Odling av däggdjursceller med en enda användning Pneumatic bioreaktorsystem

Introduction

Däggdjurs cellinjer kan klassificeras i en av tre kategorier baserat på deras tillväxtegenskaper: celler som växer i suspension, celler som växer som aggregat, och celler som växer förankrade till ett substrat. Fastän luft-hjuliga bioreaktor demonstreras i denna video är i stånd att växa alla tre typer av celler, kommer denna video demonstrerar användandet av bioreaktorn att växa förankringsberoende celler på mikrobärare. Förankringsberoende däggdjursceller kan odlas för att producera fler celler - där cellerna själva produkten. Till exempel är humant benmärgs mesenchymala stamceller närvarande odlas med syfte att skörda celler och injicera dem i sjuk vävnad. Den pneumatiska bioreaktor demonstreras i den här videon har visat lämplig för produktion av sådana mesenkymala stamceller för denna applikation (Serra et al., Personlig kommunikation, 2013).

Anchorage dependent däggdjursceller är vanligtvis odlas i liten skala i 2D odlingskärl som cellodlingsplattor, cellodlingsflaskor eller rullflaskor, där de ansluter sig till en specialbehandlad tillväxtytan ^1. När flera celler önskas kan plattorna eller kolvar utökas genom att använda fler eller större fartyg. Emellertid, för mer kostnadseffektiv odling av stora mängder av förankringsberoende celler, ökning av ytarean för cellbindning kan åstadkommas genom användning av små fasta pärlor kallade mikrobärare. Beroende på anslutningsegenskaperna hos cellen, flera olika typer av mikrobärare är kommersiellt tillgängliga, såsom dextran, peptid, eller kollagen belagda. Mikrobärare har en stor ytarea till volymförhållande som ger en större ytarea för celltillväxt; och de mikrobärare kan hållas i suspension under omröring, vilket gör att de celler som skall odlas till höga densiteter i bioreaktorsystem ^2. För närvarande, de typer av bioreactors där vidhäftande celler odlas på mikro bärare inkluderar spinnerflaskor och omrörda tanksystem, som använder axiella pumphjul för att bibehålla ett tillfälligt upphävande av cellbelagda mikrobärare.

Flera faktorer är viktiga för en framgångsrik odling av celler inkluderande syrespänning, skjuvspänning, yta matris och näringsämnen och metabolitkoncentrationer. Användningen av bioreaktorer möjliggör realtidsövervakning av villkoren tillväxt och potential att väsentligt lägre produktionskostnader ^1. Det finns flera gemensamma bioreaktor design för in vitro cell odling inklusive, omrörd suspension, roterande väggkärl, ihåliga fibrer, väska bioreaktor på en rocker-plattform, och fluidiserad bädd-system ^3. Många av dessa system presenterar unika problem för cellodling och skala -up, såsom höga kostnader, närings koncentrationsgradienter, hydrodynamiska skjuvning, cellaggregation, och svårigheter att provtagning, övervakning och styrning av cell uppskalning.

Olika vidhäftande cellinjer används i produktionen av virus, antingen i produktionen av virusvacciner eller för produktion av virala vektorer för genterapi applikationer. I den här videon, med hjälp av engångs pneumatiska (lufthjul) bioreaktorsystem visar vi den kultur av mänskliga lungkarcinomceller (A549) celler på mikrobärare för produktion av en onkolytiskt adenovirus. Den pneumatiska bioreaktor design använder en vertikal agitation hjul som drivs av flytkraften av gas spolades in i botten av bioreaktorn. Denna varsam omrörning metod begränsar hydrodynamiska skjuvkrafter, men ändå garanterar optimal medium och cell blandning ^4. Jämfört med omrörd tankreaktor, har den pneumatiska reaktorn låg mur skjuvspänning även med hög volym luft-Wheel bioreaktorsystem (Figur 1). I motsats till omrörda tank bioreaktorer, är den vertikala impeller av denna enda användning reaktorn vrids av en ström av gasbubblor inomfartyget, vilket gör det möjligt för skonsam och jämn medelblandning (Figur 2).

