Dyrking av pattedyrceller med en enkelt-bruk Pneumatisk Bioreaktor System

Introduction

Pattedyrceller linjer kan klassifiseres i en av tre kategorier basert på deres vekstegenskaper: celler som vokser i suspensjon, celler som vokser som aggregater, og celler som vokser forankret til et substrat. Selv om luft-hjulet bioreaktor demonstrert i denne video er i stand til å vokse alle tre typer celler, vil dette video demonstrere bruken av bioreaktoren å dyrke forankringsavhengige celler på mikrobærerne. Forankringsavhengige pattedyrceller kan bli dyrket for det formål å produsere flere celler - hvor cellene selv er produktet. For eksempel er human benmarg avledet mesenchymale stamceller tiden blir dyrket med det formål å høste cellene og å injisere dem inn i sykt vev. Den pneumatiske bioreaktor demonstrert i videoen har vist seg egnet for fremstilling av slike stamceller for denne anvendelse (Serra et al. Personlig kommunikasjon 2013).

Anchorage dependent pattedyrceller er vanligvis vokst liten skala i 2D kultur fartøy som cellekultur plater, cellekulturflasker, eller roller flasker, hvor de holder seg til et spesielt behandlet vekst overflate ^1. Når flere celler er ønsket, kan de plater eller kolber bli utvidet ved å bruke flere eller større fartøyer. Imidlertid, for en mer kostnadseffektiv dyrking av store mengder av forankringsavhengige celler, noe som øker overflatearealet for cellebinding kan oppnås ved hjelp av små faste perler kalt mikro-bærere. Avhengig av festeegenskaper i cellen, flere forskjellige typer av mikro-bærere er kommersielt tilgjengelige, for eksempel dekstran, peptid, eller kollagen belagt. Mikro-bærere har et stort overflateareal til volum-forhold som gir et større areal for cellevekst; og mikro-bærere kan holdes i suspensjon under omrøring, noe som gjør det mulig for cellene å bli dyrket til høy tetthet i reaktorsystemer ^{med 2.} Foreløpig hvilke typer bioreactors hvor adherente celler blir dyrket på mikro-bærere inkluderer spinnerflasker og omrørt tanksystemer, som bruker aksiale impellere for å opprettholde suspensjonen av celle belagte mikrobærere.

Flere faktorer er viktige for den vellykkede dyrking av celler, inkludert oksygenspenning, skjærspenning, overflate matrise, og næringsstoffet og metabolittkonsentrasjoner. Bruken av bioreaktorer muliggjør sanntids overvåkning av vekstbetingelser, og potensial til å betydelig lavere produksjonskostnader ^en. Det er flere vanlige reaktordesign for in vitro celledyrking inkludert, omrørt suspensjon, roterende vegg fartøy, hul-fiber, pose bioreaktor på en vippeplattform, og fluidiserte sjiktsystemer ^tre. Mange av disse systemene presentere unike problemer for celledyrking og skalere-opp, slik som høye kostnader, nærings konsentrasjonsgradienter, hydrodynamisk skjær, celle aggregering, og vanskeligheter med prøvetaking, overvåking og kontroll av cell oppskalering.

Forskjellige adherente cellelinjer blir brukt i produksjon av virus, enten ved produksjon av virale vaksiner eller for produksjon av virale vektorer for genterapi anvendelser. I denne videoen bruker engangsbruk pneumatisk (Air-Wheel) bioreaktor system, vi demonstrere kultur av menneskelige lungekarsinom celler (A549) celler på mikro-bærere for produksjon av en onkolytisk adenovirus. Den pneumatiske bioreaktor utforming benytter en vertikal omrøring hjul som er drevet av oppdriften av gass boblet inn i bunnen av bioreaktoren. Dette forsiktig omrøring metoden begrenser hydrodynamiske skjærkrefter, men likevel sikrer optimal medium og celle blande ^fire. I forhold til den omrørte tankreaktor, har det pneumatiske reaktoren lav veggskjærspenning selv ved høyt volum Lufthjulreaktorsystem (figur 1). I motsetning til rørt tank bioreaktorer, er den vertikale løpehjul av denne engangsbruk reaktoren slått av en strøm av gassbobler innenforfartøyet, noe som gir en skånsom og jevn middels blande (figur 2).

