Summary
Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.
Abstract
Le culture dei fotorecettori arricchito cono derivati da retine pulcino embrionali sono diventati uno strumento indispensabile per i ricercatori di tutto il mondo che studiano la biologia dei neuroni della retina, in particolare fotorecettori. Le applicazioni di questo sistema vanno oltre la ricerca di base, in quanto possono essere facilmente adattate alle alte tecnologie throughput per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, la manipolazione genetica dei fotorecettori retinici in queste culture ha dimostrato di essere molto impegnativo, che costituiscono una limitazione importante per l'utilità del sistema. Abbiamo recentemente sviluppato e validato un ex ovo tecnica plasmide elettroporazione che aumenta il tasso di trasfezione di cellule retiniche in queste culture per cinque volte rispetto ad altri protocolli attualmente disponibili 1. In questo metodo occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27, l'RPE viene rimosso, e la coppa retinica viene posto in una soluzione contenente plasmide e elettroporate utilizzando CUSTOM- facilmente costruitoelettrodi in. Le retine sono poi dissociate e coltivate utilizzando le procedure standard. Questa tecnica può essere applicata a studi overespressione nonché alla downregulation dell'espressione genica, per esempio attraverso l'uso della tecnologia RNAi plasmide-driven, comunemente ottenendo l'espressione del transgene nel 25% della popolazione fotorecettori. Il formato video di questa pubblicazione rendere questa tecnologia facilmente accessibile ai ricercatori del settore, che consente lo studio della funzione dei geni in colture primarie della retina. Abbiamo incluso anche spiegazioni dettagliate sulle fasi critiche di questa procedura per un esito positivo e la riproducibilità.
Introduction
Colture di cellule dissociate da retine pulcino embrionali sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia cellulare dei fotorecettori, tra cui la loro sopravvivenza 2-9, differenziazione 10-12, crescita dei neuriti 13, e altro ancora. I vantaggi di questo sistema, sviluppato nel 1980 da Ruben Adler e collaboratori e perfezionati dai suoi e altri gruppi 14-20, risiedono nelle caratteristiche intrinseche del pulcino come un modello animale 21. Le grandi dimensioni dell'occhio pulcino, anche a stadi embrionali, fornisce una grande quantità di materiali per le culture. Inoltre, quando le culture vengono eseguite utilizzando giorno embrionale (ED) 5 - 6 retine, 55-80% dei loro cellule progenitrici differenziarsi come fotorecettori 14,15,18,22,23, e dal momento che circa il 86% dei fotorecettori in questo animale sono coni 24, queste culture sono particolarmente adatti per studi che mettono in questo tipo cellulare.
Abbiamo recentemente sviped e caratterizzato una semplice tecnica che consente ad alta efficienza plasmide trasfezione delle cellule in queste culture, ampliando così l'utilità di questo sistema facilitando studi missexpression genetica 1. Lo sviluppo di questa tecnica derivava da un vuoto nella letteratura scientifica di metodi che fornisca un livello accettabile di trasfezione per consentire lo studio della funzione genica in maniera autonoma cella. Ciò è in parte perché colture neuronali primarie sono notoriamente difficili da trasfettare 25,26. Alcune delle tecniche più utilizzate in precedenza disponibili per questo scopo inclusi metodi di transfezione chimici quali lipofezione o calcio trasfezione fosfato-mediata, che determinano efficienze dell'ordine del 3-5% e possono esercitare una notevole tossicità 27-32. Anche se l'uso di plasmidi con un sistema reporter enzimatico può aggirare il problema della scarsa efficienza di trasfezione amplificando il segnale, non lo fannodiscriminare effetti specifici delle cellule, ed i loro risultati sono basati su una piccola popolazione di cellule che potrebbe non essere rappresentativo dell'intero. Un altro metodo ampiamente usato al pulcino, infezione da virus RCA, è applicabile solo alle cellule proliferanti e quindi non adatto a questo sistema di coltura retinico primario 33.
Nel protocollo corrente occhi pulcino embrionale sono enucleati nella fase 27 (ED 5), l'epitelio pigmentato retinico (RPE) viene rimosso, e la coppa retinica è posto in una camera di elettroporazione riempita con una soluzione plasmide contenente e elettroporate con misura elettrodi, seguita da dissociazione della retina e della cultura utilizzando tecniche standard 21. Dopo ottimizzare questa procedura siamo stati in grado di ottenere sempre efficienza di trasfezione dell'ordine del 22% del numero totale di cellule in coltura e 25% nella popolazione fotorecettore sola, senza compromettere le caratteristiche di sopravvivenza e la differenziazione delleculture 1. Qui forniamo un protocollo dettagliata che illustra tutte le fasi importanti di questa procedura al fine di assicurare il successo e la riproducibilità di questa tecnica.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo lavoro sono stati eseguiti secondo le linee guida raccomandate dalla cura degli animali e del Comitato uso presso la Johns Hopkins University.
