La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Introduction

Linee di cellule di mammifero possono essere classificati in una delle tre categorie in base alle loro caratteristiche di crescita: le cellule che crescono in sospensione, le cellule che crescono come aggregati, e le cellule che crescono ancorate ad un substrato. Anche se il bioreattore aria-wheel dimostrato in questo video è in grado di crescere tutti e tre i tipi di cellule, questo video dimostra l'uso del bioreattore a crescere celle dipendenti di ancoraggio sul micro-portanti. Cellule di mammifero dipendenti di ancoraggio possono essere coltivate per lo scopo di produrre più cellule - in cui le cellule stesse sono il prodotto. Ad esempio, osseo derivate cellule staminali mesenchimali osseo umano sono attualmente coltivati ​​con lo scopo di raccolta delle cellule e parenterale in tessuto malato. Il bioreattore pneumatico dimostrato in questo video è dimostrata adatta alla realizzazione di tali cellule staminali mesenchimali per questa applicazione (Serra et al., Comunicazione personale, 2013).

Anchorage depcellule di mammifero Endentski sono tipicamente coltivate su piccola scala in recipienti di coltura 2D come piastre di coltura cellulare, fiasche di coltura cellulare, o bottiglie a rulli, dove aderiscono ad una superficie di crescita specialmente trattata ^1. Quando più celle sono desiderati, le piastre o flaconi possono essere espansi utilizzando più o grandi vasi. Tuttavia, per più conveniente coltivazione di grandi quantità di celle dipendenti ancoraggio, aumentando la superficie per l'adesione delle cellule può essere realizzato utilizzando piccole perle solidi chiamati micro-portanti. A seconda delle caratteristiche di fissaggio della cella, diversi tipi di micro-portanti sono disponibili in commercio, come il destrano, peptide, o collagene rivestito. Micro-vettori hanno una grande superficie in rapporto al volume che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare; e le micro-vettori possono essere mantenuti in sospensione con agitazione, che permette alle cellule di essere coltivati ​​a alta densità nei sistemi di bioreattori ^2. Attualmente, i tipi di bioreactors dove cellule aderenti sono coltivate su micro-vettori comprendono fiaschi filatore e sistemi di serbatoi agitati, che utilizzano giranti assiali per mantenere in sospensione le cellule rivestite con micro-portanti.

Diversi fattori sono importanti per la coltivazione di successo di cellule, tra cui tensione di ossigeno, sforzo di taglio, matrici di superficie, e di nutrienti e le concentrazioni del metabolita. L'uso di bioreattori consente il monitoraggio in tempo reale delle condizioni di crescita e il potenziale di costi di produzione notevolmente inferiori ^1. Ci sono parecchi disegni bioreattore comune per la coltivazione in vitro di cellule tra cui, sospensione agitata, ruotando vaso a parete, a fibre cave, borsa bioreattore su una piattaforma rocker, e sistemi a letto fluido ^3. Molti di questi sistemi presentano problemi particolari per la coltivazione delle cellule e la scala -up, come il costo elevato, gradienti di concentrazione di nutrienti, taglio idrodinamico, l'aggregazione delle cellule, e la difficoltà di campionamento, il monitoraggio, il controllo e cell scale-up.

Varie linee cellulari aderenti sono usati nella produzione di virus, sia nella produzione di vaccini virali o per la produzione di vettori virali per applicazioni in terapia genica. In questo video, utilizzando l'unico uso pneumatico sistema di bioreattore (Air-Wheel), dimostriamo la coltura delle cellule di carcinoma polmonare umano (A549), le cellule di micro-vettori per la produzione di un adenovirus oncolitici. Il disegno bioreattore pneumatico utilizza una ruota agitazione verticale che è alimentato dalla galleggiabilità di gas strippata nel fondo del bioreattore. Questo metodo agitazione delicato limita le forze di taglio idrodinamiche, ma assicura comunque di medie e cellulare ottimale miscelazione ^4. Rispetto al reattore serbatoio agitato, il reattore pneumatico ha una bassa sforzi di taglio anche con sistemi di bioreattori Air-Wheel grande disponibilità (Figura 1). In contrasto bioreattori agitati cisterna, la girante verticale di questo unico reattore uso è attivata da un flusso di bolle di gas all'internoil vaso, che consente delicata ed uniforme miscelazione medio (Figura 2).

