Introduction
Süspansiyon içinde büyümeye hücreleri, agregat Çoğalan hücreler, ve hücreler, bir alt-tabakaya sabitlenmiş yükselmektedir memeli hücre soyları büyüme özelliklerine göre üç kategoriye ayrılabilir. Bu video gösterilen hava tekerlekli biyoreaktör hücrelerin her üç tip büyümeye mümkün olsa da, bu video mikro-taşıyıcılar üzerinde ankoraj-bağımlı hücreleri büyütmek için bioreaktörün kullanımını gösterecektir. , Hücreler ürünü - ankoraj-bağımlı hücreleri daha memeli hücreleri üretmek amacıyla yetiştirilebilir. Örneğin, insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök ile henüz hücrelerin hasat edilmesi ve hastalıklı doku içine enjekte edilmesi ile yetiştirilmektedir. Bu video gösterilen pnömatik biyoreaktör bu uygulama için bu tür mezenkimal kök hücrelerin üretilmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır (Serra et al., Kişisel iletişim, 2013).
Anchorage dependent memeli hücreleri, tipik olarak, özel bir muamele edilmiş büyüme yüzeyi 1 'e uygun hücre kültür plakaları, hücre kültürü şişeleri veya silindir şişelerde, 2B kültür kabına küçük çaplı büyütülür. Daha fazla hücre arzu edildiği zaman, ya da plakalar, şişeler daha fazla ya da daha büyük damarların kullanılarak genişletilebilir. Bununla birlikte, daha düşük maliyetli bir ankoraj-bağımlı hücrelerin büyük miktarlarda kültivasyonu, hücre bağlanması için yüzey alanını artırmak için gerekli mikro-taşıyıcılar olarak adlandırılan küçük bir katı boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücrenin bağlanma özelliklerine bağlı olarak, mikro-taşıyıcılar birden fazla değişik tipte örneğin kaplanmış dekstran, peptid, ya da kolajen gibi, ticari olarak temin edilebilir. Mikro taşıyıcılar, hücre büyümesi için daha geniş bir yüzey alanı hacim oranı sağlamak için geniş bir yüzey alanına sahiptir; ve mikro taşıyıcılar, hücreler biyoreaktör de 2 yüksek yoğunluklarda kültive edilmesini sağlar çalkalama ile süspansiyon içinde muhafaza edilebilir. Biorea Şu anda, türleriyapışık hücreler mikro-taşıyıcılar üzerinde yetiştirilen ctors hücre kaplı mikro-taşıyıcı süspansiyonu sağlamak için eksenel pervaneler kullanır döndürme şişeleri ve karıştırılmıştır tankı sistemleri içerir.
Çeşitli faktörler, oksijen gerilimi, kesme stresi, yüzey matris ve bir gıda maddesi ve metabolit konsantrasyonları dahil olmak üzere, hücrelerin başarılı bir şekilde ekimi için önemlidir. Biyoreaktörler kullanılması, gerçek zamanlı büyüme koşullarının izlenmesi ve önemli ölçüde daha düşük üretim maliyetleri 1'e potansiyeli sağlar. Dahil olmak üzere, in vitro hücre ekimi, karıştırılmış bir süspansiyona, dönen duvar kap, içi boş elyaf, bir rocker platformunda torba biyoreaktör ve akışkan yataklı sistemler 3 birçok ortak biyo-reaktör tasarımları vardır. Bu sistemlerin birçoğu gibi yüksek maliyet besin konsantrasyonu geçişlerini, hidrodinamik kesme, hücre toplama ve zorluk örnekleme, izleme ve kontrol cel gibi, hücre ekimi için benzersiz sorunları sunmak ve -up ölçekl ölçek-up.