Protocol

1. Logg inn

1. Slå på bioreaktor. Klikk hvor som helst for å åpne påloggingssiden. Velg brukernavn og skriv inn passord og klikk "Logg inn".

2. Kalibrering

1. Kalibrere pH sensor (2 poeng før autoklavering).
2. Kontroller pH-sensoren og bekrefter sensor spissen er fylt med elektrolyttløsning. Forbered to begre med løsninger pH kalibrerings (elektrolytt) pH 4 og pH 7, og har tilgjengelig en vaskeflaske med destillert vann.
3. Koble pH kabelen til pH-sensor. Naviger til "Handlinger" tappen på Hei-grensesnittet, og klikk "kalibrere". Skriv inn buffer temperatur i kalibreringsløsningen Temp-feltet.
4. Plasser pH-sensoren i en buffer (pH 4), og angi verdien i "null"-feltet. Vent på grafen for å stabilisere og klikk på "kalibrere en" knappen. Skyll pH-sensoren med destillert vann.
5. Plass-sensor i buffer 2 (pH 7). Skriv inn buffer2 verdi i "span" feltet. Vent på grafen for å stabilisere og klikk kalibrere 2-knappen.
6. Klikk "Lagre" og klikk "Lukk".
7. Kalibrere oppløst oksygen (DO) sensor.
8. Pass på at sensoren har blitt polarisert ved å være koblet til systemet i flere timer. Naviger til "Handlinger" tappen på Hei grensesnitt og klikk kalibrere. Klikk på "gjøre en" knappen.
9. Koble fra sensoren og skriv 0 i "null"-feltet. Vent på grafen for å stabilisere og klikk på "Calibrate 1" knappen.
10. Koble til oksygensensoren og skriv 100 i "Span" feltet. Vent på grafen for å stabilisere og klikk på "Calibrate to" knappen.
11. Klikk "Lagre" og klikk "close".

3. autoklavoverganger og installere sensorer og reagenser Vessels

1. Etter kalibrering sensorene og termisk godt i autocLave poser og autoklav i 30 min ved 121 ° C, 15 psi.
2. Hygienisk autoklav poser med 70% isopropylalkohol (IPA) og overføre poser til biologisk sikkerhetskabinett (BSC). Fjern ytre emballasje av fartøyet.
3. Rense inneremballasje med 70% IPA og overføre fartøy til biologisk sikkerhetskabinett (BSC). Fjern inneremballasje og inspisere fartøyet og slangen for skader påført under transport.
4. Installer pH og DO sensorer i de to foran portene. Installer den termiske godt til venstre back port. Åpne sensoren cap.
5. Guide sensoren gjennom følerporten. Tråd sensoren tett i porten.
6. Overfør fartøy av BSC.
7. Heng DO og pH sensorkablene utenfor fartøyet ermet og sjekke at ingenting er i ermet. Skyv beholderen inn i hylsen, med føttene først.
8. Passer nøye temperatursensoren inn i karet termisk godt. Påse at bunnen av beholderen hviler mot varmeelementene.
9. Fjernslangen setter fra sine poser. Match fargekoding på slangen til de tilsvarende kontaktene og pumpene på bioreaktor kontrollenhet.
10. Installer hovedgassledningen ved å trykke på kontakten inn sin gass stikkontakt. Installer mikrogassledningen ved å vri kontakten med klokken inn i gassuttaket. Eksos filter slangen:
11. Åpne filter ovnen. Fest utblåsningsfilteret på U-kanal så det slangen går gjennom de to kroker til filteret og ut av ovnen.
12. Sett på slangen ved kondensatoren pose i rørholderen. Lukk døren.
13. Rute tillegg linjer A og B, begge medielinjer, og innhøstingen linje bak oksygensensoren og ned på benken ved siden av bioreaktor kontrollen.
14. Koble kablene til de gjør og pH-sensorer.

