Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.
Abstract
Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die effiziente Erstellung Integration freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus dem peripheren Blut mit episomalen Plasmiden und Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitoren. Die Vorteile dieses Ansatzes sind: (1) die Verwendung einer minimalen Menge von peripherem Blut als Ausgangsmaterial; (2) nonintegrating Umprogrammierung Vektoren; (3) eine kostengünstige Methode zur Erzeugung von Vektor freien iPSCs; (4) einen einzigen Transfektion; und (5) die Verwendung von kleinen Molekülen an epigenetische Neuprogrammierung zu erleichtern. Kurz gesagt, werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von Routine Phlebotomie Proben isoliert und dann in einem definierten Wachstumsfaktoren kultiviert, um eine hoch proliferativen Erythrozytenvorläuferzellpopulation, die bemerkenswert zugänglich Umprogrammierung ergeben. Nonintegrating, nontransmissible episomalen Plasmiden OCT4, SOX2, KLF4, MycL, LIN28A und eine p53 short hairpin (sh) RNA sind Einfühüber eine einzige Nukleofektion in den abgeleiteten Erythroblasten ced. Kotransfektion Episom das Enhanced Green Fluorescent Protein exprimiert (eGFP) ermöglicht die einfache Identifizierung von transfizierten Zellen. Eine separate replikationsdefizienten Plasmid, Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) ebenfalls zu dem Reaktionsgemisch für eine erhöhte Expression von Proteinen episomal zugegeben. Die transfizierten Zellen werden dann auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten (iMEFs) zum fort Umprogrammierung plattiert. Sobald iPSC artige Kolonien erscheinen etwa zwölf Tage nach Nukleofektion, sind HDAC-Inhibitoren zu dem Medium gegeben, um epigenetische Umbau erleichtert. Wir haben gefunden, dass der Einschluss von HDAC-Inhibitoren routine erhöht die Entwicklung vollständig reprogrammiert iPSC Kolonien das 2-fache. Sobald iPSC Kolonien zeigen typischen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Morphologie, sie sanft zu einzelnen IMEF beschichteten Gewebekulturplatten für das weitere Wachstum und die Expansion übertragen werden.
Introduction
iPS-Zellen werden aus somatischen Geweben über ektopische Expression von einem minimalen Satz von Pluripotenz-Gene abgeleitet. Diese Technik wurde ursprünglich von retroviralen Transduktion von humanen Fibroblasten mit OCT4, SOX2, KLF4 und cMYC, die besonders in den pluripotenten Zustand 1 ausgedrückt werden demonstriert. Diese transient exprimiert "Reprogrammierungsfaktoren" alter epigenetische Landschaft und Genexpressionsprofil der Zielzelle analog zu menschlichen embryonalen Stammzellen 2. Einmal erstellt, können iPS-Zellen potenziell in jede Gewebeart zur weiteren Untersuchung differenziert werden. So halten sie versprechen für den Einsatz in der regenerativen Medizin, Krankheitsmodelle und Gentherapieanwendungen. , Stören das Genom mit der Integration von Viren hat jedoch das Potenzial, um die endogene Genexpression beeinflussen zelluläre Phänotyp zu ändern und letztendlich vorspannen wissenschaftlichen Ergebnissen. Darüber hinaus können Zufalls virale Integrationen zu schädlichen Zell e führenUSWIRKUNGEN, einschließlich der Möglichkeit der malignen Transformation 3 oder Wieder Expression der Transgene onkogenen 4. Zukünftige klinische Anwendungen benötigen nicht-integrierenden iPSC Generation.