Protocol

1 Logga in

1. Driva upp bioreaktorn. Klicka var som helst för att öppna inloggningssidan. Välj användarnamn och ange lösenord och klicka på "Logga in".

2. Kalibrering

1. Kalibrera pH-sensor (2 poäng före autoklavering).
2. Kontrollera pH-sensor och bekräfta sensorspetsen är fylld med elektrolytlösning. Förbered två bägare med pH kalibreringslösningarna (elektrolyt) pH 4 och pH 7 och ha tillgång till en tvättflaska med destillerat vatten.
3. Anslut pH kabeln till pH-sensorn. Navigera till "Åtgärder" fliken på Hej gränssnitt och klicka på "kalibrera". Ange bufferttemperatur i kalibreringslösningen Temp område.
4. Placera pH-sensor i buffert 1 (pH 4) och ange värdet i "noll" fältet. Vänta på grafen för att stabilisera och klicka på knappen "kalibrera 1". Skölj pH-sensorn med destillerat vatten.
5. Placera sensorn i buffert 2 (pH 7). Ange buffert2 värde i "span" fältet. Vänta grafen för att stabilisera och klicka kalibrera 2-knappen.
6. Klicka på "Spara" och sedan på "Stäng".
7. Kalibrera löst syre (DO) sensorn.
8. Se till DO-sensorn har polariserat genom att vara ansluten till systemet under flera timmar. Navigera till "Åtgärder" fliken på Hej gränssnitt och klicka kalibrera. Klicka på "DO A"-knappen.
9. Koppla bort DO sensorn och ange 0 i "noll" fältet. Vänta på grafen för att stabilisera och klicka på "Kalibrera 1" knappen.
10. Anslut DO sensor och skriv 100 i "Span" fältet. Vänta på grafen för att stabilisera och klicka på knappen "Kalibrera 2".
11. Klicka på "Spara" och sedan på "Stäng".

3 Autoklav och Installera Sensorer och reagens Fartyg

1. Efter kalibrering, placera sensorer och termisk bra i autoclave påsar och autoklav under 30 minuter vid 121 ° C, 15 psi.
2. SNYGGA autoklav påsar med 70% isopropylalkohol (IPA) och överföra påsar till biologisk säkerhet skåp (BSC). Ta bort den yttre förpackningen för fartyg.
3. SNYGGA innerförpackning med 70% IPA och överföra fartyg till biologisk säkerhet skåp (BSC). Ta bort inneremballage och inspektera fartyget och slangar för skador som tillfogats under transporten.
4. Montera pH och DO sensorer i de två främre portarna. Montera värme väl till vänster tillbaka porten. Öppna sensorlocket.
5. Guide sensorn genom sensorporten. Trä sensorn ordentligt i porten.
6. Överför fartyg ur BSC.
7. Häng DO och pH givarkablar utanför fartyget hylsan och kontrollera att ingenting är i hylsan. Skjut fartyget i hylsan, fötterna först.
8. Sätt försiktigt temperatursensorn i kärlet termiska väl. Se till att botten av kärlet vilar mot värmarna.
9. Ta bortslangen sätter ur sina väskor. Matcha färgkodning på slangen till motsvarande kontakter och pumpar på bioreaktor styrenheten.
10. Installera huvud gasledningen genom att trycka på kontakten i sin gas uttaget. Installera mikro gasledningen genom att vrida kontakten medurs till gasutloppet. Montera utblåsfilter slang:
11. Öppna filter ugn. Fäst avgasfiltret på U-kanalen så att dess slang går igenom de två krokarna till filtret och ut ur ugnen.
12. Montera slangen från kondensorn väska i slangen hållaren. Stäng dörren.
13. Route additions linjerna A och B, båda medie linjer och skördelinjen bakom DO sensorn och på bänken bredvid bioreaktorn styrenheten.
14. Anslut kablarna till DO och pH-sensorer.