Çeşitli yapışık hücre çizgileri, viral aşıların üretimi veya gen terapi uygulamaları için viral vektörlerin üretimi için ya da, virüs üretiminde kullanılmaktadır. Bu video, tek kullanımlık hava basınçlı (Hava Tekerlek) biyoreaktör sistemi kullanılarak, insan akciğer kanser hücreleri (A549) bir onkolitik adenovirüsün üretimi için mikro-taşıyıcılar üzerinde hücre kültürünü göstermektedir. Pnömatik biyoreaktör tasarımı bioreaktörün dibine serpilmiştir gaz kaldırma kuvveti tarafından desteklenmektedir dikey bir çalkalama tekerlek kullanır. Bu nazik Karıştırma yöntemi hidrodinamik kesme kuvvetleri sınırlar, ama yine de iyi, orta ve hücre 4 karıştırma sağlar. Karıştırılmakta olan tank reaktörden ile karşılaştırıldığında, pnömatik reaktör daha yüksek hacimli hava Teker biyoreaktör sistemleri (Şekil 1) olarak düşük duvar kesme stresine sahip bulunmaktadır. Karıştıran tank biçimindeki bioreaktörlerde aksine, bu tek kullanımlık reaktörün dikey itici gaz kabarcıklarının akışı içinde tarafından açıldığındaYumuşak ve düzgün karıştırma ortamı (Şekil 2) sağlayan kabından oluşur.
Protocol
1. Giriş
- Biyoreaktör kadar güç. Giriş sayfasını açmak için herhangi bir yere tıklayın. Kullanıcı adı seçin ve parolanızı girin ve "Giriş" e tıklayınız.
2. Kalibrasyon
- PH sensörü (önceki otoklav 2 puan) kalibre.
- PH sensörü kontrol edin ve sensör ucu elektrolit solüsyonu ile doldurulur onaylayın. PH kalibrasyon çözeltiler (elektrolit), pH 4 ve pH 7 ile beher iki hazırlayın ve damıtılmış su ile uygun bir yıkama şişe.
- PH sensörü, pH kablosunu bağlayın. Merhaba arayüzünde "Eylemler" sekmesine gidin ve "kalibre" tıklayın. Kalibrasyon Çözüm Temp alanına tampon sıcaklığını girin.
- Tamponu 1 (pH 4) pH sensörü yerleştirin ve "sıfır" alanına değer girin. Stabilize grafiği bekleyin ve "kalibre 1" butonuna tıklayın. Damıtılmış su ile pH sensörü durulayın.
- Tampon içinde yer sensör 2 (pH 7). Tampon girin"Yayılma" alanında 2 değer. Stabilize ve 2 düğmesine kalibre tıklayın grafiği bekleyin.
- "Kaydet" sonra "Kapat" tıklatın.
- Çözünmüş Oksijen (DO) sensörünü kalibre.
- DO sensörü sağlamak birkaç saat sistemine bağlı olması ile polarize edilmiştir. Merhaba arayüzünde "Eylemler" sekmesine gidin ve kalibre tıklayın. "Bir DO" düğmesine tıklayın.
- DO sensörünü ayırın ve "sıfır" alanına 0 girin. Stabilize ve "Kalibre 1" butonuna tıklayın grafiği bekleyin.
- DO sensörünü takın ve "yayılma" alanına 100 girin. Stabilize ve "Kalibre 2" butonuna tıklayın grafiği bekleyin.
- "Kaydet" sonra "close" tıklatın.
3. Otoklav ve Install Sensörler ve Reaktif Gemiler
- AutoC kalibrasyon, yer sensörleri ve termal kuyuda sonrayıkamak poşetler ve 121 ° C, 15 psi'de 30 dakika süreyle otoklav.
- % 70 izopropil Alkol (IPA) ve biyolojik güvenlik kabini transfer torbalar (BSC) ile otoklav torbalar sanitize. Geminin dış ambalajı çıkarın.
- % 70 IPA ile iç ambalajların dezenfekte ve biyolojik güvenlik kabini (BSC) ile gemi aktarın. İç ambalajını çıkarın ve nakliye sırasında hasara için gemi ve boru inceleyin.
- PH takın ve iki ön limanlarında sensörleri DO. Sol arka kapısına termal kuyu yükleyin. Sensör kapağını açın.
