Introduction
Клетки млекопитающих линии могут быть отнесены к одной из трех категорий в зависимости от их характеристик роста: клетки, которые растут в суспензии, клеток, которые растут в виде агрегатов, а клетки, которые растут на якорь на подложку. Хотя воздух колеса биореактор показано в этом видео может расти все три типа клеток, это видео будет продемонстрировать использование биореактора для выращивания фиксационно-зависимых клеток на микро-носителей. Анкоридж зависимые клетки млекопитающих могут быть выращены с целью производить больше клеток - когда сами клетки являются продуктом. Например, костного мозга человека мезенхимальных стволовых клеток в настоящее время культивируют с целью сбора клеток и их инжекции в пораженной ткани. Пневматическая биореактор показано в этом видео доказала подходит для производства таких мезенхимальных стволовых клеток для этого приложения (Серра и соавт., Частное сообщение, 2013).
Анкоридж DEPendent клетки млекопитающих обычно выращиваются небольшой масштаб в 2D сосудов для культивирования таких как культуры клеток пластин, культуры клеток колбах или роллер-флаконах, где они придерживаются специально обработанной поверхности роста 1. При более ячеек желательно, пластины или колбы могут быть расширены с помощью более или большие суда. Тем не менее, для более экономичного выращивания больших количеств крепления зависимых клеток, увеличивая площадь поверхности для крепления сотового может быть достигнуто с помощью небольших твердых бусин называемые микро-носители. В зависимости от характеристик прикрепления клетки, несколько различных типов микро-носителей являются коммерчески доступными, например, декстран, пептид, или коллаген покрытием. Микро-носители имеют большую площадь поверхности к объему, обеспечивающей большую площадь поверхности для роста клеток; и микро-носители могут быть сохранены в виде суспензии при перемешивании, что позволяет клеткам культивироваться до высоких плотностей в биореакторе систем 2. В настоящее время, виды bioreactors где прикрепленные клетки, выращенные на микро-носителей включают вращающихся колбах и перемешивают нефтехранилище, которые используют осевые рабочие колеса для поддержания суспензии клеток покрытием микро-носителей.
Несколько факторы важны для успешного выращивания клеток, включая напряжения кислорода, напряжение сдвига, поверхности матрицы, и питательных веществ и метаболитов концентрациях. Использование биореакторов позволяет контролировать в режиме реального времени в условиях роста и потенциал для значительного снижения производственных затрат 1. Есть несколько проектов общей биореактор для выращивания в пробирке клеток в том числе, перемешивают суспензию, вращающейся стенки сосуда, полого волокна, мешок биореакторе на рокера платформы, и системах с кипящим слоем 3. Многие из этих систем представляют уникальные проблемы для выращивания клеток и масштабировать посуды, такие как высокая стоимость, питательных градиентов концентрации, гидродинамического сдвига, агрегации клеток, а также трудности в отборе проб, мониторинга и контрольного сотовыхл масштаб деятельности.
Различные клеточные линии, прилипшие используются в производстве вирусов, либо в производстве вирусных вакцин или для производства вирусных векторов для применения генной терапии. В этом видео, используя одноразовый пневматические (Air-колеса) биореактор системы, мы демонстрируем культуру клеток человека карциномы легкого (А549) клеток на микро-носителей для производства в онколитических аденовируса. Пневматическая конструкции биореактора использует вертикальное колесо перемешивания, что питается от плавучести газа разбрызгивают в нижней части биореактора. Это щадящий метод перемешивание ограничивает гидродинамические силы сдвига, но все еще обеспечивает оптимальной средой и клетки смешивания 4. По сравнению с реактор с мешалкой, пневматический реактор имеет низкую напряжения сдвига стены даже с большими объемами систем воздушного колеса биореактора (рисунок 1). В отличие от перемешивают биореакторах цистерн, вертикальное колесо этого одноразового использования реактора включен потоком пузырьков газа внутриСудно, которое позволяет нежный и равномерного перемешивания среды (рисунок 2).
