טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Introduction

ניתן לסווג קווי תאי יונקים לאחת משלוש קטגוריות המבוססות על המאפיינים שלהם צמיחה: תאים שגדלים בהשעיה, תאים שגדלים כאגרגטים, ותאים שגדלים מעוגן למצע. למרות bioreactor אוויר הגלגל הפגין בסרט הזה הוא מסוגל לגדול כל שלושת סוגים של תאים, בסרטון זה ידגים שימוש בbioreactor לגדל תאים תלויים מעגן במייקרו ספקים. תאי יונקים תלויים Anchorage ניתן לגדל לצורך הפקת תאים נוספים - שבו התאים עצמם הם התוצר. לדוגמא, תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר אנושי נמצאים בשלבים טיפחו במטרה לקצור את התאים והזרקה אותם לרקמה חולה. Bioreactor פנאומטי הפגין בסרט הזה הוכיח מתאים לייצור תאי גזע mesenchymal כזה עבור יישום זה (Serra et al., תקשורת אישית, 2013).

dep Anchorageתאי יונקים endent בדרך כלל גדלים בקנה מידה קטנה בכלי תרבות 2D כגון צלחות תרבית תאים, צלוחיות תרבית תאים, או בקבוקי רולר, שבו הם לדבוק משטח צמיחת טיפול מיוחד ^1. כאשר יותר תאים רצויים, ניתן להרחיב את הצלחות או צלוחיות באמצעות יותר או גדולים יותר כלים. עם זאת, לגידול חסכוני יותר של כמויות גדולות של תאים תלויים מעגן, הגדלת שטח הפנים להתקשרות סלולארי ניתן להשיג על ידי שימוש בחרוזים מוצקים קטנים בשם מיקרו ספקים. בהתאם למאפייני ההתקשרות של התא, כמה סוגים שונים של מיקרו-נשאים זמינים מסחרי, כגון dextran, פפטיד, או קולגן מצופה. יש לי מייקר נשאים שטח פנים גדול יחס נפח מתן שטח פנים גדול יותר לצמיחת תאים; ויכולים להישמר מיקרו ספקים בהשעיה עם תסיסה, המאפשרת לתאים להיות מעובדות לצפיפויות גבוהות במערכות bioreactor ^2. נכון לעכשיו, את סוגי bioreactors בי תאים חסיד גדלים על מיקרו-נשאים כוללים צלוחיות טווה ומערכות טנק עוררו, אשר משתמשות במדחפים צירי כדי לשמור על השעיה של מיקרו-נשאי התא מצופה.

מספר גורמים חשובים לגידול המוצלח של תאים כולל מתח חמצן, מאמץ גזירה, מטריצת פני השטח, ומזין וריכוזי המטבוליט. השימוש בbioreactors מאפשר ניטור בזמן אמת של תנאי גידול ואת הפוטנציאל לעלויות ייצור נמוך באופן משמעותי ^1. ישנם מספר עיצובי bioreactor הנפוץ לגידול במבחנה תא כולל, השעיה עוררה, קיר כלי מסתובב, חלולים סיבים, bioreactor תיק על פלטפורמת נדנדה, ומערכות מיטה מרחפות ^3. רבות ממערכות אלה להציג את הבעיות ייחודיות לטיפוח תא ואת קנה המידה -up, כגון עלות גבוהה, שיפועי ריכוז חומרי תזונה, גזירה הידרודינמית, צבירת תא, וקושי בדגימה, ניטור, וcel שליטהבהיקף של עד ליטר.

שורות תאים חסיד שונות המשמשות בייצור של וירוסים, או בייצור של חיסונים נגיפיים או לייצור של וקטורים ויראליים ליישומי ריפוי גנטי. בסרטון הזה, באמצעות פנאומטי ליחד המערכת (Air-Wheel) bioreactor, אנחנו מדגימים את התרבות של תאים אנושיים קרצינומה של ריאה (A549) תאים על מיקרו-נשאים לייצור של אדנווירוס oncolytic. עיצוב bioreactor פנאומטי משתמש בגלגל תסיסה אנכי המופעל על ידי כוח העילוי של גז sparged לתוך החלק התחתון של bioreactor. שיטת ערבוב עדינה זה מגבילה כוחות גזירה הידרודינמית, אבל עדיין מבטיחה בינוני ותא אופטימליים ערבוב ^4. בהשוואה לכור הטנק עורר, יש כור פנאומטי מתח קיר גזירה נמוך אפילו עם מערכות בנפח גבוה bioreactor Air-הגלגל (איור 1). בניגוד לbioreactors טנק עורר, המאיץ האנכי של כור ליחד זו מופעל על ידי זרם של בועות גז בתוךהכלי, המאפשר לערבוב עדין ואחיד בינוני (איור 2).