- Sensör bağlantı noktası üzerinden sensörü Kılavuzu. Portuna sıkıca sensörünü geçirin.
- BSC üzerinden gemi aktarın.
- Damar kovan dışında DO ve pH sensörü kablolarını asın ve hiçbir şey kovanı olduğunu kontrol edin. Ilk olarak, kovan içine ayak kabı kaydırın.
- Dikkatlice Kabın termal kuyuya sıcaklık sensörü uygun. Teknenin tabanına dayanacak ısıtıcılar emin olun.
- Kaldırboru kendi çanta ayarlar. Biyoreaktör kontrol ünitesindeki ilgili konnektörleri ve pompalara boru üzerine Maç renk kodlaması.
- Doğalgaz prize konektörü basarak ana gaz hattını takın. Gaz prize konektörü saat yönünde bükerek mikro gaz hattını takın. Egzoz filtre boru yükleyin:
- Filtre Fırını açın. Onun boru filtre ve fırın dışında iki kanca geçer böylece U-kanal egzoz filtresini sabitleyin.
- Boru tutucu kondansatör torba ile boruyu takın. Kapıyı kapatın.
- Sonraki biyoreaktör kontrol ünitesine Yol ekleme hatları A ve B, hem medya hem de çizgiler ve DO sensörü arkasında tezgah üzerine hasat hattı.
- DO ve pH sensörlere kablolarını bağlayın.
4. Ekleme Orta ve Mikro-taşıyıcılar
- "Eylemler" sekmesine gidin ve tıklayın bilgisayar arayüzü "Denetim Pompalar".
- Bir Steri FormKullanılmayan bir orta ilave hat (1 portakal bant) ve tüp kaynak veya luer bağlantı parçaları kullanılarak orta şişe / çanta kaynağı arasındaki le bağlantısı.
- Ortam pompa açmak için kaydırıcıyı tıklayın. Medya ortamının eklenmesi istenilen miktarda sonra pompa kapalı kapatmak için kaydırıcıyı tıklayın.
- Oda sıcaklığında 3 saat boyunca, Ca2 +, Mg + 2 serbest PBS mikrotaşıyıcı boncuklar yerleştirin.
- Yıkama Ca 2 +, Mg 2 + ücretsiz PBS ile birkaç kez boncuk.
- 115 ° C, 15 psi'de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır.
NOT: Bu deneyde 3 g / L, (kuru ağırlık) ekleyin. - , Sulu yıkandı ve ortam, aşama 4.1 'de ilave edildi aynı şekilde reaktöre otoklave edilmiş mikro-taşıyıcılar pompalama.
5. Dengeleme ve Tek-nokta kalibrasyon DO
- Otomatik kontrolörleri ayarlayın ve istenilen ayar noktalarını girin. Burada, Ajitasyon Set Point (SP) = 15 rpm, sıcaklık SP = kullanmak 37.0 ° C, pH = 7.2, =% 100 DO. P bekleyinarameters dengelenmesi için akmaktadır.
- Sensörünü onaylamak tamamen polarize olduğunu. DO bugünkü değeri onaylayın stabilize.
- "Eylemler" sekmesine gidin ve "kalibre" tıklayın. "Tek nokta" tıklayın, "DO A" tıklayın.
- "Açıklık" alanına '100' girin. , Tıklayın "Save" ve "Kapat" düğmesini tıklatın "Kalibre 1" düğmesine tıklayın:
6. Çalıştır Başlangıç
- Eylemler sekmesine gidin. "Toplu" ı tıklayın. Toplu adı 16 karakter veya daha az girmek için ekran klavyesini veya harici bir klavye kullanın.
- Ekrandaki klavyenizin "Hide" butonuna tıklayın. "Toplu Başlat" overlay "Başlat" tıklayarak onaylayın tıklayın.
7. Hücreleri ile inoküle
- Kaynak tarafından kullanılmayan bir ortam ilavesi hattı (1 turuncu bant dışı) arasında steril bir birleşme ve hücre şişe / torba kaynak FormLuer parçaları kullanarak boru veya.