Episomen, die zusätzliche chromosomale zirkuläre DNA-Moleküle sind, bieten eine Strategie, um kostengünstige, Integration freien IPSCs 5 zu erzeugen. Die Kombination von in Tabelle 1 gezeigt episomalen Vektoren auszudrücken das Reprogrammierungsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4, MycL und LIN28A. Die pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-Plasmid enthält auch eine p53 shRNA für temporäre Unterdrückung der TP53 an zelluläre Reprogrammierung 6 verbessern. Die replikationsdefizienten pCXWB-EBNA1-Vektor fördert Amplifikation Reprogrammierungsfaktoren und erhöhte Effizienz Neuprogrammierung durch eine vorübergehende Erhöhung der Expression EBNA1 7. Die pCXLE_EGFP Plasmid kann zum Nukleofektion Gemisch zum Zwecke der dete hinzugefügt werdenrmining die Transfektionseffizienz oder zur Zellsortierung. Mit Ausnahme von p-CXWB EBNA1, die episomalen Plasmiden in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten den Epstein-Barr-Virus Ursprung der viralen Replikation und EBNA1-Gen, das die Replikation und Teilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle 8 zu vermitteln. Die Episomen spontan verlor aufeinander iPSC Expansion 7. Subklonierung und Charakterisierung von iPS-Zellen mit episomalen Vektor Verlust, die aus dem Verlust von eGFP Expression geschlossen werden kann, kann vollständig Integration kostenlos IPSCs für zukünftige klinische Anwendungen führen.
Inhärente dem Verfahren iPSC Generation Unterdrückung von linienspezifischen Genen und Reaktivierung von Pluripotenz-assoziierten Genen. Regulation der Genexpression erfolgt auf mehreren Ebenen innerhalb des Ringes, einschließlich Modifikationen an DNA und Chromatin Transkriptionsfaktoren erlauben, regulatorische DNA-Elemente, und die RNA-Polymerase den Zugang zu ZielGene. Umbau des epigenetischen Landschaft über weltweite Chromatinmodifikationen ist eine Schlüsselkomponente erneut Ausdruck der Pluripotenz genetische Programm. Eine spezifische Chromatin Modifikation, bei der Regulation der Genexpression wichtig ist, ist die Acetylierung von Histonen in bestimmten Lysinreste, die den Zugriff ermöglicht, um Gene durch die verringerte Spannung der Histon-DNA Spule Ziel. HDAC-Inhibitoren sind kleine Moleküle, die gezeigt haben, um iPSC Umprogrammierung und hESC Selbsterneuerung 9,10 erweitern, die wahrscheinlich auf die Unterstützung der acetylierten Zustand 11. Die nachfolgend beschriebene Protokoll aus einer früheren Veröffentlichung mit Integration Lentiviren 12 angepasst, bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur optimierten iPSC Generation aus dem peripheren Blut mit Episomen und HDAC-Inhibitoren. Die HDAC-Inhibitor-Konzentrationen werden dabei die Hälfte derjenigen von Ware et al. 9 und routinemäßig in eine 2-fache Zunahme in vollständig umprogrammiert iPSC Kolonien über Standard führtenepisomaler Umprogrammierung Protokolle ohne HDAC-Inhibitoren. Dieses Niveau der Umprogrammierung ist auf Augenhöhe mit der Effizienz beobachten wir mit lentiviralen Methoden. Mit diesem Protokoll haben wir effizient erzeugt iPSC von Einzelpersonen so alt wie 87 Jahre alt.
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Protocol
Eine schriftliche Einverständniserklärung, wie sie durch die Institutional Review Boards des Fred Hutchinson Cancer Research Center und die Kinder "s Hospital von Philadelphia genehmigt wurde von Patienten vor dem Sammeln peripheren Blutproben erhalten. Alle institutionellen Richtlinien festgestellt. Alle Tierversuche einschließlich MEF Erzeugung und Teratom Bildung wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Ficoll Separation von PBMCs und Ausbau der Erythroblasten - Tag 0
- Verdünnte peripheren Blut 1: 1 mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). In einem 15 ml Rundbodenpolystyrolröhrchen vorsichtig Schicht 7 ml des verdünnten Blutes auf 3 ml Raumtemperatur Ficoll-Hypaque.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 g für 30 min.
- Die PBMCs werden in die Grenzfläche zwischen dem Plasma und dem Ficoll-Hypaque, als trübe weiße Schicht gesehen niedergelassen haben. Mit einer sterilen Transferpipette, sammeln die PBMCs in einem 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie die Lautstärke auf 10 ml mit DPBS.
- Mit einem Hämazytometer, zähle die PBMCs.