Protocol
1 Войти
- Мощность до биореактора. Щелкните в любом месте, чтобы открыть страницу входа в систему. Выберите имя пользователя и введите пароль и нажмите кнопку "Войти".
2 Калибровка
- Калибровка датчика рН (2 точки перед автоклавированием).
- Проверьте датчик рН и подтвердить наконечник датчика заполнена раствором электролита. Приготовьте два стаканы с калибровки рН растворов (электролитов) рН 4 и рН 7 и иметь в своем распоряжении бутыль дистиллированной водой.
- Подключите кабель рН к датчику рН. Перейдите на вкладку "Действия" на интерфейсе Hello и нажмите "калибровки". Введите температуру буфера в области Temp калибровочного раствора.
- Поместите датчик рН в буфере 1 (рН 4) и введите значение в поле «нулевой». Подождите графике, чтобы стабилизировать и нажмите кнопку "калибровки 1". Промыть датчик рН дистиллированной водой.
- Датчик Место в буфере 2 (рН 7). Введите буфер2 Значение в поле "Диапазон". Подождите графа для стабилизации и нажмите калибровки 2 кнопки.
- Нажмите "Сохранить", а затем нажмите кнопку "Закрыть".
- Калибровка растворенного кислорода (DO) датчик.
- Убедитесь, что датчик DO была поляризована, будучи подключены к системе в течение нескольких часов. Перейдите на вкладку "Действия" на интерфейсе Hello и нажмите калибровки. Нажмите кнопку "Выполнить".
- Отключите датчик DO и введите 0 в поле «нулевой». Подождите графике, чтобы стабилизировать и нажмите кнопку "Калибровка 1".
- Снова подключите датчик DO и введите 100 в поле "Диапазон". Подождите графике, чтобы стабилизировать и нажмите кнопку "Калибровка 2".
- Нажмите "Сохранить", а затем нажмите кнопку "Закрыть".
3 автоклав и установить датчики и реагентов Суда
- После калибровки, место датчиков и тепловой ямы в AUTOCLave сумки и автоклав в течение 30 мин при 121 ° С, 15 фунтов на кв.
- Sanitize автоклаве мешочки с 70% изопропилового спирта (IPA) и передачи мешочках до биологической безопасности кабинета (BSC). Снимите внешнюю упаковку судна.
- Sanitize внутреннюю упаковку с 70% IPA и передать судно в бокс биологической безопасности (BSC). Снять внутренний упаковку и осмотреть судно и трубки за ущерб, причиненный во время транспортировки.
- Установите рН и DO датчики в двух передних портов. Установите тепловой колодец на левой задней порта. Откройте крышку датчика.
- Руководство датчик через порт датчика. Автор датчик плотно в порт.
- Трансфер судно из BSC.
- Повесьте DO и датчиков рН кабелей вне сосуда рукава и убедитесь, что нет ничего в рукаве. Авто судно в рукав, ногами вперед.
- Осторожно установите датчик температуры в сосуд тепловой скважины. Убедитесь, что в нижней части судна упирается нагревателей.
- Удалитьтрубка устанавливает из сумок. Матч цветовое кодирование на трубки к соответствующим разъемам и насосов на блоке управления биореактор.
- Установите основной газовой магистрали, нажав разъем в его выходе газа. Установите микро газовую линию, крутя разъем по часовой стрелке в выходе газа. Установите трубки выходного фильтра:
- Откройте фильтр духовку. Закрепите фильтр выходящего воздуха на U-канала таким образом, его трубка проходит через двух крючков до фильтра и из духовки.
- Установите трубку на конденсаторе мешок в держателе труб. Закрой дверь.
- Маршрут присоединения линии A и B, оба СМИ линии, и урожай линия позади датчика DO и на скамью рядом с блоком управления биореактор.
- Подключите кабели к DO и рН датчиков.
4. Добавление Средние и Micro-носители
- Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "Управление Насосы" на компьютерный интерфейс.
- Сформируйте STERIле связь между неиспользованный среднего сложения линии (1 оранжевая полоса) и среднесрочной источника бутылка / мешок сваркой трубки или с помощью Luer заглушки.
