Dyrkning af pattedvrceller hjælp af en enkelt brug Pneumatic bioreaktorsystem

Introduction

Pattedyrceller linjer kan inddeles i en af ​​tre kategorier baseret på deres vækst karakteristika: celler, der vokser i suspension, celler, der vokser som aggregater, og celler, der vokser forankret til et substrat. Selv om luft-hjulet bioreaktor påvist i denne video er i stand til at vokse alle tre typer af celler, vil denne video demonstrere brugen af ​​bioreaktoren til at vokse forankringsafhængige celler på mikrobærere. Ankerafhængige pattedyrceller kan dyrkes med henblik på fremstilling af flere celler - hvor cellerne selv er produktet. For eksempel er humane knoglemarvsceller afledte mesenkymale stamceller øjeblikket dyrkes med henblik på høst af cellerne og injicere dem i sygt væv. Den pneumatiske bioreaktor demonstreret i denne video har vist sig egnet til fremstilling af sådanne mesenkymale stamceller til denne anvendelse (Serra et al., Personlig kommunikation, 2013).

Anchorage dependent pattedyrceller dyrkes typisk lille målestok i 2D dyrkningsbeholdere såsom cellekultur plader, celledyrkningskolber eller rullekolber, hvor de bekender sig til en specielt behandlet vækst overflade ^1. Når der ønskes flere celler, kan de plader eller kolber udvides ved hjælp af mere eller større fartøjer. Dog kan for mere omkostningseffektiv dyrkning af store mængder forankringsafhængige celler, hvilket øger overfladeareal til cellebinding opnås ved anvendelse af små faste perler kaldet mikro-bærere. Afhængigt af redskabernes karakteristika cellen, flere forskellige typer af mikro-bærere er kommercielt tilgængelige, såsom dextran, et peptid eller kollagen coatet. Micro-bærere har et stort overfladeareal volumenforhold giver et større overfladeareal for cellevækst til; og mikro-bærere kan holdes i suspension med omrøring, som tillader, at cellerne dyrkes til høje densiteter i bioreaktor systemer ^2. I øjeblikket er de typer af bioreactors hvor adhærente celler dyrket på mikrobærere omfatter spinnerkolber og omrørte tank-systemer, der anvender aksialskovlhjul at opretholde suspensionen af ​​celler belagt mikrobærere.

Adskillige faktorer er vigtige for en vellykket dyrkning af celler, herunder oxygenspænding forskydningsspænding overflade matrix og næringsstoffer og metabolitkoncentrationer. Brugen af bioreaktorer giver mulighed for real-time overvågning af vækstbetingelser og potentiale til betydeligt lavere produktionsomkostninger ^1. Der er flere fælles bioreaktor design for dyrkning in vitro-celle, herunder omrørt suspension, roterende væg fartøj, hule fibre, taske bioreaktor på en vippeplatform og systemer med fluidiseret leje ^3. Mange af disse systemer præsentere unikke problemer for celledyrkning og skalere -op, såsom høje omkostninger, næringsstof koncentrationsgradienter, hydrodynamiske forskydning, celleaggregering og besvær med prøveudtagning, overvågning og styring af cell opskalering.

Forskellige adhærente cellelinier anvendes i produktionen af ​​virus, enten i produktion af virale vacciner eller til fremstilling af virale vektorer til genterapianvendelser. I denne video, ved hjælp af engangsbrug pneumatisk (luft-hjulet) bioreaktor system, er vi demonstrere dyrkning af humane lungecarcinomceller (A549) celler på mikro-bærere til fremstilling af en onkolytisk adenovirus. Den pneumatiske bioreaktor design bruger et lodret omrøring hjul, der er drevet af opdriften af ​​gas boblet bunden af ​​bioreaktoren. Denne milde omrøring metode begrænser hydrodynamiske forskydningskræfter, men stadig sikrer optimal medium og celle blande ^4. I forhold til den omrørte tankreaktor, pneumatiske reaktor har lav væg forskydningsspænding selv med høj lydstyrke Air-Hjul bioreaktor systemer (figur 1). I modsætning til tankomrøring bioreaktorer, er den lodrette pumpehjul engangsbrug reaktor drejes af en strøm af gasbobler indenfartøjet, som giver mulighed for blid og ensartet medium blanding (figur 2).