1. Ahead of Time: preparazione di strumenti, reagenti e piatti
- Preparazione di uova: incubare fecondate uova di gallina bianca Livorno a 37,5 ° C e 60% di umidità relativa per 5 giorni in una incubatrice uovo.
NOTA: Un incubatore con capacità di oscillazione può essere utile per la standardizzazione e la sincronizzazione di sviluppo embrionale, ma a dondolo non è strettamente necessario per l'esito di questo protocollo. - Plasmidi Preparazione:
- Disegno plasmide per costruire sovraespressione o downregulation gene (ad esempio tramite l'uso della tecnologia RNAi 1,34) come necessario. Includere un gene reporter (come EGFP, RFP o LacZ) nel costrutto, quando possibile.
NOTA: Alcuni promotori di uso comune come CMV, possono diventare a tacere dopo il tempo. Il promot CAGer (pollo beta-actina promotore con CMV enhancer) è una buona alternativa, fornendo espressione efficiente a lungo termine del gene di interesse 35-37. - Preparare una soluzione plasmide ad una concentrazione di 1,5 mg / mL in PBS sterile. OPTIONAL: Preparare la soluzione plasmide prima del tempo e conservarlo congelato fino al momento dell'uso.
NOTA: maggiore concentrazione plasmide non comportino un aumento significativo dell'efficienza, mentre l'uso di concentrazioni plasmide più basse riducono l'efficienza di trasfezione 1.
- Disegno plasmide per costruire sovraespressione o downregulation gene (ad esempio tramite l'uso della tecnologia RNAi 1,34) come necessario. Includere un gene reporter (come EGFP, RFP o LacZ) nel costrutto, quando possibile.
- Elettrodi:
- Per l'uso anodo un oro spessa punta elettrodo (vedi Tabella di materiali specifici / Equipment). Pulire con il 70% di etanolo.
NOTA: Isolamento dell'oro punta dell'elettrodo, lasciando circa 0,5 mm a vista, è consigliabile per ridurre la dispersione della corrente elettrica. Informazioni per materiale isolante può essere trovato nella tabella di materiali specifici. - Fare un catodo di 2,5 mm quadrati bbue filamento, largo 4,5 mm (normalmente utilizzato in estrattori micropipetta). Con l'aiuto di una pinza, svitare la scatola quadrata e raddrizzare filamento in una lunga striscia. Poi, al microscopio dissezione e utilizzando un righello come guida, piegare il filamento in una forma quadrata 'U' lunga 3 mm alla base e 2 mm su un lato, con l'altro lato della lunghezza rimanente del filamento (Figura 1 , C - D). Utilizzando pinze, immergere l'elettrodo nel 96% di etanolo e fiamme al sterilizzare. Quindi collegare un cavo elettrico con un piccolo coccodrillo per il braccio più lungo dell'elettrodo.
- Per l'uso anodo un oro spessa punta elettrodo (vedi Tabella di materiali specifici / Equipment). Pulire con il 70% di etanolo.
- Elettroporazione Camera Setup:
- Preparare la camera di elettroporazione tagliando il coperchio di una provetta sterile da 1,5 ml e apposizione, lato piatto verso il basso, ad una piastra di Petri 100 mm usando nastro (Figura 1E).
NOTA: altro contenitore in forma di un pozzo di dimensioni simili funzionerebbe; tuttavia, un coperchio provetta è facilmente accessibile e autoclavabile. Il pozzodeve essere sufficiente per ospitare un elettrodo pulcino occhio e catodo grande, ma non così grande da risultare in una perdita di soluzione plasmide.
- Preparare la camera di elettroporazione tagliando il coperchio di una provetta sterile da 1,5 ml e apposizione, lato piatto verso il basso, ad una piastra di Petri 100 mm usando nastro (Figura 1E).
2. Ex ovo Elettroporazione Procedura
- Preparazione degli strumenti:
- Sterilizzare gli strumenti di micro-dissezione (2 coppie di grandi pinze Moloney curve per aprire i gusci d'uovo e scavando embrioni, 2 paia di fine-tip curvo pinzette Dumont per la rimozione di RPE, un paio di Bonn dentato forcipe per obiettivo la rimozione e vitreo) per immersione il punte in 96% di etanolo e fiammeggiante. Ambito dissezione Pulire con panni immersi nel 70% di etanolo. Scaldare una bottiglia di soluzione salina bilanciata sterile calcio-magnesio-libero di Hank (CMF-HBSS) in un bagno d'acqua a 37 ° C. Riempire 100 mm sterili piastre Petri a 3/4 con caldo CMF-HBSS.