- Нажмите ползунок для включения медиа насоса на. Нажмите ползунок для включения СМИ насос выключен после сложения желании количества среды.
- Поместите микроносителю бусины в Ca 2 +, Mg 2 + бесплатный PBS в течение 3 часов при комнатной температуре.
- Вымойте бисером несколько раз с Са 2 +, Mg 2 + бесплатно PBS.
- Автоклав течение 15 мин при 115 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм.
Примечание: Добавить 3 г / л (сухого веса) в этом эксперименте. - Насос в микро-носителей, которые были увлажненной, промывают и обрабатывали в автоклаве в реактор таким же образом, была добавлена среда на стадии 4.1.
5 Уравновешивание и по одной точке проводить калибровку
- Установите контроллеры на Auto и введите требуемые уставки. Здесь, использовать агитации уставки (SP) = 15 оборотов в минуту, температура SP = 37,0 ° C, рН = 7,2, DO = 100%. Дождитесь рarameters уравновешиваться.
- Подтвердите датчик полностью поляризован. Подтвердите DO текущую стоимость стабилизировалась.
- Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "калибровки". Нажмите кнопку "Выполнить", нажмите "One-точка".
- Введите '100' в поле "Диапазон". Нажмите кнопку "Калибровка 1", нажмите кнопку "Сохранить" и нажмите кнопку "Закрыть":
6 Запуск Выполнить
- Перейдите на вкладку Действия. Нажмите "Batch". Используйте экранную клавиатуру или внешнюю клавиатуру для ввода имя пакета 16 символов или менее.
- Нажмите кнопку "Скрыть" клавиатуры на экране. Нажмите кнопку "Пуск партию" подтвердить, нажав "Пуск" в наложении.
7 Привить с ячейками
- Форма стерильный соединение между неиспользованные среднего дополнение линии (1 оранжевой полосы) и бутылки клеток / источник сумку сваркитрубки или с помощью фитингов Luer.
- Установите раздел силикона трубки в СМИ насоса так стрелка в сторону трубки между насосом и судна.
- Проверьте зажим трубки открыт и его разветвленной зажим трубки закрыт. Нажмите ползунок для включения медиа-насос и нажмите "Off" после добавления клеток.
- Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "Насосы Control".
8 Отбор проб
- После прививки и так часто, как желательно, чтобы следить за культуру, сделать выборку из культуры в следующем порядке:
- Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "принять образец". Поместите трубки отбора проб в насосе для отбора проб и манипулировать кран отбора проб в соответствии с инструкциями на экране.
- Выполните по крайней мере ежедневный микроскопический наблюдение и подсчет клеток на этих образцах.
- Когда клетки достигли желаемой плотности, в этом сASE 1,2 × 10 6 клеток / мл, инфицировать клетки с добавлением вируса посевного материала.
- В асептических условиях добавить инокулята в 20 мл шприц, и соединить шприц с одним из запасных присоединения портов реактора. Введем инокулята в реактор при нажатии на поршень шприца.
- Продолжить выборки и анализа культуру для аденовируса концентрации внутриклеточного частиц.
Representative Results
На рисунке 3, параметры для инициирования биореактора перспективе показаны. Эта цифра показывает экран до настройка параметров температуры, растворенного кислорода, рН и агитации. После того, как параметры заданы, параметры Run постоянно контролируются и поправки могут быть сделаны, чтобы поддерживать необходимые условия. Программное обеспечение производит непрерывное считывание, что позволяет легко идентифицировать проблемы. В этом эксперименте с использованием 2,5 л DMEM, содержащей 10% FBS, 250 частей на миллион SAFC антипенные С, 2 мМ L-глутамина и 3 г / л микро-носителей, система стабилизировалась, так что процентов кислорода составляет 50%, температура 37 ° С и рН 7,2. Реактор засевают клетками А549 в концентрации 7 × 10 4 клеток / мл (или 10 клеток / микро-носителей). Выбранные для этой перспективе параметры привело большинства клеток, прилипших к микро-носителей в пределах 2 ч (рисунок 4). После 12 ч клетки демоныtrating признаки выравнивания и распространения на поверхности микро-носителя (Рисунок 5). По 24 часов, микро-носители имеют относительно равномерное распределение клеток, без микро-носителей без клеток и без крупных комков клеток на микро-носителей (Рисунок 6). Процент колонизации микро-носителя на клетках А549 на 75% на 24 ч и после этого 90% (фиг.7). Клетки продолжали расти в геометрической прогрессии в ~ 1000000 клеток / мл через 48 часов (рисунок 8). После заражения дозе онколитических аденовируса (2 х 10 8 вирионов / мл) при 50 ч, плотность увеличивается до 1,2 млн клеток / мл, а затем начал снижаться, как литическую инфекция прогрессировала. Был ~ 10000 раз амплификации вирусного посевного материала.
