Introduction
Orada çift oluşturan ve doku ororgan bir lezyon etkisiz hale olabilir ve bazı durumlarda, öldürücü çünkü tıp bilimi Themain hedeflerinin tissuesis bir rejenerasyonu. Bağlamda, sağlık çalışanları ve araştırmacılar sürekli yeni tedavi alternativesto hasarlı doku orada çifti-rejenerasyon süreci teşvik sağlamak için teknikler, yöntemler ve araçlar arıyorsunuz. Bu hücre soyu, doku rejenerasyon sürecini incelemek için ideal bir model temsil nedenle, biyomedikal bilimler ektodermal, mezodermal ve endodermal için ayırt nedeniyle potansiyeli, mezenkimal kök hücrelerin (MKH), özellikle erişkin kök hücrelerin çalışmasında odaklanmıştır hücre soyları Ancak, MSC ile bir gerçeklik terapisi yapmak, MKH thetherapeutic potansiyelinin karakterizasyonu konak dokusunda MKH istenen davranışı garanti biomateryaller ve hücresel iskeleleri kullanarak yeni hücre kültürü teknikleri uygulanması eşlik etmelidir.
Protocol
Bu araştırma araştırma içeren insanların etik davranış konusunda Helsinki Dünya Tıp Birliği'nin Deklarasyonu çerçevesinde yapıldı ve Facultad de Medicina, UNAM (proje numarası 101-2012) Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
İnsan Mezenkimal Kök Hücre 1. izolasyonu
- Reaktifin hazırlanması
- % 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) ve ek hazırlayın.
- Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı, yüksek glikoz (HG-DMEM) hazırlayın ve bir 0.2 mikron filtre içinden süzme ile,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik solution.Sterilize Bu kültür ortamı ilave edin.
- FBS ya da antibiyotik-antimikotik çözelti olmadan HG-DMEM 100 U / ml bir kolajenaz II çözeltisi hazırlayın.
- , Izolasyon için gerekli otoklav ile aşağıdaki cerrahi aletler, sterilize: Standart makass, basit kesme forseps, ince noktası ve dişli forseps ve neşter sapı (# 4).
- İnsan amniyon zarının mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu
- Tek elle göbek bağını tutun ve diğer elinizle, yaklaşık 5 cm 2 bir parçasını elde etmek için, bir saydam tabaka gibi görünüyor amniyotik membran (AM), ayırmak. Koryon kısmı numune içerisinde mevcut olması halinde koryon bölümü amniyon daha kalın olduğu için, el ile diseksiyon ile temel koryon ayırın.
- PBS 5 ml üç yıkar ile artık kan çıkarın ve basit forseps ile pıhtıları çıkarın. Yaklaşık 0.5 cm 2 parçalarını üretmek için neşter ile AM küçük bir kesim olun.
- Amniyon zarının enzimatik sindirimi
- % 0.125 tripsin, 5 ml /% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 50 ml konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca 37 ° C 'de 0.5 mM EDTA çözeltisi ile AM inkübe edin. 250 santrifüjxg ve 5 dakika için 25 ° C sıcaklığa getirilmiş ve süpernatan atarak tripsin uzaklaştırın.
- Ara sıra Leyva ve ark göre çalkalanarak bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 2 saat boyunca kollajenaz tip 15 ml II solüsyonu eklenir ve inkübe edilir. 9
- Hemen kolajenaz II ile sindirmeden sonra 250 x g hızında 15 ml PBS ve santrifüj ilave edin ve 10 dakika boyunca 25 ° C.
- Süpernatant atılır ve 250 x g hızında PBS çözeltisi ve santrifüj 15 ml ve 15 dakika için 25 ° C hücre pelet yıkayın. Süpernatantı atın.
- Hafifçe sallayarak HG-DMEM 10 ml hücresel pelletini.