- Mettere camera di elettroporazione con un altro microscopio dissezione pulito e riempire con 120 ml di soluzione di plasmide. Collegare gli elettrodi agli apparecchi elettroporazione, rendendoAssicurarsi elettrodo misura è collegato al polo negativo e oro punta dell'elettrodo al polo positivo.
- Embrione Collezione:
- Pulire le uova strofinando conchiglie con salviette bagnate nel 70% di etanolo. Mantenere la procedura sterile per tutto il resto del protocollo per evitare di portare la contaminazione nelle culture. Utilizzando grandi pinze Moloney curve aprire con attenzione un buco nel guscio d'uovo picchiettando delicatamente sulla punta arrotondata di un uovo (sopra la camera d'aria) e poi presa e tirando fuori pezzi di conchiglia.
- Con un altro paio di pinze rimuovere membrane e raccogliere embrione da scavare fuori l'uovo (facendo attenzione a non danneggiare l'embrione). Mettere in un piatto con CMF-HBSS.
NOTA: raccogliere il maggior numero di embrioni necessari per ottenere il numero desiderato di tazze retina per elettroporazione come specificato in 2.4.4 - PUNTO CRITICO: stage gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton 38.
NOTA: Per ottenere gli embrioni ottimali di efficienzadeve essere di fase 27 (Figura 2A). - Eutanasia gli embrioni di decapitazione con pinze Moloney.
- Ottenere Coppe retina:
- Usando sottili pinzette Dumont, enucleare con attenzione gli occhi e trasferimento in un nuovo piatto CMF-HBSS.
- Partendo dalla parte posteriore di ciascun occhio, in prossimità della testa del nervo ottico, e utilizzando due pinzette Dumont fine, introdurre una punta di ciascuna coppia di pinzette tra la retina neurale e RPE e accuratamente sezionare la RPE essendo cauto per non danneggiare neurale retina (Figura 2B).
NOTA: La mancanza di Ca 2+ e Mg 2+ nella soluzione aiuterà il RPE stacca dalla retina neurale più facilmente.
- Elettroporazione:
- Impostare i parametri di elettroporatore per fornire impulsi di 5 quadrati di 15 volt, 50 msec, durata e intervallo 950 msec. Luogo 'U' a forma di elettrodo negativo all'interno della camera di elettroporazione (microcentrifuga coperchio di riempimentoED con 120 ml di soluzione contenente plasmide).
- Usando pinzette Dumont curvi trasferire una tazza retinica alla camera di elettroporazione (scavando, non pressatura), e posizionarlo all'interno dell'elettrodo sagomato 'U', con la parte posteriore della retina verso il fondo dell'elettrodo e la lente rivolta verso l'alto ( Figura 2D).
- Posizionare l'anodo in modo che tocchi la parte anteriore dell'occhio, accanto alla lente, e utilizzando pedale del electroporator fornire gli impulsi elettrici.
- Trasferire tazza retina elettroporate in un piatto Petri con CMF-HBSS e ripetere la procedura di elettroporazione con ciascuno dei restanti tazze retiniche.
NOTA: Fino a 6 tazze retina può essere elettroporate con la stessa soluzione plasmide senza una significativa diminuzione efficienza di trasfezione. - Rimuovere la lente e corpo vitreo di ogni coppa retinica elettroporate da loro presa con Bonn pinza dentata e tirando dolcemente attraverso tegli pupilla apertura tenendo l'occhio in posizione con la parte posteriore delle pinzette Dumont curve.
- Procedere alla dissociazione e la cultura delle cellule della retina elettroporate seguenti procedure standard.
NOTA: per un protocollo dettagliato sulla dissociazione e la cultura di cellule retiniche pulcino si riferiscono a Vergara e Canto-Soler 2012, sui file 4 21 In questo protocollo le cellule vengono seminate a bassa densità su 6 pozzetti poliornitina rivestite o 35. piatti -mm (6 x 10 5 cellule / 35 mm di diametro e o piatto). Il mezzo utilizzato è medium 199 con penicillina / glutammina, siero di vitello fetale al 10% (FCS), e acido linoleico-BSA a 100 ug / ml. Le colture vengono mantenute in un umidificata 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. Con questa procedura, 5 - 6 x 10 6 cellule in genere può essere ottenuto per ogni fase 27 occhio elettroporate.