Protocol

1. Log ind

1. Magten op bioreaktoren. Klik hvor som helst for at åbne login-siden. Vælg brugernavn og indtast adgangskode og klik på "Log ind".

2. Kalibrering

1. Kalibrere pH-sensor (2 point før autoklavering).
2. Efterse pH-sensor og bekræft følerspidsen er fyldt med elektrolyt-opløsning. Forbered to bægre med pH-standardopløsninger (elektrolyt), pH 4 og 7 og har adgang til en vask flaske med destilleret vand.
3. Slut pH-kablet til pH-sensoren. Naviger til fanen "Handlinger" på Hello interface og klik på "kalibrere". Indtast buffertemperatur i kalibreringsopløsningen feltet Temp.
4. Placer pH-sensoren i buffer 1 (pH 4), og indtast værdien i feltet "nul". Vent på grafen for at stabilisere og klikke på knappen "kalibrere 1". Skyl pH-sensoren med destilleret vand.
5. Placer sensoren i puffer 2 (pH 7). Indtast buffer2 værdi i feltet "span". Vent på grafen for at stabilisere og klik kalibrere 2 knappen.
6. Klik på "Gem" og klik derefter på "Luk".
7. Kalibrer opløst ilt (DO) sensor.
8. Sørg for DO-sensoren er blevet polariseret ved at blive tilsluttet systemet i flere timer. Naviger til fanen "Handlinger" på Hello interface og klik på Kalibrer. Klik på "gøre en" knap.
9. Afbryd DO-sensoren og indtaste 0 i feltet "nul". Vent på grafen for at stabilisere og klik på "Kalibrer 1" knappen.
10. Tilslut DO-sensoren og indtast 100 i feltet "Span" feltet. Vent på grafen for at stabilisere og klik på "Kalibrer 2" knappen.
11. Klik på "Gem" og klik derefter på "Luk".

3. Autoklave og installere Sensorer og reagensbeholderne

1. Efter kalibrering sted sensorer og termisk godt i AutoCLave poser og autoklaveres i 30 minutter ved 121 ° C, 15 psi.
2. Desinficere autoklave poser med 70% isopropylalkohol (IPA) og overføre poser til biologisk sikkerhed kabinet (BSC). Fjern den ydre emballage af skib.
3. Desinficere indvendig emballage med 70% IPA og overføre fartøjet til biologisk sikkerhed kabinet (BSC). Fjern indvendig emballage og inspicere fartøjet og slanger for skader påført under transporten.
4. Installer pH og DO sensorer i de to forreste porte. Installer den termiske godt til venstre tilbage porten. Åbn sensoren hætte.
5. Guide sensoren gennem sensoren porten. Tråd sensoren stramt i porten.
6. Overfør fartøj ud af BSC.
7. Hæng DO og pH-sensor kabler uden for fartøjet ærme og kontrollere, at intet er i ærmet. Skub beholderen ind i ærmet, fødderne først.
8. Passer forsigtigt temperaturføleren i beholderen termisk godt. Sørg for, at bunden af ​​beholderen hviler mod varmeapparater.
9. Fjernslangen sætter fra deres poser. Farvekoder Match på slangen til de tilsvarende stik og pumper på bioreaktor styreenhed.
10. Installer hovedgasledningen linje ved at trykke stikket i sin gas stikkontakt. Installer mikro gasledning ved at dreje stikket med uret ind i gassen stikkontakt. Installer udblæsningsfilteret slange:
11. Åbn filteret ovnen. Fastgør udblæsningsfilteret på U-kanal, så dens slanger går gennem de to kroge til filteret og ud af ovnen.
12. Installer slangen ved kondensatoren taske i slangen holderen. Luk døren.
13. Route additionssalte linjerne A og B, begge medier linjer og høsten linie bag DO sensoren og på bænken ved siden af ​​bioreaktoren styreenheden.
14. Slut kablerne til DO og pH-sensorer.