4. Legge Medium og Micro-bærere

1. Naviger til "handlinger" og klikk "Control Pumper" på datamaskin-grensesnitt.
2. Form en sterile forbindelse mellom en ubrukt medium tillegg linje (1 oransje bånd) og mediet flaske / pose kilde ved sveising av rør, eller ved hjelp av Luer-fittings.
3. Klikk på glidebryteren for å slå på mediepumpen på. Klikk på glidebryteren for å slå media pump opp etter tillegg ønsket mengde medium.
4. Plasser Microcarrier perler i Ca ^{2 +, 2 +} Mg fri PBS i 3 timer ved romtemperatur.
5. Vasking av perler flere ganger med Ca ^{2 +, 2 +} Mg-fri PBS.
6. Autoklaver i 15 min ved 115 ° C, 15 psi.
   MERK: Tilsett 3 g / l (tørrvekt) i dette eksperimentet.
7. Pumpe i mikro-bærere som er blitt hydrert, vasket og autoklaveres i reaktoren på samme måte som mediet ble tilsatt i trinn 4.1.

5. Ekvilibrering og One-point Oksygenkalibreringen

1. Sett kontrollerne til Auto og angi de ønskede punktene. Her bruker Uro Set Point (SP) = 15 rpm, Temperatur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Vent til parameters å stabilisere seg.
2. Bekreft sensor er fullt polarisert. Bekreft DO nåverdi har stabilisert seg.
3. Naviger til "Handlinger" og klikk "kalibrere". Klikk "DO A", klikk på "One-point".
4. Skriv inn "100" i "Span" feltet. Klikk på "Calibrate 1"-knappen, klikk "Lagre" og klikk "close":

6. Starte en Run

1. Naviger til kategorien Handlinger. Klikk "Batch". Bruk tastaturet på skjermen eller et eksternt tastatur å skrive inn en batch navn 16 tegn eller mindre.
2. Klikk på tastaturet på skjermen er "Skjul" knappen. Klikk på "Start batch" bekreft ved å klikke på "Start" i overlegget.

7. Inokuler med Cells

1. Danne en steril forbindelse mellom en ubrukt medium tillegg linje (1 oransje bånd) og cellen flaske / pose kilde ved sveisingslangen eller ved hjelp av Luer beslag.
2. Installer silikon delen av slangen i media pumpe slik at pilen peker mot slangen mellom pumpen og fartøy.
3. Kontroller tubing klemmen er åpen, og dens forgrenet rør klemmen er lukket. Klikk på glidebryteren for å slå media pumpen på og klikk på "Av" etter å ha lagt celler.
4. Naviger til "Handlinger" og klikk "Control Pumper".

8. Prøvetaking

1. Etter inokulering og så ofte som ønskelig for å overvåke kultur, trekke en prøve fra en kultur på følgende måte:
2. Naviger til "handlinger" og klikk "ta sample". Plasser prøvetakingsslangen i prøvetakingspumpen og manipulere prøvetaking stoppekranen i henhold til instruksjonene på skjermen.
3. Utføre minst en daglig mikroskopisk observasjon og celletall på disse prøvene.
4. Når cellene har nådd den ønskede tetthet, i dette case 1.2 x 10 ⁶ celler / ml, infisere cellene med tilsetning av et virus inoculum.
5. Tilsett inokulum aseptisk til en 20 ml sprøyte, og koble sprøyten til en av reservedeler tilsetnings portene på reaktoren. Introduser inokulum til reaktoren ved å trykke på sprøytens stempel.
6. Fortsett prøvetaking og analysering av kulturen for adenovirus intracellulær partikkelkonsentrasjon.