Protocol

1 Accesso

1. Accendere il bioreattore. Fare clic su un punto qualsiasi per aprire la pagina di login. Selezionare il nome utente e inserire la password e clicca su "Accedi".

2 Calibrazione

1. Calibrare sensore di pH (2 punti prima di autoclave).
2. Controllare il sensore di pH e confermare punta del sensore è piena di soluzione elettrolitica. Preparare due bicchieri con soluzioni di calibrazione pH (elettrolito) pH 4 e pH 7 e hanno a disposizione un flacone di lavaggio con acqua distillata.
3. Collegare il cavo pH al sensore di pH. Passare alla scheda "Azioni" sull'interfaccia Ciao e fare clic su "calibrazione". Inserisci temperatura del tampone nel campo Temp soluzione di calibrazione.
4. Inserire sensore pH in tampone 1 (pH 4) e inserire il valore nel campo "zero". Attendere che il grafico per stabilizzare e il tasto "1 calibrare" fare clic su. Sciacquare il sensore di pH con acqua distillata.
5. Sensore nel buffer di 2 (pH 7). Inserisci tampone2 valore nel campo "span". Attendere grafico per stabilizzare e fare clic su Calibra pulsante 2.
6. Fare clic su "Salva", quindi fare clic su "Chiudi".
7. Calibrare il sensore dell'ossigeno disciolto (DO).
8. Assicurarsi che il sensore DO è stato polarizzato essendo collegato al sistema per diverse ore. Passare alla scheda "Azioni" sull'interfaccia Ciao e fare clic su Calibra. Fare clic sul pulsante "DO A".
9. Scollegare il sensore DO e inserire 0 nel campo "zero". Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante "Calibrate 1" fare clic su.
10. Ricollegare il sensore DO e immettere 100 nel campo "Span". Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante "Calibrate 2" fare clic su.
11. Fare clic su "Salva", quindi fare clic su "Chiudi".

3. Autoclave ed installare i sensori e navi reagenti

1. Dopo la calibrazione, sensori posto e ben termico in AUTOCsacchetti Lave e autoclave per 30 minuti a 121 ° C, 15 psi.
2. Sterilizzare sacchetti autoclave con il 70% alcol isopropilico (IPA) e di trasferimento sacchetti di cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio esterno della nave.
3. Sterilizzare imballaggio interno con il 70% di IPA e trasferire nave cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio interno e ispezionare la nave e il tubo per i danni inflitti durante il trasporto.
4. Installare il pH e DO sensori delle due porte anteriori. Installare il pozzo termico alla porta posteriore sinistra. Aprire il tappo del sensore.
5. Guida sensore attraverso la porta del sensore. Infilare il sensore saldamente nella porta.
6. Trasferimento nave fuori BSC.
7. Appendere la cavi dei sensori di pH DO e fuori il manicotto nave e verificare che nulla è nel manicotto. Far scorrere la nave nella manica, i piedi prima.
8. Inserire con cautela il sensore di temperatura nel pozzo termico nave. Assicurarsi che il fondo del recipiente poggia contro i riscaldatori.
9. Rimuovereil tubo imposta dalle loro borse. Codice colore Corrispondenza sulla tubazione ai connettori corrispondenti e pompe sulla centralina bioreattore.
10. Installare la linea principale del gas premendo il connettore nella sua presa di gas. Installare la linea del gas micro ruotando in senso orario il connettore nella presa del gas. Installare il tubo di scarico del filtro:
11. Aprire il forno del filtro. Fissare il filtro di scarico sul canale U per cui il suo tubo passa attraverso i due ganci al filtro e fuori del forno.
12. Installare il tubo dal sacchetto condensatore nel supporto tubo. Chiudere la porta.
13. Itinerario linee di addizione A e B, entrambe le linee di media, e la linea raccolto dietro il sensore DO e sulla panca accanto alla centralina bioreattore.
14. Collegare i cavi ai sensori DO e pH.

