biomaterialet var täckt med sfäriska celler (dag ett) och vissa spridnings celler synes fästa vid det bovina matrisytan på den sjunde dagen. Vid högre förstoring, dök spridnings cellerna att vara i nära kontakt via filipodial processer (FL) (Figur 4).
Cellproliferering på benmatris
Resultaten av AB-analysen visade en liten minskning i relativ absorbans u nits (RAU) av bovint matris Förhållande (+ benmatris) efter en dag av inkubation och därefter på den femte dagen, närvaron av ställningen inducerar en ökning i cellproliferation statistiskt signifikant i jämförelse med kulturen utförs i frånvaro av bovint matrix (-bone matris) (Figur 5).
Kolonibildande enhet
Den CFU är ett traditionellt test av stamceller. AM-hMSCs isolerade i detta arbete bevarat sin förmåga att bilda diskreta kolonier vid 14 dagar i kultur.
Figur 1: Isolering av amnionmembran. (A) Den navelsträng (UC) hålls med en hand för att identifiera den region där fosterhinnan erhålls. (B) Den fosterhinnan (AM) liknar en genomskinlig film utan blod innervations.
Figur 2:. Morfologiska egenskaper stamceller från den humana amnionmembran AM-hMSC kulturer vid 3 dagar efter isolering observerades med användning av ett optiskt mikroskop och visat fibroblastliknande morfologi.
Figur 3:. Flödescytometri karakterisering Cellerna från human fosterhinnan var mestadels mesenkymala celler eftersom de var positiva för mesenkymala markörer (CD73, CD90, CD105), vilket framgår av förskjutning av histogrammet åt höger, och negativt för hematopoetiska markörer (CD34 och CD45), vilket bekräftas av förskjutningen av histogrammet åt vänster. De antigener visas i rött histogram, medan kontroll isotypesfor fluorokromerna PE och FITC observeras isvart.
Figur 4:.. Celladhesion på bovin benmatris En serie av SEM-bilder som visar vidhäftning av cellerna till porerna hos biomaterialet (A) Panorama vision av en NKB por med flera celler vidhäftade till biomaterialet i den sfäriska tillståndet (CS) och tillplattad (CF) på ytan av biomaterialet, är också möjligt att uppskatta benet lucka indikerar som (Lac) vid tre odlingsdagen på den bovina matrisen. (B) Amplifiering av cellen i processen för anpassning vid ytan av materialet genom filipodial projektioner (C) Interaktion mellan två celler vidhäftade och plattade på nötkreatur matrisen (C1, cell 1 och C2, cell 2).. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
Figur 5:. Proliferation av celler på bovin benmatris Cellproliferering utvärderades av AB reduktion och uttrycktes i relativa absorbansenheter längs 7 dagars odling. Resultaten visas påverkan av benvävnad (+ benmatrix) i AM-hMSCs proliferation som var statiskt annorlunda i jämförelse med det negativa villkoret (-bone matrix). (* P <0,05)
Figur 6: CFU-analys av MSC initialt ströks ut vid varierande densiteter och inkuberades under 14 dagar (medelvärde * / - SD, n = 10).
| Celler vidhäftade | Celladhesion (%) | |
| Celler på botten | 187667 ± 1208 | 62,47 |
| Celler på ställningen | 312333 ± 1208 | 37,53 |
Tabell 1:. Effektivitet av vidhäftning på bovin matris Cellerna vidhäftade till botten av plattan skålen och cellerna som sitter fast på ställningen räknades genom hemocytometer efter att återvinnas av trypsinization.The data som presenteras i tabellen motsvarar två experiment oberoende för tre exemplar ± standardavvikelse
Discussion
De stamceller som erhölls från human fosterhinnan (Figur 1) visade en fibroblast-liknande morfologi, liknande mesenkymala celler (Figur 2) och var huvudsakligen MSC. Dessutom flödescytometri analyser visade att dessa celler var positiva för mesenkymala cellmarkörer (CD73, CD90, och CD105) och negativ för hematopoetiska härstamning markörer (CD34, CD45) (Figur 3). Även AM-hMSCs isolerade i detta arbete presenterar förmågan att bilda CFU (Figur 6). Likaså de mesenkymala stamceller som isoleras i denna form bibehöll förmågan att fästa till osteoinductor biomaterial (Figur 4), och proliferera på ställningen (fig 5).
Av dessa skäl, kulturen metoden AM-hMSCs på makroporös ben biomaterial som användes i detta arbete utgör en möjlighet att infoga celler i skadade benvävnad och inducera sin differentiation till den osteoblastiska härstamning. Denna kultur systemet kräver inte tillsats av osteoblastiska induktorer att bibehålla osteoblast fenotypen och osteoblastiska differentieringsprocess eftersom NKB är ett osteokonduktivt andosteoinductive materialet 8. Användningen av avfallsvävnader, såsom human placenta, representerar en enkel och etisk alternativ för att komma åt en population av stamceller med potential att differentiera till MSC, i jämförelse med andra källor som ofta involverar invasiva metoder eller låg cellutbyte.
Den föreslagna odlingsmetod kunde överföras till in vivo-system eftersom cellerna ympas i mikro-massa på den övre ytan materialet, och cellerna koloniserar och vidhäftar till hela biomaterialytan efter lämpliga inkubationstider. Dessutom är sofistikerad reagenser, utrustning och rutiner krävs inte, till skillnad från befintliga metoder vid genomförandet av denna teknik är de mikro massa cultureas samtlångsam och stadig avsättning av den cellulära alikvot på material för att säkerställa att cellerna preferentiellt interagerar med biomaterialet, och inte med botten av plattan. En annan kritisk punkt är användningen av pre-fuktade material innan odla cellerna, eftersom detta säkerställer att cellerna får de nödvändiga näringsämnen från odlingsmediet när de är integrerade i materialet oavsett om de är på ytan eller i porerna. Slutligen är användningen av ett osteoinduktivt biomaterial kritisk för denna process eftersom det undviker tillsats av yttre faktorer för att inducera och upprätthålla osteoblastisk differentiering. Begränsningen av teknik är att den är baserad på den osteoinduktiva potentialen hos den bovina matrisen; emellertid, kan den föreslagna kultursystem extrapoleras till vilket som helst poröst material med en porfördelning av 20 till 200 um. Därför det förfarande som presenteras i detta arbete är en alternativ metod för odling av mesenkymala stamceller i olika material thatt används för vävnadsteknik, särskilt för benuppbyggnad.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Vi erkänner stipendium och finansiellt stöd från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 och DGAPA IN216213; Salvador Correa av Instituto Nacional de Perinatología för hjälp med det biologiska materialet; och Biocriss, SA de C. V för att donera Nukbone. Också tacka till Ing. Héctor Martínez av IIM, UNAM och M en C Fabiola Gonzalez av CINVESTAV för tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
- Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
- Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
- Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
- Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
- Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
- Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
- Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
- Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
- Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
- Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
- Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).