- Pipette 2 × 10 6 PBMCs in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Spin-down die restlichen Zellen und Einfrieren bei einer Konzentration von 2 × 10 6 PBMC / ml in 90% fötalem Rinderserum (FBS) / 10% Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Bereiten Expansion Medium: QBSF-60 Serum freiem Medium (vor Licht schützen) + Penicillin / Streptomycin (1%) + Ascorbinsäure (50 ng / ml) + Stammzellfaktor (SCF, 50 ng / ml) + Interleukin 3 (IL 3, 10 ng / ml) + Erythropoietin (EPO, 2 U / ml) + Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + Dexamethason (1 uM; vor Licht schützen; auftauen einem anderen aliquoten Teil jedes Medium ändern).
- Resuspendieren 2 × 10 6 PBMCs in 2 ml frisch zubereitete Expansionsmedium und in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte legen und inkubieren in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2.
- An Tag 3 und Tag 6, ersetzen Medien.
- Sammeln Sie die Zellen und waschen die gut mit 2 ml QBSF-60, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand.
- Die Zellen in 2 ml neue Expansionsmedium und bringt sie auf den gleichen 12-Well-Platte.
2. Reprogrammierung Zellen durch Nucleofection - Tag 9
- Pipettieren Sie die Umprogrammierung Plasmide in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (Tabelle 1).
- Mischen Sie die Nukleofektion Lösung mit Supplement (vom Hersteller mitgeliefert) und Pipette in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Pipette 2 ml des Expansionsmediums in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) für die Äquilibrierung vor der Zugabe von Zellen.
- Sammeln Sie diekultivierten Zellen und waschen Sie die gut mit 2 ml QBSF-60, um die verbleibenden Zellen zu sammeln.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand.
- Die Zellen werden durch Resuspendieren in 5 ml DPBS und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min.
- Saugen Sie den Überstand.
- Zellpellet in 100 ul Nukleofektion Lösung + Beilage, wobei darauf zu Erzeugen von Blasen zu vermeiden.
- Pipettieren der Zellsuspension in die Röhre, die die Neuprogrammierung Plasmide, Pipette auf und ab sofort, und pipettieren die Probe in den unteren Bereich des Nukleofektion Küvette.
- Setzen Sie die Küvette in die Nukleofektion Maschine und Programm ausführen T-019.
- Übertragen Sie 100 ul der vorgewärmten Expansionsmedium (von der ausgleichenden Platte in Schritt 2.3) in die Nukleofektion Küvette.
- Sofort sammeln Sie das gesamte Probe und Einzahlung in den Brunnen der vorgewärmten Expansionsmedium. Vermeiden Sie das Sammeln der weiß, schwimm toten Zelltrümmer. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) zu wachsen.
3. Überzug Feeder-Zellen - Tag 10 oder 11
- Am Tag 10, Platte Feeder-Zellen.
- Coat ein 6-Well-Gewebekulturplatte mit Gelatine.
- Pipette 1 m von 0,1% Gelatine in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) in jede Vertiefung der Platte.
- Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator für mindestens 5 min.
- Unmittelbar vor dem Gebrauch absaugen Gelatinelösung von der Platte.
- Auftauen einer Ampulle von 2 × 10 6 embryonalen Maus-Fibroblasten mit 3000 cGy bestrahlt, in 10 ml vorgewärmtem MEF Medien (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + Penicillin / Streptomycin (1%)).
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min und saugen Sie den Überstand. Die Zellen in 12 ml MEF Medien und Pipette 2 ml inin jeder Vertiefung der mit Gelatine beschichtete 6-Well-Platte. Die Platte wird in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2), bis 12. Tag.
- Coat ein 6-Well-Gewebekulturplatte mit Gelatine.
4. Plattierzellen auf Feeder-Zellen und ändern Medium - Tag 12
- Sammeln Sie die nucleofected Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und sammeln Sie alle restlichen Zellen durch Waschen der gut mit 2 ml QBSF-60. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 xg für 5 min.
- Bereiten Reprogrammierung Medium: Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) + FBS (10%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, 1%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + β Mercaptoethanol (0,1 mm) + basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, fügte frisch bei Fütterung, 10 ng / ml) + Ascorbinsäure (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 50 ug / ml).
- Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 12 ml Reprogrammierung Medium. Pipette 2 ml pro Vertiefung der Zellsuspension inder 6-Well-Platte von Feederzellen (wie in Abschnitt 3 hergestellt). Zentrifugieren Sie die Platte bei 50 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC (5% O 2, 5% CO 2 und 90% N 2) zu wachsen. Ändern Sie die Umprogrammierung Medium jeden zweiten Tag, bis iPSC Kolonien beginnen erscheinen (1-2 Wochen).
- Bereiten hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum Replacement (20%) + Penicillin / Streptomycin (1%) + NEAA (1%) + nicht-tierischen L-Glutamin (1 mM) + Natriumpyruvat (1%) + Natriumbicarbonat (0,12%) + β-Mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (aufgenommen bei frischen Zufuhr, 10 ng / ml)
- Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), suberanilohydroxamic Säure (SAHA, fügte frisch bei Fütterung, 200 Nm). Sobald iPSC Kolonien erscheinen, beginnen Fütterung der Zellen mit hES Medium + HDAC-Inhibitoren, wechselnde Medium jeden Tag.
HINWEIS: Sodium Butyrat ist ein kleines Molekül, das in Kunststoffröhrchen adsorbiert ist, therefore speichern sie in einer Borosilikatglas Rohr bei 4 ° C.
5. Isola iPSC Clones
- Sobald iPSC Kolonien groß genug sind, um isoliert werden (20-25 Zellen), holen sie mit einem P20-Pipette.
- Bereiten HDAC-Inhibitoren: Natriumbutyrat (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 100 uM), Sacha (hinzugefügt frisch bei Fütterung, 200 nM)
- Legen Sie die isolierte Kolonien auf iMEFs in einzelnen 35 mm Schalen mit hESC Medium + HDAC-Inhibitoren + Cloning & Recovery Supplement.
- Der Tag nach der Ernte die Kolonien, ändern Sie das Medium, um hESC Medium + HDAC-Inhibitoren.
- Ändern Sie das Medium täglich bis iPSC Kolonien sind bereit für das Passagieren.
- Entfernen HDAC-Inhibitoren aus dem Medium einmal Kolonien Stabilisierung bei Passage 2-3.
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Representative Results
Drei Tage nach Nukleofektion und vor dem Ausplattieren der Zellen auf nucleofected iMEFs sollte die Effizienz der erfolgreichen Nukleofektion durch Fluoreszenzmikroskopie für eGFP geschätzt werden. Figur 1 zeigt einen typischen Nukleofektion Experiment mit etwa 5-10% der Gesamtzellpopulation exprimiert eGFP.
Reprogrammed iPSC Kolonien beginnen, etwa zwei Wochen nach Nukleofektion erscheinen. Die Kolonien sind in der Regel kreisförmig mit gut definierten Grenzen und können durch charakteristische Morphologie HES einschließlich (1) kleine, dicht gepackte Zellen mit einer hohen Kern-Zytoplasma-Verhältnis, und (2) sichtbare Nucleoli (Abbildung 2, Hellfeld) identifiziert werden. Unvollständig umprogrammiert Zellen entweder verschlechtern oder bilden heterogene Zellmassen, die leicht von der wahren iPSC Kolonien auszeichnen.
Der repräsentativen Linien, die wir gewählt haben, um vollständig zu charakterisieren, alle drücken die standard Pluripotenzmarker (Abbildung 2), zu reaktivieren endogenen Pluripotenz-Gene (Abbildung 2), und die Form Teratome, wenn sie in NOD-SCID-Mäusen injiziert.
Abbildung 1: Nucleofected Zellen stimuliert PBMCs drei Tage nach Nukleofektion mit Plasmiden OCT4, SOX2, KLF4, MycL, EBNA1, p53 shRNA und eGFP (Maßstab ist 100 um)..
Abbildung 2:. IPSC Charakterisierung IPSC erzeugt mit dieser Methode weisen hESC förmige Morphologie, wenn sie auf IMEF (Hellfeld) aufgewachsen, Positiv auf alkalische Phosphatase-Aktivität (AP), und sind positivdurch Immunhistochemie für Pluripotenzmarker TRA-1-60, TRA-1-81 und SSEA4. Zusätzlich ist die endogene Expression der Pluripotenz Gene Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K) und cMyc (M) durch RT-PCR nachgewiesen werden. (Alle Maßstabsbalken zu 100 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Episoms | Masse pro Reaktion (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-hSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
Tabelle 1:. Optimale Verhältnis von Reprogrammierung Plasmide 6 Diese Plasmide sind verfügbar, um durch Addgene bestellen.