4. Lägga Medium och mikroföretag

1. Navigera till fliken "åtgärder" och klicka på "Kontroll pumpar" på datorgränssnitt.
2. Bilda en Sterile anslutning mellan en oanvänd medel tillägg linje (1 apelsin band) och mediet flaska / påse källa genom svetsning slangen eller använda Luer beslag.
3. Klicka på reglaget för att slå på mediepumpen. Klicka på skjutreglaget för att stänga av media pumpa ut efter tillsats önskad mängd medium.
4. Placera mikrobärarkulor i Ca2 ^+, Mg2 ⁺ fri PBS under 3 h vid RT.
5. Tvätta pärlor flera gånger med Ca2 ^+, Mg2 ⁺ fri PBS.
6. Autoklavera under 15 min vid 115 ° C, 15 psi.
   OBS: Lägg 3 g / L (torrvikt) i detta experiment.
7. Pump i mikrobärare som har hydratiserats, tvättade och autoklaverade in i reaktorn på samma sätt mediet tillsattes i steg 4,1.

5. Ekvilibrering och One-point DO kalibrering

1. Ställ de registeransvariga till Auto och ange önskade börvärden. Här använder Agitation börvärde (SP) = 15 rpm, Temperatur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Vänta på pparametrar ekvilibrera.
2. Bekräfta sensorn är helt polariserad. Bekräfta DO nuvärde har stabiliserats.
3. Navigera till fliken "Åtgärder" och klicka på "kalibrera". Klicka på "DO A", klicka på "One-point".
4. Skriv in "100" i "Span" fältet. Klicka på "Kalibrera 1", klicka på "Spara" och klicka på "close":

6 Starta en körning

1. Navigera till fliken Åtgärder. Klicka på "Batch". Använd tangentbordet på skärmen eller ett externt tangentbord för att skriva in ett parti namn 16 tecken eller mindre.
2. Klicka på tangentbordet på skärmen är "Hide" knappen. Klicka på "Start batch" Bekräfta genom att klicka på "Start" i overlay.

7 Inokulera celler

1. Bilda en steril anslutning mellan en oanvänd medel tillägg linje (1 apelsin band) och cellflaska / påse källa genom svetsningslangen eller använda Luer rördelar.
2. Montera silikonsektion av slangen i media pumpen så att pilen pekar mot slangen mellan pumpen och kärlet.
3. Kontrollera slangklämman är öppen och grenade slangklämma är stängd. Klicka på skjutreglaget för att stänga av mediepumpen på och klicka på "Off" efter att ha lagt celler.
4. Navigera till fliken "Åtgärder" och klicka på "Kontroll Pumpar".

8 Provtagning

1. Efter ympning och så ofta som önskas för att övervaka kultur, dra ett prov från kulturen på följande sätt:
2. Navigera till fliken "åtgärder" och klicka på "ta prov". Placera provtagningsslangen i provtagningspumpen och manipulera provtagningskranen enligt instruktionerna på skärmen.
3. Utför minst en daglig mikroskopisk observation och cellräkning på dessa prover.
4. När cellerna har uppnått den önskade densiteten, i detta case 1,2 x 10 ⁶ celler / ml, infektera cellerna med tillsats av ett virus inokulum.
5. Aseptiskt inokulatet till en 20 ml spruta och anslut sprutan till en av reservadditions portarna på reaktorn. Introducera inokulatet till reaktorn genom att trycka på sprutans kolv.
6. Fortsätta provtagning och analys av kulturen för adenovirus intracellulära partikelkoncentration.