4. Tilføjelse Medium og Micro-bærere

1. Naviger til fanen "handlinger", og klik på "Control Pumper" på computer interface.
2. Form en Sterile-forbindelse mellem en ubrugt medie tilføjelse linje (1 appelsin bånd) og mediet flaske / pose kilde ved svejsning slangen eller ved hjælp luerfittings.
3. Klik på skyderen for at tænde medierne pumpen. Klik på skyderen for at slå medierne pumpen efter tilsætning ønskede mængde medium.
4. Placer mikrobærerperler i Ca2 ^+, Mg2 ⁺ PBS i 3 timer ved stuetemperatur.
5. Vask perler flere gange med Ca2 ^+, Mg2 ⁺ PBS.
6. Autoklaver i 15 minutter ved 115 ° C, 15 psi.
   BEMÆRK: Tilsæt 3 g / l (tørvægt) i dette eksperiment.
7. Pumpe i mikro-bærere, der er blevet hydreret, vasket og autoklaveret i reaktoren på samme måde blev mediet tilsat i trin 4.1.

5. Ækvilibrering og One-punkts DO kalibrering

1. Sæt controllere til Auto, og indtaste de ønskede setpunkter. Her, brug Agitation setpunkt (SP) = 15 rpm Temperatur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Vent til parameters i ligevægt.
2. Bekræft sensoren er fuldstændigt polariseret. Bekræft DO nutidsværdi er stabiliseret.
3. Naviger til fanen "Handlinger" og klik "kalibrere". Klik på "DO A", klik på "One-point".
4. Indtast '100' i "Span" feltet. Klik på "Kalibrer 1" knappen, klik på "Gem" og klik på "Luk":

6. Start en kørsel

1. Naviger til fanen Handlinger. Klik på "Batch". Brug tastaturet på skærmen eller et eksternt tastatur til at indtaste et parti navn 16 tegn eller mindre.
2. Klik på tastaturets på skærmen "Skjul" knappen. Klik på "Start parti" bekræfte ved at klikke på "Start" i overlay.

7. podes med celler

1. Form en steril forbindelse mellem en ubrugt medie tilføjelse linje (1 appelsin bånd) og den celle flaske / pose kilde ved svejsningslangen eller ved hjælp af luer fittings.
2. Installer silikone sektion af slangen i medierne pumpen, så pilen peger mod slangen mellem pumpen og skib.
3. Check slangeklemme er åben, og dens forgrenet slangeklemme er lukket. Klik på skyderen for at slå medierne pumpe på og klik på "Off" efter tilsætning af celler.
4. Naviger til fanen "Handlinger", og klik på "Control Pumper".

8. Prøveudtagning

1. Efter pode og så ofte som ønsket at overvåge kultur, trækker en prøve fra kulturen på følgende måde:
2. Naviger til fanen "handlinger" og klik "tage prøve". Placer prøveudtagning slangen i prøvetagningspumpen og manipulere prøveudtagning stophane i henhold til instruktionerne på skærmen.
3. Udføre mindst en daglig mikroskopisk observation og celletal på disse prøver.
4. Når cellerne har nået den ønskede tæthed i denne case 1.2 x 10 ⁶ celler / ml, inficere cellerne med tilføjelse af en virus inokulum.
5. Aseptisk føje inokulum til en 20 ml sprøjte, og tilslut sprøjten til en af ​​de reservedele tilsætningsåbninger på reaktoren. Indførelse inoculum til reaktoren ved at trykke på sprøjtestemplet.
6. Fortsæt prøvetagning og analyse af kultur for adenovirus intracellulære koncentration partikel.

