O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Introduction

Linhagens de células de mamíferos podem ser classificados em uma das três categorias com base em suas características de crescimento: as células que crescem em suspensão, as células que crescem como agregados, e as células que crescem ancorados a um substrato. Embora o biorreactor ar rodas demonstrado neste vídeo é capaz de crescer todos os três tipos de células, este vídeo vai demonstrar a utilização do biorreactor de cultivo de células dependentes de ancoragem em micro-transportadores. Células de mamíferos dependentes de ancoragem podem ser cultivadas para fins de produção de mais células - onde as próprias células são o produto. Por exemplo, derivadas da medula óssea as células estaminais mesenquimais humanas estão actualmente a ser cultivadas com a finalidade de recolher as células e injectando-os em tecido doente. O bioreactor pneumático demonstrado neste vídeo provou adequado para a produção de tais células estaminais mesenquimais para esta aplicação (Serra et al., Comunicação pessoal, 2013).

Anchorage depAs células de mamíferos são geralmente cultivadas endent pequena escala em recipientes de cultura em 2D, como placas de cultura de células, frascos de cultura de células, ou garrafas de rolo, onde eles aderem a uma superfície de crescimento especialmente tratado ^1. Quando as células são mais desejado, as placas ou frascos pode ser expandida através da utilização de mais ou maiores navios. No entanto, para o cultivo mais eficaz em termos de custos de grandes quantidades de células dependentes de ancoragem, aumentando a área de superfície para a fixação das células pode ser conseguida pela utilização de pequenas esferas sólidas chamados micro-transportadores. Dependendo das características de ligação da célula, vários tipos diferentes de micro-transportadores estão disponíveis comercialmente, tais como dextrano, péptido, ou colagénio revestido. Os micro-transportadores têm uma grande área de superfície em relação ao volume proporcionando uma maior área de superfície para o crescimento celular; e os micro-transportadores podem ser mantidas em suspensão, com agitação, o que permite que as células a ser cultivadas a elevadas densidades em sistemas de biorreactor ^2. Atualmente, os tipos de bioreactors onde as células aderentes são cultivadas em micro-veículos incluem frascos spinner e sistemas de tanque agitado, que utilizam rotores axiais para manter uma suspensão de células revestidas micro-portadores.

Vários fatores são importantes para o cultivo bem sucedido de células, incluindo a tensão de oxigênio, tensão de cisalhamento, matriz de superfície, e de nutrientes e as concentrações do metabolito. O uso de biorreatores permite o monitoramento em tempo real das condições de crescimento e potencial para significativamente mais baixos custos de produção ^1. Existem vários modelos de biorreatores comum para o cultivo in vitro de células, incluindo, suspensão agitada, girando navio parede, de fibra oca, saco de biorreator em uma plataforma central, e sistemas de leito fluidizado ^3. Muitos destes sistemas apresentam problemas específicos para o cultivo de células e escalar -up, como alto custo, gradientes de concentração de nutrientes, cisalhamento hidrodinâmico, agregação celular, e dificuldade de amostragem, monitoramento e controle cell scale-up.

Várias linhas de células aderentes são utilizados na produção de vírus, quer na produção de vacinas virais ou para a produção de vectores virais para as aplicações de terapia génica. Neste vídeo, utilizando o uso único pneumático (Ar-roda) do sistema biorreactor, que demonstram a cultura de células de carcinoma de pulmão humano (A549) em células de micro-transportadores para a produção de um adenovírus oncolítico. O desenho biorreator pneumático usa uma roda de agitação vertical que é alimentado pela flutuabilidade de gás aspergido na parte inferior do bioreactor. Este método suave agitação limita as forças de cisalhamento hidrodinâmicos, mas ainda garante ótima médio e célula de mistura ^4. Em comparação com o reactor de tanque com agitação, o reactor de pneumático tem uma baixa tensão de corte na parede, mesmo com grandes volumes de sistemas de reactores biológicos de ar-roda (Figura 1). Em contraste com o bio-reactores de tanque agitado, o rotor vertical de uso único, este reactor é ligado por uma corrente de bolhas de gás dentroo recipiente, o que permite uma suave e uniforme de mistura média (Figura 2).