- Mezenkimal kök hücrelerin genişlemesi
- Tohum 2 kültür şişesi içinde hücre süspansiyonu (1 x 10 4 hücre / cm2) ml ve bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C'de hücreler HG-DMEM 2 ml ilave edilir ve inkübe edilir. 5-7 sonra kültür ortamı değiştirerek yapışmayan hücre ortadangün.
- Bu süre sonunda,% 90 oranında hücresel izdiham elde etmek için ek 7-10 gün için kültür ortamı her 3 günde bir değiştirin.
- Hücreleri yeniden elde etmek ve% 0.125 tripsin / EDTA solüsyonu (tripsinizasyon) bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe.
- Hemen tripsinizasyondan sonra 5 dakika boyunca 250 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj bir pipet ve transferi hücreleri toplamak.
- Süpernatantı atın ve HG-DMEM 10 ml hücresel pelletini.
- Kültür hücre iki kez 75 cm2 kültür şişelerinde süspansiyonu (her bir şişeye 5 ml) ve% 90 birbirine karışana kadar kültürünü.
- Tekrarlayın 1.4.3 adımları. 1.4.6 için, 9. geçit veya alt kültür kadar.
- Flow sitometri veya diğer çalışmalar için 1.4.5 adımlar 1.4.3 gibi tripsinizasyon hücreleri kurtarın.
Gözenekli Kemik Matriks Disk 2. Hazırlık (NKB)
- NKB diskleri ıslak(Çap 12 mm, kalınlığı 2 mm)., Her disk inkübe gece boyunca ile Fassina ark.'nın patentine uygun olarak 3 ila 37 ° C 'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde FBS'siz HG-DMEM mi, 5
- Islatma işleminden sonra, fazla kültür ortamı ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca 250 x g'de 50 ml konik bir tüp ve bir dönüş diski yerleştirin. 24 gözlü bir hücre kültürü plakasının diski yerleştirin.
- HG-DMEM 500 ul ilave edin ve 25 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edin. Hiçbir kabarcıklar besin ve hücrelerin doğru dağılımını lehine NKB diskte mevcut olduğundan emin olun.
- Kabarcıklar diskte gözlenirse, sarsıntı ve kültür ortamında 300 ul ekle ve 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, 15 dakika boyunca inkübe edin. Bu sürenin sonunda, hücre kültürü duvarından emme kültür ortamında 300 ul kaldırmak ve hava kabarcığı meydana olduğunu teyit etmektedir.
- Basit bir forseps kullanılarak yeni bir 24 oyuklu plaka diski yerleştirin.
- Önceden ıslatılmış biyo materyal diskin yüzeyi üzerinde, üç alt kültürlerden (HG-DMEM 100 ul içinde 5 x 10 5:00-hMSCs) hücresel bir süspansiyon Seed ve 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde, 30 dakika boyunca inkübe ° C. Hücreler tüm iskele topografya ile etkileşim sağlamak için biyomalzeme üst yüzünde yavaş yavaş ve sürekli bu adımı gerçekleştirin. Not: Bu prosedür, Tablo 1 'de gösterilen biyo ekli hücrelerin% 60 elde edilir.
- 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde 3 gün için kültür, 37 ° C'de HG-DMEM 1.5 ml ilave edilir, ve korumak. Kaçının kültür ortamının ilave türbülans oluşturmayan bu kültür plakası çanak alt hücre birikme. Bu ilk kez.
Akış sitometride tarafından 4. Hücre Yüzey İşaretleyiciler karakterizasyonutrisi
- Matris diskte onları ekim önce 9. altkültür hücreleri ayırın. % 0.25 tripsin / 1 mM EDTA kullanarak ve buz gibi soğuk% 2 formaldehit 30 dakika boyunca sabitleyin. Tespit sonra,% 0.05 bir kez PBS ile yıkayın hücreleri.
- Buz üzerinde 3 dakika boyunca% 20, insan bağışıklık, hücreler inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma bloke ve fikoeritrin (PerCP) 0.1 x 10 6 hücre alikotları inkübe CD73 FITC-konjüge Mab CD90, CD34 karşı PE-konjuge MAb karşı MAb ile konjüge edilmiş Karanlıkta 25 ° C 'de 1 saat süre ile, sonra ya FITC-konjüge Mab CD45 PE-konjuge Mab CD105. İzotip uyumlu FITC-konjüge Mab, PE-konjuge Mab andPerCP-konjuge Mab negatif kontroller olarak hizmet edecektir.