Protocol

.1 כניסה

1. שלטון את Bioreactor. לחץ בכל מקום כדי לפתוח את דף הכניסה. בחר שם משתמש והזן את הסיסמה ולחץ על "כניסה".

.2 כיול

1. לכייל חיישן pH (2 נקודות לפני מעוקר).
2. בדוק חיישן pH ולאשר קצה חיישן מלא בתמיסת אלקטרוליט. הכן שתי כוסות עם פתרונות כיול pH (אלקטרוליט) pH 4 וpH 7 ויש לי בקבוק לשטוף זמין במים מזוקקים.
3. חבר את כבל pH לחיישן pH. נווט אל "פעולות" הכרטיסייה על הממשק שלום ולחץ על "לכייל". הזן טמפרטורת חיץ בתחום טמפ פתרון כיול.
4. הנח חיישן pH במאגר 1 (pH 4) ולהזין ערך בשדה "אפס". חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על כפתור "לכייל 1". יש לשטוף את חיישן pH במים מזוקקים.
5. חיישן מקום במאגר 2 (pH 7). הזן חיץ2 ערך בשדה "תוחלת". חכה לגרף כדי לייצב ולחץ לכייל 2 כפתור.
6. לחץ על "שמור" לאחר מכן לחץ על "סגור".
7. כייל את חיישן חמצן המומס (DO).
8. ודא חיישן DO כבר מקוטב על ידי להיות מחובר למערכת במשך כמה שעות. נווט אל "פעולות" הכרטיסייה על הממשק שלום ולחצו לכייל. לחץ על כפתור ה "DO".
9. נתק את חיישן DO והזן 0 בשדה "אפס". חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על הלחצן "כיול 1".
10. חבר מחדש את חיישן DO ולהיכנס 100 בשדה "הטווח". חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על הלחצן "כיול 2".
11. לחץ על "שמור" לאחר מכן לחץ על "סגור".

חיישני .3 החיטוי ולהתקין וכלי שייט מגיב

1. לאחר כיול, חיישני מקום וגם תרמית בautocשקיות לרחוץ וחיטוי ל30 דקות ב121 מעלות צלזיוס, 15 psi.
2. לטהר שקיות החיטוי עם 70% איזופרופיל אלכוהול (IPA) ושקיות העברה לארון בטיחות ביולוגית (BSC). הסר אריזה חיצונית של כלי שיט.
3. לטהר אריזה פנימית עם 70% IPA ולהעביר כלי לארון ביולוגי בטיחות (BSC). הסר אריזה פנימית ולבדוק את הכלי וצינור לנזקים הנגרמים במהלך משלוח.
4. התקן את pH ולעשות חיישנים בשתי יציאות הקדמיות. התקן את גם התרמית ליציאה אחורית השמאלית. פתח את מכסה החיישן.
5. מדריך החיישן דרך יציאת החיישן. השחל את החיישן בחוזקה ליציאה.
6. העבר את הכלי מתוך BSC.
7. לתלות DO וכבלי חיישן pH מחוץ לשרוול הכלי ולבדוק ששום דבר לא בשרוול. חלק את הכלי לתוך השרוול, רגליים הראשונות.
8. להתאים בזהירות את חיישן הטמפרטורה לתוך באר תרמית הכלי. ודא שהחלק התחתון של הכלי מונח כנגד חימום.
9. הסרצינורות סטים התיקים שלהם. קידוד צבע התאמה בצינורות למחברים המתאימים והמשאבות ביחידת בקרת bioreactor.
10. התקן את קו הגז הראשי על ידי לחיצה על המחבר לשקע הגז שלה. התקן את קו גז מיקרו על ידי סיבוב בכיוון השעון המחבר לשקע גז. התקן את צינורות מסנן פליטה:
11. לפתוח את תנור המסנן. אבטח את מסנן הפליטה על U-הערוץ כל כך צינורות שלה עוברים דרך שני הווים למסנן ויוצא מהתנור.
12. התקן את צינורות על ידי שקית הקבל בבעל צינורות. סגור את הדלת.
13. קווי מסלול בנוסף וB, שניהם קווי התקשורת, ואת קו הקציר מאחורי חיישן DO ועל הספסל בסמוך ליחידת בקרת bioreactor.
14. חבר את הכבלים לחיישני DO וpH.