- Pompa ve tank arasındaki borular doğru ok noktalarına kadar ortam pompa hortumunun silikon bölüm takın.
- Boru kelepçesi edin açıktır ve dallı boru kelepçesi kapalıdır. Ortam pompa açmak ve hücreleri ekledikten sonra "Off" tıklayın kaydırıcısını tıklayın.
- "Eylemler" sekmesine gidin ve "Denetim Pompalar" tıklatın.
8. Örnekleme
- Sık kültürü izlemek için arzu edildiği gibi inoküle edilmesi ve sonra, aşağıdaki şekilde, bu kültürden örneği almak:
- "Eylemler" sekmesine gidin ve "örnek almak" tıklayın. Örnekleme pompaya örnekleme boru yerleştirin ve ekrandaki talimatlara göre örnekleme stopcock manipüle.
- Bu örnekler en az bir gün mikroskopik gözlem ve hücre sayımı gerçekleştirin.
- Hücreleri bu c istenilen yoğunluğa ulaştığında,1.2 x 10 6 hücre / ml 'ase bir virüs aşı ilavesi ile hücreleri enfekte etmektedir.
- Aseptik 20 ml'lik bir şırınga inokulum ekleyin ve reaktörün boş bir ek bağlantı noktalarından birine şırınga bağlayın. Şırınga pistonu basarak reaktöre inokulum tanıtılması.
- Örnekleme Devam ve adenovirüs hücre içi partikül konsantrasyonu için kültürünü analiz.
Representative Results
Şekil 3'te, biyoreaktör çalıştırmak başlatılması için parametreler gösterilir. Bu rakam sıcaklık, çözünmüş oksijen, pH ve ajitasyon parametreleri ayarlayarak önce ekranını gösterir. Parametreleri ayarlandıktan sonra, çalışma parametreleri sürekli olarak takip edilmekte ve ayarlamalar gerekli koşulları korumak için yapılabilir. Yazılım sorunları kolay tanımlanması için izin veren bir sürekli okuma üretir. DMEM,% 10 FBS, SAFC anti-köpük C, 250 ppm, 2 mM L-glutamin ve 3 g / mikro-taşıyıcı L ihtiva eden 2.5 ml kullanarak bu deneyde, sistem o kadar oksijen yüzdesi% 50, bir stabilize sıcaklık 37 ° C ve pH 7.2. Reaktör 10 x 7 4 hücre / ml (ve / veya mikro-taşıyıcı 10 hücre) bir konsantrasyonda A549 hücreleri ile aşılanır. Bu çalışma için seçilen parametreler, 2 saat (Şekil 4) bulunan mikro-taşıyıcılar yapışan hücrelerin çoğunluğunda sonuçlandı. 12 saat sonra, hücreler şeytan(Şekil 5) ve düzleşme mikro taşıyıcı yüzeye yayılması ve süzücü işaretler. 24 saatin sonunda, mikro-taşıyıcıların (Şekil 6) hücreleri olmadan mikro taşıyıcı ve mikro-taşıyıcılar üzerinde hücrelerin herhangi bir iri kümeleri ile hücrelerin nispeten daha dağılımı vardır. A549 hücrelerinin mikro-taşıyıcı kolonizasyon yüzdesi, 24 saat ve daha sonra% 90 (Şekil 7) ile% 75 olduğu. Hücreler, 48 saat (Şekil 8) sonra ~ 1000000 hücre / ml olacak şekilde katlanarak büyümeye devam etti. 50 saat sonra, onkolitik adenovirüs ile (2 x 10 8 virionlar / ml) bir dozu ile enfeksiyondan sonra, yoğunluk mi 1.200.000 hücre / yükseldi ve daha sonra litik enfeksiyon ilerledikçe düşmeye başladı. Viral inokülüm ~ 10.000 kat büyütme oldu.