В предыдущих экспериментах мы обнаружили, что мониторинг и регулировать поток газа имеет решающее значение для максимизации роста клеток (неопубликованные данные). Быстро растущие клетки могут привести к истощению системы кислорода с уровень DO падает до нуля. В то время как клетки продолжали расти, это было в гораздо более медленными темпами. Это имеет решающее значение для мониторинга и регулировать поток кислорода для удовлетворения клеток требования во время логарифмической фазы роста. Каждый прогон могут быть проанализированы для оптимального роста путем сравнения рН, DO, и температуру со счетчиками ежедневных клеток.
Рисунок 1 гидродинамика биореактора Пневматическая система (PBS) по сравнению с резервуарным биореакторе с мешалкой измерения стены поперечных сил при различных объемах реакторов.
Рисунок 2 Пневматика-колеса реактор колесо.
52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Рис.3 Пневматика колеса программного снимок экрана параметров для запуска биореактора пробег.
Рисунок 4 Micro-носитель колонизация А549 2 ч после прививки. (Средний диаметр микро-носитель ~ 180 мкм.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 12 ч после начала культивировани А549 клетки есть, сплющивание и распространения на микро-носителей.5highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Микро-носители, покрытые клетками после 24 часов в культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7 Процент колонизации микро-носителей на А549 после инокуляции.
Рисунок 8 жизнеспособных клеток А549 в культуральной предварительно сообщение инфекция число и с adenovirнам. Обратите внимание, что вирусная шаг заражение произошло при 50 час.
Discussion
Это одноразовая система биореактора является относительно простым в использовании и позволяет в реальном времени аналитики для мониторинга и анализа реактора. Это очень хорошо подходит для млекопитающих и насекомых клеточной культуры с плотностью клеток, достигающих более 30 миллионов клеток / мл. Кроме того А549 описано в настоящем докладе 11, мы выросли SF-9 клеток насекомых в биореакторе, а также. Бережное смешивание обеспечивается пневматическим воздуха колеса уменьшает повреждения клеток. Несколько шагов имеют решающее значение при настройке этого реактора. Во-первых, собственно калибровки рН и DO датчики важно для оптимального мониторинга культуры и добавлением реагентов для доведения рН или кислорода в системе. Во-вторых, реагента и семенные бутылки должны быть заполнены и вложения Luer сделано в стерильной среде, такой как BSC. После того, как бутылки с реагентами перемещаются из стерильной среде, соединения с линиями подачи биореактора должно быть сделано с осторожностью, чтобы избежать микробного загрязнения.
Одноразовый Пневматическая система биореактор имеет потенциал для удовлетворения многих исследований и клинического применения в областях биотерапевтических, вакцин, стволовые клетки, и персонализированной медицины 4. Кроме того, гибкость этой системы позволяет единовременной загрузке, при периодическом, перфузии, и трансфекции на основе биореактора приложений 5. Наконец, одноразовые одноразовые биореакторные системы имеют POTENтомобиля удовлетворения потребностей крупномасштабного промышленного производства и придерживаться принципов и рекомендаций национальных и международных регулирующих органов 6-10.
Disclosures
Авторы Д. Жиру и Y. Hashimura являются сотрудниками ФСБ Biotech, которая производит реагенты и инструменты, используемые в этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 3 | PBS | ||
| Single Use Assembly | PBS | ||
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).
- Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors (2012).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).