Protocol

1. Entrar

1. Ligue o biorreator. Clique em qualquer lugar para abrir a página de login. Selecione o nome de usuário e digite a senha e clique em "Login".

2. Calibração

1. Calibre o sensor de pH (2 pontos antes da autoclavagem).
2. Inspeccionar sensor de pH e confirmar ponta do sensor é preenchido com uma solução de electrólito. Prepare dois copos com soluções de calibração pH (eletrólito) pH 4 e pH 7 e tem disponível um frasco de lavagem com água destilada.
3. Conectar o cabo de pH para o sensor de pH. Navegue até a guia "Ações" na interface Olá e clique em "calibrar". Digite temperatura tampão no campo Temp Solução de Calibração.
4. Colocar o sensor de pH em tampão 1 (pH 4) e inserir o valor no campo de "zero". Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique no botão "calibrar 1". Lavar o sensor de pH com água destilada.
5. Colocar o sensor em tampão 2 (pH 7). Digite o tampão2 valor no campo "span". Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique calibrar 2 botão.
6. Clique em "Salvar" e depois clique em "Fechar".
7. Calibre o sensor de oxigênio dissolvido (OD).
8. Verifique se o sensor de OD foi polarizada por ser ligado ao sistema por várias horas. Navegue até a guia "Ações" na interface Olá e clique em Calibrar. Clique no botão "FAZER A".
9. Desligue o sensor de OD e digite 0 no campo "zero". Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique no botão "Calibrar 1".
10. Volte a ligar o sensor de OD e digite 100 no campo "Span". Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique no botão "Calibrar 2".
11. Clique em "Salvar" e clique em "fechar".

3. autoclave e instalar sensores de e Vasos de reagente

1. Após a calibração, sensores lugar e bem térmica em autocbolsas e lave autoclave durante 30 minutos a 121 ° C, 15 psi.
2. Higienizar bolsas de autoclave com 70% de álcool isopropílico (IPA) e bolsas de transferência para cabine de segurança biológica (BSC). Retire a embalagem exterior do navio.
3. Higienizar embalagem interior com 70% IPA e transferir navio para cabine de segurança biológica (BSC). Remova a embalagem interior e inspeccionar o navio e tubos por danos causados ​​durante o transporte.
4. Instalar o pH e DO sensores nas duas portas dianteiras. Instale o bem térmica para a porta traseira esquerda. Abra a tampa do sensor.
5. Guie o sensor através da porta sensor. Passe o sensor com força na porta.
6. Navio Transferência de BSC.
7. Pendure o DO e cabos dos sensores de pH fora da manga vaso e verifique se não há nada na manga. Deslize o navio na manga, primeiro os pés.
8. Ajustar cuidadosamente o sensor de temperatura para o poço térmico navio. Certifique-se de que o fundo do recipiente, assenta contra os aquecedores.
9. Removera tubulação fixa de suas malas. Jogo codificação de cores na tubulação para os conectores correspondentes e bombas na unidade de controle biorreator.
10. Instale a tubulação de gás principal pressionando o conector na sua saída de gás. Instale a linha de gás micro rodando no sentido horário conector na saída de gás. Instale o tubo de filtro de exaustão:
11. Abra o forno filtro. Fixe o filtro de exaustão no canal U para que sua tubulação atravessa os dois ganchos para o filtro e sair do forno.
12. Instalar o tubo de bolsa condensador no suporte de tubagem. Feche a porta.
13. Rota linhas de adição A e B, ambas as linhas de comunicação social, e da linha de colheita por trás do sensor de OD e para o banco ao lado da unidade de controle biorreator.
14. Conecte os cabos dos sensores de OD e pH.