NOTA: Idealmente, non più di 3 ore dovrebbe passare tra il prelievo e la placcatura delle cellule, per assicurare una buona sopravvivenza cellularee ridurre al minimo lo stress. Una tipica temporizzazione per l'osservazione e l'ulteriore analisi è dopo 4 giorni di coltura, poiché a questo punto le cellule hanno raggiunto una buona differenziazione morfologica e molecolare e la sopravvivenza è ancora alto.
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Representative Results
Qui vi presentiamo un semplice protocollo per plasmide trasfezione in enucleate pulcino tazze retina per la successiva coltura cellulare dissociata. Trasfezione si ottiene elettroporazione utilizzando facile fare elettrodi personalizzati (Figure 1 - 2). I parametri descritti in questo protocollo sono stati ottimizzati per ottenere efficienze di trasfezione che variano tra il 20 e il 27% (con una media del 22%) (Figura 3D). Si noti che, per le ragioni sopra esposte, questi risultati sono quantificati dopo 4 giorni di coltura. In questo contesto, l'efficienza di trasfezione si riferisce alla percentuale di cellule che esprimono il transgene all'interno della popolazione cellulare totale. Se solo la popolazione fotorecettore è considerato, l'efficienza di transfezione aumentano a una media del 25% (Figura 3D). Questa è una caratteristica importante in quanto questi tipi di colture sono utilizzati principalmente per studiare fotorecettori.
Le colture cellulari che sono stati electroporat ed utilizzando questa tecnica sono indistinguibili dalle loro controparti non elettroporate nella loro morfologia sotto illuminazione DIC, caratteristiche di sopravvivenza delle cellule, e l'espressione di marcatori molecolari quali visinin (un indicatore ampiamente usato di fotorecettori) e Pax6 1.
Figura 1. Realizzazione degli elettrodi. (A - D) Il catodo è costituito da un filamento scatola quadrata (A), che è prima raddrizzata (B) e poi piegati con una pinza in una 'U' forma quadrata (C - D). L'anodo è un oro spessa punta dell'elettrodo (D); Notate l'isolamento intorno all'elettrodo anodo, lasciando solo 0,5 millimetri della punta esposta. Setup (E) elettroporazione. Inserto mostra maggiore ingrandimento di zona in scatola.pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Preparazione di retina Coppe per elettroporazione. (A) Pulcino embrione a Hamburger e Hamilton fase embrionale 27. (B) La RPE viene accuratamente rimosso dagli occhi enucleati utilizzando pinzette Dumont taglienti. (C) La coppa retinica sulla destra è privo di RPE e pronto per l'elettroporazione. (D ) L'elettrodo catodo è posizionato all'interno di una camera di elettroporazione fatto di 1,5 ml provetta coperchio riempito con soluzione plasmide. La coppa retinica viene accuratamente trasferita nel catodo rivolto verso l'alto, e l'elettrodo anodo è posizionato sulla parte superiore, accanto all'obiettivo. Clicca qui per vedere una versione più grandedi questa figura.
Figura 3. Efficienza Transgene espressione in cellule in coltura dopo elettroporazione (A - C). Tazze retiniche sono stati elettroporate con un plasmide di espressione GFP, dissociato e coltivate per 4 giorni. Micrografie mostrano fluorescenza DAPI colorati nuclei (A) e che esprimono GFP cellule retiniche (B). Anti-Visinin anticorpi colorazione è stata eseguita per identificare le cellule fotorecettori (C). (D) Il grafico illustra l'efficienza di trasfezione raggiunto da ex ovo elettroporazione, rappresentato come la percentuale di GFP cellule che esprimono tra la popolazione cellulare totale (DAPI positiva), o tra il fotorecettore popolazione in particolare (Visinin positivo). Risultati rappresentano la media ± SEM di 5 esperimenti indipendenti. Barra di scala in
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Discussion
La fase più critica per il successo di questo protocollo è la selezione della fase appropriata degli embrioni. In pubblicazioni precedenti, una serie di stadi embrionali è dato per queste colture, tipicamente definito dai giorni di incubazione o embrionali giorni (ED); così è di solito presume che l'utilizzo ED 5 a ED 6 embrioni produrrà risultati equivalenti. Tuttavia abbiamo trovato che sulla fase 27 (ED 5), l'efficienza di trasfezione sarà circa il 22% della popolazione cellulare totale, come indicato in precedenza; ma l'efficienza diminuisce al 16% se si utilizza stadio 28 embrioni (ED 5,5), e al 12% nella fase 29 (ED 6) 1. Altri passaggi critici includono il mantenimento dello stato sterile durante tutto il processo; acquisire la necessaria manualità per evitare di danneggiare la retina durante la dissezione e elettroporazione; ed evitando spazi lunghi dal momento del prelievo degli embrioni al tempo della placcatura cellulare.