Representative Results

I figur 3 er parametrene for indledningen af bioreaktorkørsel vist. Denne figur viser skærmen forud for indstilling af parametrene for temperatur, opløst ilt, pH og agitation. Når parametre er indstillet, er kørselsparametre løbende overvåges og kan foretages justeringer for at opretholde de krævede betingelser. Softwaren giver en kontinuerlig udlæsning der giver mulighed for nem identifikation af problemer. I dette forsøg ved anvendelse af 2,5 L af DMEM indeholdende 10% FBS, 250 ppm SAFC anti-skum C, 2 mm L-glutamin og 3 g / L af mikro-bærere, er systemet stabiliseres så procent oxygen er 50%, Temperaturen er 37 ° C, og pH-værdien er 7,2. Reaktoren podes med A549-celler ved en koncentration på 7 x 10 ⁴ celler / ml (eller 10 celler / micro-carrier). De parametre, der er valgt til dette forsøg resulterede i hovedparten af cellerne klæber til mikro-bærere i 2 timer (Figur 4). Efter 12 timer er cellerne dæmonertrating tegn på udfladning og spredning på mikro-bærer overflade (figur 5). Ved 24 timer, mikro-bærere har en forholdsvis jævn fordeling af celler, med ingen mikro-bærere uden celler og ingen store klumper af celler på mikro-bærere (figur 6). Det procentvise indhold af mikro-bærer kolonisering af A549-celler er 75% ved 24 timer og 90% derefter (figur 7). Cellerne fortsatte med at vokse eksponentielt til ~ 1 million celler / ml efter 48 timer (figur 8). Efter infektion med en dosis af onkolytisk adenovirus (2 x 10 ⁸ virioner / ml) ved 50 timer, tætheden øges til 1,2 millioner celler / ml og derefter begyndte at falde, efterhånden som den lytiske infektion skred frem. Der var ~ 10.000 gange amplifikation af det virale inokulum.

I tidligere forsøg har vi fundet, at overvågning og justering af gasstrømmen er afgørende for at maksimere cellevæksten (upublicerede data). Hastigt voksende celler kan tømme systemet for ilt med DO-niveauet faldt til nul. Mens cellerne fortsatte med at vokse, det var i et meget langsommere tempo. Det er vigtigt at overvåge og justere ilttilførslen til at opfylde cellens behov under den logaritmiske vækstfase. Hver kørsel kan analyseres for optimal vækst ved at sammenligne pH, DO og temperatur med daglige celletallet.

Figur 1. Fluid dynamik Pneumatic bioreaktorsystem (PBS) sammenlignet med omrører beholder bioreaktor måling væg forskydningskræfter på forskellige reaktortyper mængder.

Figur 2. Pneumatisk Air-Wheel reaktor løbehjul.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Trykluftbehandling Wheel software skærmbillede af parametre at indlede bioreaktorkørsel.

Figur 4. Mikro-carrier kolonisering med A549-celler 2 timer efter podning. (Gennemsnitlig mikro-carrier diameter ~ 180 um.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. 12 timer efter indledningen af kulturen, er A549-celler fastgørelse, udfladning, og breder sig på mikro-bærere.5highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Micro-bærere belagt med celler efter 24 timer i kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Andel af mikro-carrier kolonisering af A549-celler efter inokulering.

Figur 8. Antallet af levedygtige A549 celler i kultur før og efter infektion med adenoviros. Bemærk, at virusinfektionen trin forekom ved 50 timer.

Discussion

Denne engangsbrug bioreaktor er relativt enkel at bruge og giver real-time analyser til reaktor overvågning og analyse. Det er yderst velegnet til pattedyr og insekter cellekultur med celletætheder nåede over 30 millioner celler / ml. Udover beskrevne A549-celler i denne rapport ^11, har vi dyrket SF-9-insektceller i bioreaktoren samt. Den blide blanding fra den pneumatiske luft hjul reducerer celleskader. Flere trin er kritisk, når oprettelsen af ​​denne reaktor. Først, ordentlig kalibrering af pH og DO sensorer er vigtig for optimal kontrol af kulturen og tilsætning af reagenser til at justere pH eller oxygen i systemet. For det andet skal de reagenser og frø flasker fyldes og de vedhæftede filer luer lavet i et sterilt miljø, såsom et BSC. Når reagensflaskerne bevæges ud af det sterile miljø, skal forbindelserne til bioreaktoren fødeledninger foretages med omhu for at undgå mikrobiel kontaminering.

Det engangsbrug pneumatiske bioreaktor system har potentiale til at opfylde mange af forskning og kliniske anvendelser inden for områderne bioterapeutiske, vacciner, stamceller, og personlig medicin ^4. Hertil kommer, at fleksibiliteten i dette system giver mulighed for batch, fed-batch, infusion, og transfektion baseret bioreaktor applikationer ^5. Endelig engangsbrug bioreaktor systemer har potententielle at opfylde behovene i stor skala industriel produktion og til at overholde retningslinjer og anbefalinger fra nationale og internationale reguleringsorganer ^6-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011