4. Aggiunta Medie e Micro-vettori

1. Passare alla scheda "Azioni" e cliccare su "Controllo Pompe" sull'interfaccia computer.
2. Formare una Stericollegamento tra le linea inutilizzato mezzo oltre (1 banda arancione) e il supporto di origine flacone / sacca saldando il tubo o con raccordi Luer.
3. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa media su. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare il supporto pompa spenta dopo l'aggiunta desiderata quantità di mezzo.
4. Mettere microcarrier perline in Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} libero PBS per 3 ore a temperatura ambiente.
5. Lavare più volte con perline Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} libero PBS.
6. Autoclave per 15 minuti a 115 ° C, 15 psi.
   NOTA: Aggiungere 3 g / L (peso a secco) in questo esperimento.
7. Pompa a micro-vettori che sono stati idratati, lavati e sterilizzati in autoclave nel reattore nello stesso modo è stato aggiunto il mezzo nel passaggio 4.1.

5. equilibrazione e One-punto di calibrazione DO

1. Impostare i controller per Auto e immettere i valori di riferimento desiderati. Qui, utilizzare Agitazione Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Attendere il parametri equilibrare.
2. Confermare sensore è completamente polarizzata. Confermare il valore attuale DO si è stabilizzato.
3. Passare alla scheda "Azioni" e cliccare su "calibrazione". Fare clic su "DO A", fare clic su "One-point".
4. Immettere '100' nel campo "Span". Fare clic sul pulsante "Calibra 1", cliccare su "Salva" e cliccare su "close":

6 Avvio di una corsa

1. Passare alla scheda Azioni. Fare clic su "Batch". Utilizzare la tastiera su schermo o una tastiera esterna per immettere un nome lotto di 16 caratteri o meno.
2. Fare clic sul pulsante "Nascondi" della tastiera su schermo. Fare clic su "Avvia partita" confermare facendo clic su "Start" nella sovrapposizione.

7 Inoculare con celle

1. Formare una connessione sterile tra una linea non utilizzata Oltre media (1 banda arancione) e la bottiglia di cellule / fonte bag mediante saldaturail tubo o utilizzando i raccordi Luer.
2. Installare la sezione in silicone del tubo nella pompa media in modo che la freccia verso il tubo tra la pompa e serbatoio.
3. Controllare morsetto tubo è aperto e la sua fascetta tubi ramificati è chiuso. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa dei media e cliccare su "Off", dopo l'aggiunta di cellule.
4. Passare alla scheda "Azioni" e cliccare su "Pompe di controllo".

8 Campionamento

1. Dopo inoculazione e la frequenza che desidera monitorare la cultura, estrarre un campione dalla cultura nel modo seguente:
2. Passare alla scheda "azioni" e fare clic su "prendere esempio". Posizionare il tubo di campionamento nella pompa di campionamento e manipolare il rubinetto di campionamento in base alle istruzioni visualizzate sullo schermo.
3. Eseguire almeno una osservazione al microscopio ogni giorno e conta delle cellule su questi campioni.
4. Quando le cellule hanno raggiunto la densità desiderata, in questo case 1,2 x 10 ⁶ cellule / ml, di infettare le cellule con l'aggiunta di un inoculo del virus.
5. Aggiungere asetticamente l'inoculo di una siringa da 20 ml, e collegare la siringa ad una delle porte di addizione pezzi sul reattore. Introdurre l'inoculo al reattore premendo sullo stantuffo della siringa.
6. Continuare campionamento e l'analisi della cultura per il adenovirus concentrazione di particelle intracellulare.

Representative Results

Nella Figura 3, sono indicati i parametri per l'inizio della corsa bioreattore. Questa figura mostra la schermata prima di impostare i parametri di temperatura, ossigeno disciolto, pH e agitazione. Una volta che i parametri sono impostati, i parametri della corsa vengono continuamente monitorati e le regolazioni possono essere fatte per mantenere le condizioni richieste. Il software produce una lettura continua che permette una facile identificazione dei problemi. In questo esperimento utilizzando 2,5 L di DMEM contenente 10% FBS, 250 ppm di SAFC antischiuma C, 2 mm L-glutammina e 3 g / L di micro-portanti, il sistema è stabilizzato in modo che la percentuale di ossigeno è del 50%, la temperatura è di 37 ° C, e il pH è 7,2. Il reattore viene inoculato con cellule A549 ad una concentrazione di 7 x 10 ⁴ cellule / ml (o 10 cellule / micro-carrier). I parametri scelti per questa esecuzione comportato la maggior parte delle cellule aderenti alle micro-vettori in 2 ore (Figura 4). Dopo 12 ore, le cellule sono demonitrarsi segni di appiattimento e diffusione sulla superficie micro-portante (Figura 5). Entro 24 ore, micro-vettori hanno una distribuzione abbastanza uniforme della cellule, senza micro-vettori senza cellule e senza grandi ciuffi di celle micro-portanti (Figura 6). La percentuale di colonizzazione micro-carrier dalle cellule A549 è del 75% in 24 ore e 90% successivamente (Figura 7). Le cellule hanno continuato a crescere in modo esponenziale a ~ 1 milione di cellule / ml dopo 48 ore (Figura 8). Dopo l'infezione da una dose di adenovirus oncolitici (2 x 10 ⁸ virioni / ml) a 50 ore, la densità è aumentato a 1,2 milioni di cellule / ml e poi ha cominciato a diminuire, come l'infezione litica progredito. C'era ~ 10.000 volte amplificazione del inoculo virale.