- Bilgi kaydı ve analizi için yazılım kullanılarak yüzey markerlerinin ekspresyon seviyelerini hesaplar.
Taramalı Elektron Mikroskobu 5. Hücre Adezyon Algılama
- PBS ile iki kez kültür 3 gün hücre disk örnekleri durulayınve 0.1 M Na-kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) solutionin% 4 (hacim / hacim), glutaraldehid ile fixthe örnekleri.
- Daha önce Rivera-N ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi., Mikroskopik gözlem için 10 numune hazırlayın ve 15 kV arasında bir elektrik potansiyelinde ve 500X ve 2000X büyütülmüş bir tarama elektron mikroskobu kullanılarak dikkate alınmalıdır.
6. Hücre Proliferasyon Deneyi
- Kültür ortamı, 1.5 ml ihtiva eden hücre disk örnekleri için, 37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde hücreleri, üreticinin talimatlarına hayati renklendirici (AB) göre 150 ul ekle ve inkübe edilir.
- Hemen AB (0 saat) ilavesi ve hücre kültürü 7 gün ulaşana kadar, her 24 saat sonra, 600 nm'lik bir referans dalga boyu ile 570 nm'de absorbansı ölçülür.
7. Koloni Oluşturma Birimi (CFU) 11
- Kültür, 100, 100 mm doku kültürü Diskin HG-DMEM başına hücre ve 14 için inkübe37 ° C'de% 5 CO2 olan nemli bir atmosferde gün.
- Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca metanol içerisinde% 0.5 kristal mor ile PBS ile kültür ve leke yıkayın.
- PBS ile iki kez yıkayın plakaları ve hemasitometre kullanarak görünür koloniler sayılır.
Representative Results
İnsan mezenkimal kök hücre izolasyonu
Künt diseksiyon (Şekil 1) kullanılarak koryon AM mekanik ayrılmasından sonra, yapışık hücre popülasyonu tripsin ve kolajenaz II sindirimi ile elde edildi. Sağlıklı donor anne elde edilmiştir, optik mikrografı (Şekil 2A) ve tarama elektron mikroskobu (Şekil 2B) bu çalışmada .Kullanılan plasenta gösterildiği gibi 3 gün fibroblast benzeri hücre morfolojisi tanıtımın kültür kabına bağlı Bu hücreler izole yayınlamak withprevious aydınlatılmış onam.
Flow sitometri ile hücre karakterizasyonu
AM elde edildi hücre popülasyonu (3,46 ± 79%) yüzey mezenkimal belirteçleri CD90 + (6,85 ± 93.5%) ve CD73 + ve CD105 + kuvvetle tepkisel ve böyle CD34 ve CD45 gibi hematopoetik belirteçler olumsuz tepki gösterdi. Bu durumda,Bu çalışmada kullanılan AM-hMSCs önce Leyva ve ark. (Şekil 3) tarafından bildirilen accordancewith bilgi, mezenkimal edildi. Ayrıca, bu sonuç mezenkimal kök hücreler için Hücresel Tedavi için Uluslararası Derneği (ISCT) tarafından kurulan immünofenotipi özellikleri ile çakışmaktadır.
Kemik matrisinin Hücre yapışması
Tarama mikrografları NKB üzerinde katman sonra AM-hMSCs yedi gün davranışını göstermektedir. biyo yüzeyi küresel hücrelerin (bir gün), ve görünüşe göre yedinci günde sığır matris yüzeyine bağlı bir yayılma hücrelerle kaplanmıştır. Daha yüksek bir büyütmede, yayılan hücrelerin filipodial süreçler (FL) (Şekil 4) ile yakın temas içinde olduğu ortaya çıktı.