Representative Results

I figur 3 är parametrarna för inledande av bioreaktor körningen visas. Denna figur visar skärmen innan parametersättning av temperatur, löst syre, pH och agitation. När parametrarna är inställda är parametrarna går kontinuerligt övervakas och justeringar kan göras för att hålla de fastställda villkoren. Programmet ger en kontinuerlig avläsning som möjliggör enkel identifiering av problem. I detta experiment med användning av 2,5 L av DMEM innehållande 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-skum C, 2 mM L-glutamin och 3 g / L av mikrobärare, är systemet stabiliserats så den procent syre är 50%, den temperatur är 37 ° C, och pH-värdet är 7,2. Reaktorn ympades med A549-celler vid en koncentration av 7 x 10 ⁴ celler / ml (eller 10 celler / mikro-bärar). De parametrar som valts för detta försök resulterade i en majoritet av cellerna som häftar vid mikrobärare inom 2 h (figur 4). Efter 12 timmar är cellerna demonerHåll bilens tecken på utplattning och spridning på mikro bärarytan (Figur 5). Genom 24 tim, mikrobärare har en relativt jämn fördelning av celler, utan mikrobärare utan celler och inga stora klumpar av celler på mikrobärare (figur 6). Andelen mikroföretag kolonisering av A549-celler är 75% med 24 timmar och 90% därefter (Figur 7). Cellerna fortsatte att växa exponentiellt till ~ miljoner celler / ml efter 48 h (fig 8). Efter infektion av en dos av onkolytisk adenovirus (2 x 10 ⁸ virioner / ml) vid 50 timmar, ökade densiteten till 1,2 miljoner celler / ml och sedan började minska när den lytiska infektionen fortskred. Det fanns ~ 10000 gånger förstärkning av den virala inokulat.

I tidigare experiment har vi funnit, att övervaka och justera gasflödet är kritisk för att maximera celltillväxt (opublicerade data). Snabbt växande celler kan tömma systemet av syre med DO nivån sjunker till noll. Medan cellerna fortsatte att växa, det var i mycket långsammare takt. Det är kritiskt att övervaka och justera flödet av syre för att uppfylla de cell krav under den logaritmiska tillväxtfasen. Varje körning kan analyseras för optimal tillväxt genom att jämföra pH, DO, och temperatur med dagliga kroppar.

Figur 1. Fluid dynamiken i Pneumatic Bioreaktor System (PBS) jämfört med omrörare tank bioreaktor mäta vägg skjuvkrafter vid olika reaktorvolymer.

Figur 2 Pneumatisk-Wheel reaktorpumphjul.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Figur 3 Pneumatisk Wheel programvara skärmdump av parametrar för att initiera bioreaktorn körningen.

Figur 4 Micro-bärare kolonisering med A549-celler 2 h efter ympning. (Genomsnittlig mikrobärare diameter ~ 180 nm.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 12 h efter initiering av kulturen, är A549-celler att fästa, plattas och sprider på mikrobärare.5highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Mikrobärare belagda med celler efter 24 timmar i kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7 Procent av mikrobärare kolonisering av A549-celler efter inokulering.

Figur 8 Antalet viabla A549-celler i kultur före och efter infektion med Adenoviross. Observera att virusinfektion steget inträffade vid 50 tim.

Discussion

Denna engångs bioreaktorsystem är relativt enkelt att använda och ger realtidsanalyser för reaktor uppföljning och analys. Det är mycket väl lämpad för däggdjur och insektscellkultur med celldensiteter når mer än 30 miljoner celler / ml. Förutom A549-celler som beskrivs i denna rapport ^11, har vi vuxit SF-9 insektsceller i bioreaktorn också. Den milda blandning från den pneumatiska lufthjul minskar cellskador. Flera steg är avgörande när du ställer in denna reaktor. Först korrekt kalibrering av pH-och DO-sensorer är viktigt för optimal övervakning av kulturen och för tillsats av reagens för att justera pH eller syre i systemet. För det andra måste reagens och utsädesflaskor fyllas och luer bilagor görs i en steril miljö som en BSC. När reagensflaskorna flyttas ut ur den sterila miljön måste anslutningarna till bioreaktorn matarledningar göras försiktigt för att undvika mikrobiell kontamination.

Den enda användning pneumatiska bioreaktorsystem har potential att möta många av forskning och kliniska tillämpningar inom områdena proteinläkemedel, vaccin, stamceller och personlig medicin ^4. Dessutom tillåter flexibilitet i detta system för Batch, Fed-batch, Perfusion och Transfektionsexperiment baserad bioreaktor program ^5. Slutligen engångsengångs bioreaktorsystem har potential att möta behoven av storskalig industriell produktion och att följa riktlinjer och rekommendationer från nationella och internationella tillsynsmyndigheter ^6-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011