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Discussion
Für eine erfolgreiche iPSC Generation, wenn Sie dieses Protokoll, gibt es mehrere wichtige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Während der Erythroblasten Ausbaustufe sollte die Medienwechsel Zeitplan strikt eingehalten werden, da Abweichungen können zu einer ineffizienten Stimulation des Zielvorläuferzellpopulation und einer niedrigeren Effizienz iPSC Generation führen. Es ist wichtig, neue Expansionsmedium mit frischem Dexamethason mit jedem Medienwechsel zu machen; und die QBSF-60 Basismedium und Dexamethason sollten vor Licht während der Lagerung zu schützen. Während Nukleofektion ist die DPBS Wasch kritischen überschüssige gelöste Stoffe aus der Zellsuspension, die den elektrischen Strom von der Nucleofector dazu führen kann, Bogen, mit breit Zelltod zu entfernen. Etwa 10 Tage nach Nukleofektion sollte die Platte täglich iPSC Kolonie Aussehen untersucht werden. Sobald mehrere kleine Kolonien vorhanden sind, die Reprogrammierung Medium sollte hESC Medium (mit HDAC-Inhibitoren), wie prolonge geändert werdend Exposition gegenüber Serum kann spontane Differenzierung zu induzieren.
Abhängig von Laboraufbau und der verfügbaren Ressourcen können Modifikationen des Protokolls zu berücksichtigen. Wir bevorzugen eine geringe O 2 -Inkubator weil hypoxischen Bedingungen wurde gezeigt, dass die Effizienz der Erzeugung iPSC 13 zu erhöhen; wir haben jedoch den Erfolg Erzeugen iPSCs aus peripherem Blut unter Verwendung von normoxischen Bedingungen mit 5% CO 2 hatte. Daher befeuchtet Standard CO 2 -Inkubator können ebenfalls verwendet werden. Die in diesem Protokoll verwendeten MEFs kann von einem Life-Science-Anbieter erworben werden. Aufgrund kaufmännischer Chargenvariabilität, bevorzugen wir jedoch zu iMEFs von CF-1-Mäusen nach einem veröffentlichten Protokoll für MEF Isolation, Kultur, und Bestrahlung 14 zu generieren. Die Einbeziehung von HDAC-Inhibitoren ist eine günstige Aspekt dieses Protokoll als epigenetische Umbau ist ein entscheidender Aspekt der zellulären Reprogrammierung 9,15. HDAC-Inhibitoren kann verzichtet werden, jedoch die Anzahl der fully umprogrammiert iPSC Kolonien verringert. Schließlich haben wir IPSCs mit dieser Methode mit einer Knochenmarksprobe ohne zusätzliche Modifikationen nötig erzeugt.
Zusammenfassend wird in diesem Protokoll ein Plasmid basiert Umprogrammierung System, das einige der Nachteile vermeidet iPSC Generation mit integrierende Vektoren, einschließlich Zufallsinsertionen in das Wirtsgenom und die Sicherheit hinsichtlich der Verarbeitung von rekombinantem Virus. Darüber hinaus ist im kleinen Maßstab die Virusproduktion und Charakterisierung relativ arbeitsintensiv im Vergleich zu Plasmid Generation. Umprogrammierung Effizienz kann auch stark variieren aufgrund Chargenvariabilität inhärent Virusproduktion, während eine großtechnische Herstellung von Qualitäts Plasmide können, um konsistente iPSC Generation über die Zeit führen kann. Kombiniert mit HDAC-Inhibitoren bietet dieses Protokoll eine effiziente Methode, um die Integration frei erzeugen und Footprint kostenlos IPSCs für die Stammzellenforschung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die folgenden Zuschüsse aus dem NIH für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) und K12HL0806406 (SKS); und die JP McCarthy Foundation (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
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