.4 בינוניים ומיקרו ספקים הוספה

1. נווט אל הכרטיסייה "פעולות" ולחץ על "בקרת משאבות" על ממשק המחשב.
2. טופס Steriחיבור le בין שורה שאינו בשימוש בינונית בנוסף (להקה כתומה 1) ומקור בקבוק / שקית הבינוני על ידי ריתוך צינורות או באמצעות אבזרי Luer.
3. לחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת התקשורת ב. לחץ על המחוון להפוך את התקשורת לשאוב את הסכום לאחר תוספת הרצויה של מדיום.
4. הנח חרוזים microcarrier בCa ^{2 +,} Mg ^{2 +} PBS ללא תשלום עבור 3 שעות ב RT.
5. לשטוף חרוזים כמה פעמים עם Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} PBS חופשי.
6. החיטוי במשך 15 דקות ב 115 ° C, 15 psi.
   הערה: הוסף L 3 גר '/ (משקל יבש) בניסוי זה.
7. משאבה במייקרו ספקים כי כבר התייבשות, שטף וautoclaved לכור באותו אופן בינוני נוספה בשלב 4.1.

.5 איזון ואחת נקודות DO כיול

1. הגדר את הבקרים לאוטומטיים ולהיכנס לsetpoints הרצוי. כאן, להשתמש בתסיסת הסט פוינט (SP) = 15 סל"ד, SP טמפרטורה = 37.0 ° C, pH = 7.2, DO = 100%. חכה לעמarameters לאזן.
2. לאשר חיישן הוא מקוטב באופן מלא. אשר ערך הנוכחי DO התייצב.
3. נווט אל הכרטיסייה "פעולות" ולחץ על "לכייל". לחץ על "DO", לחץ על "אחת נקודות".
4. הזן '100' בשדה "הטווח". לחץ על הכפתור "כיול 1", לחץ על "שמור" ולחץ על "קרוב":

.6 החל לרוץ

1. נווט אל כרטיסיית פעולות. לחץ על "אצווה". השתמש במקלדת שעל מסך או מקלדת חיצונית יש להזין שם אצווה 16 תווים או פחות.
2. לחץ על לחצן "הסתר" של המקלדת שעל מסך. לחץ על "התחילו אצווה" לאשר על ידי לחיצה על "התחל" בכיסוי.

.7 לחסן עם תאים

1. ליצור קשר סטרילי בין שורה בנוסף בינונית שאינו בשימוש (להקה כתומה 1) ובקבוק תא / מקור שקית על ידי ריתוךצינורות או שימוש באבזרי Luer.
2. התקן את סעיף סיליקון של צינורות במשאבת התקשורת כל כך נקודות החץ לכיוון הצינור בין המשאבה וכלי השיט.
3. בדקו מהדק צינורות פתוח ומהדק צינורות מסועף שלה סגור. לחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת תקשורת ובלחץ על "כבוי" לאחר הוספת תאים.
4. נווט אל הכרטיסייה "פעולות" ולחץ על "משאבות בקרה".

.8 דגימה

1. לאחר לחסן ובתדירות גבוהה ככל רצוי כדי לפקח על התרבות, לצייר מדגם מהתרבות באופן הבא:
2. נווט אל הכרטיסייה "פעולות" ולחץ על "לקחת דגימה". הנח את צינור הדגימה במשאבת הדגימה ולתפעל את ברזלים דגימה על פי ההוראות שעל מסך.
3. לבצע לפחות תצפית יומית מיקרוסקופית וספירת תאים בדגימות אלה.
4. כאשר התאים הגיעו הצפיפות הרצויה, בג זהASE 1.2 x 10 ⁶ תאים / מ"ל, להדביק את התאים עם התוספת של הבידוד נגיף.
5. הסביבה נקיה מהחיידקים להוסיף הבידוד למזרק 20 מ"ל, ולחבר את המזרק לאחת מהיציאות בנוסף החילוף בכור. להציג את הבידוד לכור על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.
6. המשך דגימה וניתוח התרבות לריכוז החלקיקים תאיים אדנווירוס.

Representative Results

באיור 3, הפרמטרים לייזום של ריצת bioreactor מוצגים. נתון זה מראה את המסך לפני קביעת הפרמטרים של טמפרטורה, חמצן מומס, pH ותסיסה. ברגע שהפרמטרים מוגדרים, הפרמטרים הריצה ברציפות במעקב והתאמות יכולות להתבצע כדי לשמור על התנאים הנדרשים. התוכנה מייצרת קריאה רציפה המאפשרת זיהוי קל של בעיות. בניסוי זה באמצעות 2.5 L של DMEM מכיל 10% FBS, 250 ppm של C SAFC אנטי קצף, L-גלוטמין 2 מ"מ ו3 גר '/ L של מיקרו ספקים, המערכת התייצבה ולכן חמצן אחוזים הוא 50%, טמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס, וpH הוא 7.2. הכור מחוסן עם תאי A549 בריכוז של 7 x 10 ⁴ תאים / מ"ל (או 10 תאים / מיקרו מוביל). הפרמטרים שנבחרו לריצה זו הביאו ברוב המכריע של תאי שמירה על מיקרו-נושאות בתוך שעה 2 (איור 4). לאחר שעה 12, תאי שדיםסימני trating של השטחה ומתפשט על פני השטח מיקרו מוביל (איור 5). על ידי 24 שעות, יש לי מייקר ספקים אפילו יחסית חלוקת תאים, ללא מיקרו ספקים ללא תאים וללא גושים גדולים של תאים על מיקרו-הנשאים (איור 6). אחוז של קולוניזציה מיקרו מוביל על ידי תאי A549 הוא 75% על ידי 24 שעות ו90% לאחריו (איור 7). התאים ממשיכים לגדול באופן אקספוננציאלי ל~ 1 מיליון תאים / מ"ל לאחר 48 שעה (איור 8). לאחר הדבקה על ידי מינון של אדנווירוס oncolytic (2 x 10 ⁸ מ"ל / virions) בשעה 50 שעה, הצפיפות מוגברת ל1.2 מיליון תאים / מ"ל ולאחר מכן החלה לרדת כזיהום ממס התקדם. הייתה ~ 10,000 הגברה חיק הבידוד הנגיפי.