Representative Results

I figur 3, er parametrene for igangsetting av bioreaktoren drevet vist. Denne figuren viser skjermen før parametrisering av temperatur, oppløst oksygen, pH og omrøring. Når parametere er satt, blir kjøreparametere overvåkes kontinuerlig og justeringer kan gjøres for å opprettholde de fastsatte krav. Programvaren gir en kontinuerlig avlesning som gir mulighet for enkel identifisering av problemer. I dette eksperimentet med 2,5 L av DMEM inneholdende 10% FBS, 250 ppm av SAFC Anti-skum C, 2 mm L-glutamin og 3 g / l av mikro-bærere, er systemet stabilisert slik at den prosent oksygen er 50%, temperaturen er 37 ° C, og pH er 7,2. Reaktoren blir inokulert med A549-celler i en konsentrasjon på 7 x 10 ⁴ celler / ml (eller 10 celler / mikro-bærer). Parametrene som er valgt for dette forsøk resulterte i de fleste av cellene fester seg til mikro-bærere i løpet av 2 timer (figur 4). Etter 12 timer, cellene er demonertrating flatet og sprer seg på mikro-bæreroverflate (figur 5). Ved 24 timer, mikro-bærere har en relativt jevn fordeling av cellene, uten mikrobærere uten celler og ingen store klumper av celler på mikrobærere (figur 6). Prosentandelen av mikrobæreren kolonisering av A549-celler er 75% etter 24 timer og 90% etter dette (figur 7). Cellene fortsatte å vokse eksponensielt til ~ 1 million celler / ml etter 48 timer (figur 8). Etter infeksjon med en dose på onkolytisk adenovirus (2 x 10 ⁸ virioner / ml) ved 50-timers økte tettheten til 1,2 millioner celler / ml og deretter begynte å avta etter hvert som den lytisk infeksjon forløp. Det var ~ 10.000 ganger amplifikasjon av det virale inokulum.

I tidligere forsøk, er det funnet at å overvåke og justere gasstrømmen er kritisk for å maksimere cellevekst (upubliserte data). Raskt voksende celler kan tømme systemet for oksygen med DO nivået synker til null. Mens cellene fortsatte å vokse, og det var ved en mye langsommere hastighet. Det er viktig å overvåke og justere oksygenstrømmen for å tilfredsstille kravene til celle under den logaritmiske vekstfase. Hvert løp kan bli analysert for optimal vekst ved å sammenligne pH, DO, og temperaturen med daglige celletall.

Figur 1. Fluid dynamikk Pneumatisk Bioreactor System (PBS) sammenlignet med en rører tank bioreaktor måle veggskjærkrefter på ulike reaktorvolum.

Figur 2. Pneumatisk Air-Wheel reaktoren impeller.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Pneumatisk Air Wheel programvare skjermbilde av parametere for å starte bioreaktor løp.

Figur 4. Micro-carrier kolonisering med A549 celler 2 hr innlegg inokulasjon. (Gjennomsnittlig mikro-carrier diameter ~ 180 mikrometer.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. 12 timer etter initiering av kulturen, er A549 cellene feste, oppretting, og sprer seg ut mot mikro-bærere.5highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Micro-bærere belagt med celler etter 24 timer på kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Andel av mikro-carrier kolonisering av A549 celler etter inokulasjon.

Figur 8. Antallet levedyktige A549-celler i kultur før og etter infeksjon med adenoviross. Merk at virusinfeksjon trinn skjedde ved 50 timer.

Discussion

Denne engangs bioreaktor systemet er relativt enkelt å bruke og gir real-time analytics for reaktoren overvåking og analyse. Det er svært godt egnet for pattedyr og insektcellekultur med celletetthet når over 30 millioner celler / ml. I tillegg til A549-celler som er beskrevet i denne rapporten ^11, har vi vokst SF-9 insektceller i bioreaktoren i tillegg. Den forsiktig blanding levert av den pneumatiske lufthjulet reduserer celleskade. Flere trinn er kritisk når du setter opp denne reaktoren. Først, riktig kalibrering av pH og DO sensorer er viktig for optimal overvåking av kulturen og for tilsetning av reagenser for å justere pH eller oksygen i systemet. For det andre må de reagens-og sette flaskene fylles, og luer-vedlegg laget i et sterilt miljø, for eksempel en BSC. Når reagensflaskene er flyttet ut av sterilt miljø, må forbindelsene til bioreaktor fôringslinjer gjøres med forsiktighet for å unngå mikrobiell forurensning.

Singelen bruk pneumatisk bioreaktor systemet har potensial til å møte mange av forskning og kliniske applikasjoner innenfor områdene biotherapeutics, vaksiner, stamceller, og personlig medisin ^4. I tillegg gjør fleksibiliteten i dette systemet for Batch, Fed-batch, Perfusjons, og Transfeksjonspartikler Transfeksjonspartikler basert reaktorprogrammer ^fem. Endelig engangs disponibel bioreaktorsystemer har potensialTial å møte behovene til storskala industriell produksjon og til å følge retningslinjer og anbefalinger fra nasjonale og internasjonale reguleringsorganer ^6-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011