4. adição de meio e Micro-portadores

1. Navegue até a guia "ações" e clique em "Controle de Bombas" na interface do computador.
2. Forme um Sterile conexão entre uma linha não utilizado meio disso (1 faixa laranja) e da fonte de garrafa / saco médio por soldagem do tubo ou usar acessórios Luer.
3. Clique na barra deslizante para ligar a bomba de mídia on. Clique na barra para transformar a mídia bomba desligada após a adição desejado quantidade de meio.
4. Colocar em esferas microtransportadoras Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} livre de PBS durante 3 horas à temperatura ambiente.
5. Lavar grânulos várias vezes com Ca2 ^+, Mg2 ⁺ livre de PBS.
6. Autoclave durante 15 minutos a 115 ° C, 15 psi.
   NOTA: Adicionar 3 g / L (peso seco) nesta experiência.
7. Bomba em micro-transportadores que tenham sido hidratadas, lavado e autoclavado para o reactor da mesma forma que o meio foi adicionado no passo 4.1.

5. Equilíbrio e de um ponto FAZER Calibração

1. Defina os controladores para Auto e digite os setpoints desejados. Aqui, use Agitação Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Aguarde até que o pARÂMETROS equilibrar.
2. Confirmar sensor está totalmente polarizado. Confirme DO valor presente estabilizou.
3. Navegue até a guia "Ações" e clique em "calibrar". Clique em "fazer um" clique "de um ponto".
4. Digite "100" no campo "Span". Clique no botão "Calibrar 1", clique em "Save" e clique em "Fechar":

6 Iniciar uma execução

1. Navegue até a guia Ações. Clique em "Batch". Use o teclado na tela ou um teclado externo para digitar um nome de lote 16 caracteres ou menos.
2. Clique no botão "Hide" do teclado no ecrã. Clique no botão "Iniciar lote" confirmar clicando em "Iniciar" na sobreposição.

7 Inocular com células

1. Formar uma conexão estéril entre um (1 banda de laranja) não utilizado linha além médio ea / source garrafa saco célula por meio de soldadurao tubo ou usar os acessórios Luer.
2. Instale a seção de silicone da tubulação na bomba de mídia para que a seta aponta para a tubulação entre a bomba eo reservatório.
3. Verifique braçadeira tubo é aberto e sua braçadeira de tubulação ramificada está fechado. Clique no controle deslizante para ligar a bomba de mídia on e clique em "Off" após a adição de células.
4. Navegue até a guia "Ações" e clique em "Bombas de controle".

8 Amostragem

1. Após inoculação e tão frequentemente quanto desejado para monitorar a cultura, retirar uma amostra a partir da cultura da seguinte forma:
2. Navegue até a guia "ações" e clique em "tomar de exemplo". Coloque o tubo de amostragem na bomba de amostragem e manipular a válvula de amostragem de acordo com as instruções na tela.
3. Realizar pelo menos uma observação microscópica diária e contagem de células nesses exemplos.
4. Quando as células atingiram a densidade desejada, neste case de 1,2 x 10 ⁶ células / ml, infectar as células com a adição de um inoculo de vírus.
5. Adicionar assepticamente o inoculo para uma seringa de 20 ml, e ligar a seringa para uma das portas de adição de peças no reactor. Introduzir o inoculo para o reactor por meio de pressão sobre o êmbolo da seringa.
6. Continuar a amostragem e análise da cultura para a concentração intracelular de partículas de adenovírus.

Representative Results

Na Figura 3, os parâmetros para o início de funcionamento do bioreactor são mostrados. Esta figura mostra a tela antes de definir os parâmetros de temperatura, oxigênio dissolvido, pH e agitação. Uma vez que os parâmetros são definidos, os parâmetros de execução são continuamente monitoradas e ajustes podem ser feitos para manter as condições exigidas. O software produz uma leitura contínua, que permite a fácil identificação de problemas. Neste experimento usando 2,5 L de DMEM contendo 10% de FBS, 250 ppm de RdC Anti-espuma C, 2 mm, L-glutamina e 3 g / L de micro-transportadores, o sistema é estabilizado assim a percentagem de oxigénio é de 50%, o temperatura é de 37 ° C, e o pH é 7,2. O reactor é inoculado com células A549 a uma concentração de 7 x 10 ⁴ células / ml (ou 10 células / micro-transportador). Os parâmetros escolhidos para esta corrida resultaram na maioria das células que aderiram às micro-transportadores dentro de 2 horas (Figura 4). Após 12 horas, as células são demôniostrating sinais de achatamento e espalhando sobre a superfície da micro-transportador (Figura 5). Por 24 horas, micro-portadores têm uma distribuição relativamente uniforme de células, sem micro-operadoras sem células e sem grandes aglomerados de células no micro-transportadoras (Figura 6). A percentagem de colonização de micro-transportador de células A549 é de 75% em 24 horas e 90% em seguida (Figura 7). As células continuou a crescer exponencialmente a ~ 1 milhão de células / ml, após 48 horas (Figura 8). Após a infecção por uma dose de adenovírus oncolítico (2 x 10 ⁸ viriões / ml) a 50 h, o aumento da densidade de 1,2 milhões de células / ml e depois começou a diminuir à medida que a infecção progrediu lítico. Houve ~ 10000 vezes amplificação do inoculo virai.