בניסויים קודמים, שמצאנו כי הניטור והתאמת זרימת גז היא קריטי למקסם את צמיחת תאים (נתונים שלא פורסמו). במהירות תאי גידול יכולים לרוקן את המערכת של חמצן עם רמת DO יורדת לאפס. בעוד התאים המשיכו לגדול, זה היה בקצב הרבה יותר איטי. זה קריטי כדי לפקח ולכוון את זרימת החמצן כדי לעמוד בדרישות של התאים בשלב צמיחת לוגריתמים. כל ריצה ניתן לנתח לצמיחה אופטימלית על ידי השוואת pH, DO, וטמפרטורה עם ספירת תאים יומית.

איור 1 דינמיקת נוזלים של המערכה bioreactor פנאומטיים (PBS) בהשוואה לbioreactor טנק סטירר מדידת כוחות גזירת קיר בהיקפי כור שונים.

איור 2 מאיץ כור פניאומטיים אוויר גלגל.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
איור 3 צילום מסך תוכנת פניאומטיים אוויר גלגל הפרמטרים ליזום ריצת bioreactor.

.4 קולוניזציה איור מיקרו מוביל עם תאי A549 לאחר חיסון 2 שעות. (קוטר מיקרו מוביל הממוצע ~ 180 מיקרומטר.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 שעות 12 לאחר תחילתה של התרבות, תאי A549 מצרפים, השטחה, ומתפשטים על מיקרו ספקים."Target =" 5highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 מיקרו ספקים מצופים בתאים לאחר 24 שעות בתרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אחוז .7 איור של קולוניזציה מיקרו מוביל על ידי תאי A549 חיסון הודעה.

איור 8 מספר תאי A549 קיימא בטרום תרבות ולאחר זיהום עם adenovirשלנו. שים לב שצעד זיהום ויראלי התרחש ב50 שעה.

Discussion

מערכת bioreactor שימוש יחיד זה היא יחסית פשוטה לשימוש ומספקת ניתוח בזמן אמת לניטור כור וניתוח. הוא מאוד מתאים גם לתרבית תאים של יונקים וחרקים עם צפיפות תאים מגיעה ליותר מ 30 מיליון תאים / מ"ל. חוץ תאי A549 מתוארים בדוח זה ^11, יש לנו גדלתי SF-9 תאי חרקים בbioreactor גם כן. הערבוב העדין הניתן על ידי גלגל אוויר פנאומטי מפחית נזק לתאים. כמה צעדים הם קריטיים בעת הגדרת כור זה. הכיול הראשון, נכון של pH ולעשות חיישנים חשוב לניטור אופטימלי של התרבות ולתוספת של חומרים כימיים כדי להתאים את pH או החמצן במערכת. שנית, הבקבוקים מגיב וזרע חייבים להיות מלאים ואת הקבצים המצורפים luer שנעשו בסביבת סטרילית, כגון BSC. ברגע שהבקבוקים מגיב מועברים אל מחוץ לסביבת סטרילית, החיבורים לקווי הזנת bioreactor חייבים להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.

מערכת bioreactor פנאומטי ליחד יש פוטנציאל לפגוש רב של המחקר ויישומים קליניים בתחומי יות'רפיוטיקס, חיסונים, תאי גזע, ורפואה אישית ^4. בנוסף, הגמישות של מערכת זו מאפשרת לתצווי, Fed-אצווה, זלוף, ויישומי bioreactor Transfection מבוסס ^5. לבסוף, יש לי מערכות bioreactor חד פעמיות לשימוש חד פעמי אין הסופיותTial כדי לענות על הצרכים של ייצור תעשייתי בקנה מידה גדולה ולדבוק בהנחיות והמלצות של גופי רגולטורים לאומיים ובינלאומיים ^6-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011