Kemik matrisinin Hücre çoğalması
AB deneyinin sonuçları nispi absorbans az bir artış göstermiştir u nit sığır matris durum (+ kemik matris) (RAU), inkübasyondan 1 gün sonra ve daha sonra beş gün, skafoldun varlığı, sığır yokluğunda yapılan kültür ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak önemli hücre çoğalmasında bir artışa neden olur Matris (-bone matris) (Şekil 5).
Koloni Oluşturma Birimi
CFU kök hücrelerin bir geleneksel deneyidir. Bu çalışmada izole AM-hMSCs kültürde 14 gün sonra ayrı ayrı koloniler oluşturmak için kabiliyetini korumuştur.
Şekil 1: amniyotik membran izolasyonu. (A) göbek kordonu (UC) amniyotik zar elde edildiği bölgeyi tanımlamak için tek elle tutulur. (B) amniyotik membran (AM) kan inervasyonları olmadan saydam bir film benzer.
Şekil 2:. İnsan amniyon zarı kök hücrelerin morfolojik özellikleri sonrası izolasyon 3 gün AM-hMSC kültürleri bir optik mikroskop kullanılarak gözlenen ve fibroblast-benzeri morfolojisi gösterildi.
Şekil 3:. Karakterizasyonu Akış sitometrisi insan amnion membrandan hücreler, mezenkimal belirteçleri (CD73, CD90, CD105) için pozitif olduğu için sağa histogram yer değiştirmesi ile gösterildiği gibi, en çok mezenkimal hücreler, ve (hematopoetik belirteçler için negatif CD34 ve CD45), sola histogram yerinden tarafından onaylandıktan. PE ve FITC florokromlar isotypesfor kontrol gözlenir ise antijenler kırmızı histogramlar gösterilmiştirSiyah.
Şekil 4:.. Sığır kemik matrisi üzerinde biyomalzemenin gözenekleri hücrelerin eki gösteren SEM görüntüleri bir dizi Hücre yapışma (A) küresel devletinin (CS) 'de biyomateryal yapışık çeşitli hücreleri ile bir NKB gözenek Panoramik vizyon ve Biyo materyalin yüzeyinde (CF), düzleştirilmiş, sığır matrisi üzerinde kültürün üç gün boşluk (Lac) halinde gösterir kemik takdir edilmesi de mümkündür. yüzeyinde uyum sürecinde hücresi (B) Amplifikasyon filipodial projeksiyonlar aracılığıyla malzeme sığır matris üzerinde yapıştırılır ve basık iki hücre arasındaki (C) Etkileşim (C1, hücre 1 ve C2, hücre 2).. v için tıklayınızBu rakamın büyük bir sürümünü IEW.
Şekil 5:. Sığır kemik matris hücre çoğalması üzerinde hücrelerinin çoğalması AB azaltılması ile değerlendirildi ve yetiştirme 7 gün boyunca göreceli emme birimleri cinsinden ifade edildi. Sonuçlar negatif durum (-bone matris) ile karşılaştırıldığında statik farklı AM-hMSCs çoğalmasında, kemik matrisinin (+ kemik matrisi) etkisi gösterilmiştir. (* P <0.05)
Şekil 6: MSC CFU tahlili başlangıçta farklı yoğunluklarda kaplanmıştır ve 14 gün süre ile kuluçkaya yatırılır (- SD, n = 10 * /) alınmıştır.