Önceki deneylerde, gaz akışı izleme ve uyarlama hücre büyümesi (yayınlanmamış veriler) üst düzeye çıkarmak için önemli olduğunu bulduk. Hızla büyüyen hücreleri oksijen sistemi ile tüketebilir sıfıra bırakarak DO seviyesi. Hücreler büyümeye devam ederken, çok daha yavaş bir oranda olmuştur. Izlemek ve logaritmik büyüme fazı sırasında hücre taleplerini karşılamak için oksijen akışını ayarlamak için kritik öneme sahiptir. Her çalışma, günlük hücre sayısı ile pH, DO ve sıcaklık karşılaştırarak optimum büyüme için analiz edilebilir.
Reaktör çeşitli hacimlerde duvar kayma kuvvetlerini ölçen bir karıştırıcı bioreaktör kıyasla Pnömatik Biyoreaktör Sistemi (PBS) Şekil 1. Akışkan dinamiği.
Şekil 2. Pnömatik-Tekerlek reaktör çark.
52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Biyoreaktör Çalışmayı başlatmak için parametrelerin 3. Pnömatik Tekerlek yazılım ekran görüntüsü Şekil.
A549 hücreleri 2 saat Aşıdan ile Şekil 4. Mikro-taşıyıcı kolonizasyon. (Ortalama mikro-taşıyıcı çapı ~ 180 mikron.) Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. 12 saat kültürünün başlatılmasından sonra, A549 hücreleri, bağlama düzleştirme ve mikro-taşıyıcılar üzerine yayılmaktadır.5highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kültüründe 24 saat sonra hücreler ile kaplanmış Şekil 6. Mikro-taşıyıcılar. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
A549 hücreleri tarafından mikro-taşıyıcı kolonizasyon Şekil 7. yüzdesi aşılamadan.
Şekil 8. adenovir ile kültür öncesi canlı A549 hücrelerinin sayısı ve Enfeksiyondanbize. viral enfeksiyon adım 50 saatte meydana unutmayın.
Discussion
Bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin kullanımı nispeten basittir ve reaktör izleme ve analiz için gerçek zamanlı bir analiz içerir. Bu, son derece iyi 30000000 fazla hücre / ml hücre yoğunluğu ile ulaşan memeli ve böcek hücre kültürü için uygundur. A549 hücreleri, bu raporda 11'de tarif yanı sıra, hem de biyoreaktör SF-9 böcek hücreleri büyüdü. Pnömatik hava tekerleği tarafından sağlanan nazik karıştırma hücre hasarı azaltır. Bu reaktör kurarken birkaç adım önemlidir. İlk olarak, uygun bir pH kalibrasyonu ve sensörler kültür uygun izlenmesi için ve pH-değerini ya da sistemde oksijen ayarlamak için reaktifler ilave önemlidir DO. İkinci olarak, reaktif ve tohum şişe doldurulmuş ve diş ek bir BSC gibi, steril bir ortamda yapılmalıdır. Reaktif şişeleri steril ortamda dışına taşındı sonra, biyoreaktör besleme hatlarına bağlantıları mikrobik kontaminasyonu önlemek için dikkatle yapılmalıdır.
Tek kullanım için pnömatik biyoreaktör sistemi hücreleri, araştırma ve Biotherapeutics, aşıların alanda klinik uygulamaların bir çoğu yerine kök potansiyel ve kişiselleştirilmiş ilaç 4 sahiptir. Buna ek olarak, bu sistemin esnekliği Batch, ilaveli-fasılalı, serpme, ve transfeksiyonu göre biyoreaktör uygulamalar 5 sağlar. Son olarak, tek kullanımlık biyoreaktör sistemi potansiyeli taşıdığıbüyük ölçekli sanayi üretim ihtiyaçlarını karşılamak için kurallar ve ulusal ve uluslararası düzenleyici kurumlar 6-10 tavsiyelerine uymak için TIAL.
Disclosures
Yazarlar D. Giroux ve Y. Hashimura Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten PBS Biotech çalışanlarıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 3 | PBS | ||
| Single Use Assembly | PBS | ||
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
- Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
- Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
- Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).
- Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
- Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
- Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
- DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
- Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).
- Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors (2012).
- Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).