Un'altra considerazione importante per garantire una buona trasfezione efficienzecie è la concentrazione della soluzione plasmide contenente: la raccomandata 1,5 mg / mL concentrazione minima che abbiamo provato che non ha provocato una diminuzione dell'efficienza. Questa concentrazione si traduce in una elevata quantità di materiale plasmide se si considera che le tazze retiniche sono immersi in questa soluzione. Utilizzando la ben più piccola dimensione che ospiterà dell'occhio (ad esempio un coperchio provetta) può minimizzare questo problema. Inoltre, molti occhi possono essere elettroporate utilizzando la stessa soluzione; non abbiamo visto una riduzione di efficienza quando electroporating fino a 6 tazze retina consecutivamente nella stessa soluzione plasmide, e più potrebbe eventualmente essere eseguito, ma non siamo in grado di attestare la differenza in termini di efficienza da allora in poi.
Protocolli precedentemente pubblicati hanno tipicamente fornito bassa efficienza di trasferimento genico per questo tipo di coltura, e quindi spesso dovuto fare affidamento su tecniche che misurano il prodotto delle reazioni enzimatiche su una cella lysate per aumentare la sensibilità. Tale approccio ha lo svantaggio di non permettere per tipo cellulare discriminazione e di basarsi su un basso numero di cellule che sono responsabili del risultato osservato, che può non essere sempre riflettente del comportamento della popolazione cellulare più grande. Un altro modo per aggirare il problema della bassa efficienza è quello di eseguire gene trasfezione in vivo, prima di enucleazione dell'occhio e della cultura. Questo è un approccio praticabile ma di solito può essere applicato solo a specifici paradigmi sperimentali, in quanto sia l'elettroporazione plasmidi e virus RCA (un comune gene trasduzione vettore nel pulcino) normalmente devono essere eseguite nelle fasi precoci di sviluppo, la creazione di un intervallo di tempo tra trasfezione e cultura. Questa è una considerazione importante, perché durante tale intervallo di tempo le cellule sono esposti agli effetti sia microambiente extracellulare così come i fattori intracellulari, con implicazioni significative nell'interpretazione del exprisultati erimental. Al contrario, l'aumento sostanziale efficienza di trasferimento genico ottenuto con il metodo ex ovo elettroporazione consente lo studio della funzione genica in maniera cellule intrinseca. Inoltre, il vantaggio di questo alto tasso di trasfezione può essere ulteriormente aumentata quando usato in combinazione con high throughput analisi automatizzata cella 1.
Nelle fasi iniziali dello sviluppo di questa tecnica, abbiamo mantenuto elettroporate RPE-privo conchiglie oculari in coltura per 24 ore per valutare l'efficienza di elettroporazione ottenuto con diverse condizioni 1. Anche se non abbiamo tentato di cultura loro per il periodo di volte più lungo, la nostra esperienza indica che il protocollo qui descritto potrebbe essere applicato anche agli studi basandosi su espianti organotipiche retina, a condizione che siano utilizzate appropriate condizioni di coltura espianto-lungo termine.
Infine, sarebbe possibile estendere l'applicabilità di thè ex ovo approccio elettroporazione ad altri modelli animali. Per esempio nella nostra esperienza trasfezione di occhi di topo al giorno postnatale 1 o 4 usando questo protocollo dato qualitativamente buoni risultati in culture espianto, ma quando sono state tentate colture cellulari dissociate efficienza di trasfezione era dell'ordine del 6%, simile a quella di altre tecniche. Così, questa potrebbe essere una semplice alternativa ad altri protocolli per questo modello animale, ma avrebbe bisogno di essere ottimizzato per il sistema particolare se sono richieste elevate efficienze. Da notare, come detto sopra, stadio embrionale al momento della elettroporazione è stato fondamentale per l'esito alta efficienza ottenuta nel pulcino, quindi questo parametro deve essere considerato quando si applica la tecnica ad altri modelli accuratamente.
In conclusione, l'ex ovo tecnica elettroporazione può espandere l'applicabilità dei sistemi retiniche in vitro come potenti strumenti per completare gli studi in vivo, che offre new possibilità per la ricerca della retina.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco - Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1x2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width |
References
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