| Hücreler yapıştırılır | Hücre yapışma (%) | |
| Alt Hücreler | 187.667 ± 1.208 | 62.47 |
| Iskele üzerinde Hücreler | 312.333 ± 1.208 | 37,53 |
Tablo 1:. Üç nüsha için iki deney bağımsız sığır matris üzerinde yapışma Verimlilik plaka çanak alt ve iskele üzerinde kalarak hücrelere yapışık hücreler tabloda sunulan trypsinization.The verileri tarafından kurtarıldı sonra hemasitometre tarafından sayıldı karşılık standart sapma ±
Discussion
amniotik membran (Şekil 1) elde edildi kök hücre bir fibroblast-benzeri morfolojisi, mezenkimal hücreler benzer (Şekil 2) gösteren ve esas olarak MSC'ler idi. Buna ek olarak, akış sitometrisi analizleri, bu hücreler olmak üzere hematopoietik kökenli belirteçleri (CD34, CD45) (Şekil 3), mezenkimal hücre belirteçleri (CD73, CD90 ve CD105) için pozitif ve negatif olduğu saptandı. Ayrıca, bu işin izole AM-hMSCs CFU (Şekil 6) oluşturma yeteneğini sunmaktadır. Benzer şekilde, bu formda izole mezenkimal kök hücreler (Şekil 5) osteoinductor biomateryalin (Şekil 4) eklemek, ve iskele üzerinde çoğalmaya yeteneği korudu.
Bu nedenlerden dolayı, bu çalışmada kullanılan gözenekli kemik biomateryalin AM-hMSCs kültür yöntemi yaralı kemik dokusu içinde hücreler eklemek ve differe ikna etmek için bir fırsat temsilosteoblastik soy ntiation. Bu kültür sistemi NKB bir osteokondüktif andosteoinductive malzeme 8, çünkü, osteoblast fenotip ve Osteoblastik farklılaşma işlemin muhafaza edilmesi için osteoblastik endüktör eklenmesini gerektirmez. İnsan plasentasından atık dokuların kullanımı sıklıkla invazif yöntemler ya da düşük hücre verimi içeren diğer kaynakları ile karşılaştırıldığında, MSC içine ayırt etmek için potansiyeli olan, kök hücrelerin bir popülasyonu ulaşmak için basit ve etik bir alternatiftir.
Hücreler üst yüzey malzemesi mikro-kütle numaralı seribaşı çünkü önerilen kültür yöntemi in vivo sistemlere varılıp varılamayacağı, ve hücreler kolonize ve uygun inkübasyon süreleri sonrasında tüm biyomalzeme yüzeyine yapışır. Bu tekniği uygularken Ayrıca, gelişmiş reaktifler, ekipman ve prosedürler de mevcut yöntemlerin aksine, mikro-kütle cultureas olan gerekli değildirmateryal hücresel alikotundan yavaş ve istikrarlı birikim hücreleri tercihen plaka alt ile biyomateryal ile etkileşim değil, emin olmak için. Bu yüzey üzerinde veya gözeneklerin içinde ise ne olursa olsun malzemeye bağlandıktan sonra, hücreler, kültür ortamından gerekli besinleri olmasını sağlar Diğer bir önemli nokta, hücrelerin kültürlenmesi önce, önceden ıslatılmış malzemenin kullanılmasıdır. Uyarılması ve osteoblast farklılaşmasını sağlamak için dış faktörlerin ilave önler çünkü Son olarak, osteoindüktif bir biyo materyalin kullanılması, bu süreç için önemlidir. tekniğin sınırlama sığır matris osteoendüktif potansiyele dayalı olmasıdır; Bununla birlikte, önerilen kültür sistemi 200 um, 20 bir gözenek dağılımına sahip bir gözenekli malzemeye uyarlanabilir. Bu nedenle, bu çalışmada sunulan prosedür çeşitli malzemeler t mezenkimal kök hücrelerin kültürü için alternatif bir yöntemdirşapka, özellikle kemik rejenerasyonu için, doku mühendisliği için kullanılmaktadır.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz burs ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Tıp-UNAM DGAPA IN201510 ve DGAPA IN216213 tarafından sağlanan mali destek kabul; Biyolojik malzeme ile yardım için Instituto Nacional de Perinatología Salvador Correa; Nukbone bağış ve Biocriss, SA de C. V. Ayrıca Ing teşekkür ederiz. IIM'de, UNAM Héctor Martínez ve teknik yardım için CINVESTAV M tr C Fabiola Gonzalez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
- Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
- Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
- Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
- Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
- Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
- Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
- Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
- Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
- Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
- Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
- Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).