Em experiências anteriores, verificou-se que a monitorização e ajuste de fluxo de gás é crítico para a maximização do crescimento de células (dados não publicados). Rapidamente células de crescimento pode esgotar o sistema de oxigênio com o nível de OD de cair para zero. Enquanto as células continuaram a crescer, foi a uma taxa muito mais lenta. É fundamental para monitorar e ajustar o fluxo de oxigênio para atender as demandas de células durante a fase logarítmica de crescimento. Cada corrida pode ser analisado para o crescimento ideal comparando o pH, OD e temperatura com a contagem de células diárias.

Figura 1: Dinâmica dos fluidos do biorreator sistema pneumático (PBS) em comparação com um biorreator tanque agitador medir forças de cisalhamento de parede em vários volumes de reatores.

Figura 2 impulsor reator pneumático Air-Wheel.

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Figura 3 Pneumático Roda screen shot de parâmetros de software para iniciar o biorreator prazo.

Figura 4 colonização Micro-portadora com células A549 2 horas após a inoculação. (Média de diâmetro micro-carrier ~ 180 m.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 12 h após o início da cultura, as células A549 são anexando, achatamento, e espalhando sobre os micro-transportadores."Target =" 5highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Micro-portadores revestidas com células após 24 horas de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 Percentagem de colonização de micro-transportador de células A549 após a inoculação.

Figura 8 O número de células A549 viáveis ​​em cultura de pré e pós-infecção com adenovirnos. Note-se que o passo de infecção virai ocorreu em 50 horas.

Discussion

Este sistema de biorreatores de uso único é relativamente simples de usar e oferece análises em tempo real para o acompanhamento e análise do reator. É extremamente bem adequado para a cultura de células de mamíferos e insetos com densidades celulares atingindo mais de 30 milhões de células / ml. Além de células A549 descrito neste relatório ^11, que cresceram células SF-9 de insecto em bioreactor bem. A mistura suave fornecido pela roda pneumática reduz os danos celulares. Vários passos são fundamentais quando configurou este reator. Primeiro calibração, adequado do pH e DO sensores é importante para a monitorização óptima da cultura e para a adição de reagentes para ajustar o pH, ou o oxigénio no sistema. Em segundo lugar, as garrafas de reagente e de sementes devem ser preenchidos e os acessórios luer feito num ambiente estéril, tal como um BSC. Uma vez que os frascos de reagentes são movidos para fora do ambiente estéril, as conexões com as linhas de alimentação de biorreatores deve ser feita com cuidado para evitar a contaminação microbiana.

O uso único sistema biorreator pneumático tem o potencial de atender a muitas das pesquisas e aplicações clínicas nas áreas de biotherapeutics, vacinas, células-tronco e medicina personalizada ^4. Além disso, a flexibilidade do sistema permite Batch, Fed-batch, Perfusão, e transfecção aplicações baseadas biorreator ^5. Finalmente, de uso único sistemas de biorreatores descartáveis ​​têm o potencial para atender às necessidades da produção industrial em grande escala e para aderir às diretrizes e recomendações dos órgãos reguladores nacionais e internacionais ^6-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 3	PBS
Single Use Assembly	PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549)	ATCC	CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers	GE	3781
Antifoam C	Sigma	A8011