In esperimenti precedenti, abbiamo trovato che il monitoraggio e la regolazione del flusso di gas è fondamentale per massimizzare la crescita delle cellule (dati non pubblicati). Rapidamente cellule in crescita possono esaurire il sistema di ossigeno con il livello DO cadere a zero. Mentre le cellule hanno continuato a crescere, era a un ritmo molto più lento. E 'fondamentale per controllare e regolare il flusso di ossigeno per soddisfare le esigenze di cella durante la fase di crescita logaritmica. Ogni corsa può essere analizzato per una crescita ottimale confrontando il pH, DO, e la temperatura con conta delle cellule quotidiane.

Figura 1. Fluidodinamica del pneumatico bioreattore System (PBS), rispetto a un serbatoio bioreattore agitatore misura parete forze di taglio in vari volumi reattori.

Figura 2 girante reattore Pneumatic Air-Wheel.

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Figura 3 Pneumatic Air Wheel software schermata di parametri di avviare la corsa bioreattore.

Figura 4 colonizzazione Micro-carrier con le cellule A549 2 ore dopo l'inoculazione. (Diametro medio di micro-carrier ~ 180 micron.) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 12 ore dopo l'inizio della cultura, le cellule A549 attribuiscono, appiattimento, e diffondendo sui micro-portanti.5highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Micro-portanti rivestiti con cellule dopo 24 ore di coltura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7 Percentuale di colonizzazione micro-carrier da parte delle cellule A549 post-inoculazione.

Figura 8 Il numero di cellule vitali A549 in coltura prima e dopo l'infezione con adenovirnoi. Notare che il punto infezione virale si è verificato a 50 ore.

Discussion

Questo sistema di bioreattore monouso è relativamente semplice da usare e fornisce analisi in tempo reale per il monitoraggio e l'analisi del reattore. E 'estremamente adatto per la coltura di cellule di mammiferi e insetti con densità di cellule che raggiungono oltre 30 milioni di cellule / ml. Oltre cellule A549 descritti in questo rapporto ^11, siamo cresciuti SF-9 cellule di insetto nel bioreattore pure. La miscelazione delicata fornito dalla ruota di aria pneumatica riduce il danno cellulare. Diversi passaggi sono fondamentali quando si imposta questo reattore. In primo luogo, la corretta calibrazione del pH e DO sensori è importante per il controllo ottimale della coltura e per l'aggiunta di reagenti per regolare il pH o l'ossigeno nel sistema. In secondo luogo, i flaconi dei reagenti e sementi devono essere riempiti e gli attacchi luer effettuate in ambiente sterile come una BSC. Una volta che i flaconi dei reagenti vengono spostati fuori dell'ambiente sterile, i collegamenti con le linee di alimentazione bioreattore devono essere fatte con cura per evitare la contaminazione microbica.

Il sistema di bioreattore pneumatico uso singola ha il potenziale per soddisfare molte delle attività di ricerca e applicazioni cliniche nel campo delle bioterapie, vaccini, cellule staminali e medicina personalizzata ^4. Inoltre, la flessibilità di questo sistema permette di batch, fed-batch, perfusione, e le applicazioni bioreattore trasfezione basate ^5. Infine, i sistemi di bioreattori monouso monouso hanno il potenziale per soddisfare le esigenze di larga scala la produzione industriale e di aderire alle linee guida e raccomandazioni di agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali ^6-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011