Summary
यहाँ हम एक episome आधारित reprogramming रणनीति और हिस्टोन deacetylase अवरोधकों का उपयोग परिधीय रक्त से मानव प्रेरित स्टेम सेल पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
इस पांडुलिपि कुशलतापूर्वक episomal प्लास्मिड और हिस्टोन deacetylase (HDAC) अवरोधकों का उपयोग परिधीय रक्त से एकीकरण मुक्त मानव प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल को दिखाता है. इस दृष्टिकोण के लाभ में शामिल हैं: (1) एक स्रोत सामग्री के रूप में परिधीय रक्त की एक न्यूनतम राशि का उपयोग; (2) reprogramming वैक्टर nonintegrating; (3) वेक्टर मुक्त IPSCs पैदा करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका; (4) एक एकल अभिकर्मक; और (5) छोटे अणुओं का उपयोग epigenetic reprogramming की सुविधा के लिए. Reprogramming उल्लेखनीय उत्तरदायी है कि एक अत्यधिक proliferative एरिथ्रोसाइट पूर्वज सेल आबादी उपज संक्षेप में, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) दिनचर्या फ़स्त खोलना नमूने से अलग कर रहे हैं और परिभाषित वृद्धि कारकों में तो सुसंस्कृत. Nonintegrating, OCT4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, और एक p53 कम बाल के लिये कांटा (एसएच) आरएनए व्यक्त nontransmissible episomal प्लास्मिड introdu हैंएक भी nucleofection के माध्यम से ली गई erythroblasts में ced. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन बढ़ाया व्यक्त करता है कि एक episome (EGFP) के Cotransfection ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है. एपस्टीन बर्र परमाणु प्रतिजन 1 (EBNA1) व्यक्त एक अलग प्रतिकृति की कमी प्लाज्मिड भी episomal प्रोटीन की वृद्धि की अभिव्यक्ति के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं तो जारी रखा reprogramming के लिए विकिरणित माउस भ्रूण fibroblasts (iMEFs) की एक परत पर चढ़ाया जाता है. जैसे ही IPSC तरह कालोनियों nucleofection के बाद के बारे में बारह दिनों में दिखाई देते हैं, HDAC अवरोधकों epigenetic remodeling की सुविधा के लिए मध्यम करने के लिए जोड़ रहे हैं. हम HDAC inhibitors का समावेश नियमित 2 गुना से पूरी तरह reprogrammed IPSC कालोनियों की पीढ़ी बढ़ जाती है कि मिल गया है. IPSC कालोनियों ठेठ मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) आकृति विज्ञान का प्रदर्शन एक बार, वे धीरे निरंतर विकास और विस्तार के लिए व्यक्तिगत iMEF लेपित टिशू कल्चर प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
Introduction
IPSCs pluripotency जीन की एक न्यूनतम सेट की अस्थानिक अभिव्यक्ति के माध्यम से दैहिक ऊतकों से निकाली गई है. इस तकनीक को शुरू में अत्यधिक pluripotent राज्य 1 में व्यक्त कर रहे हैं जो OCT4, Sox2, KLF4, और cMYC साथ मानव fibroblasts की रेट्रोवायरल पारगमन द्वारा प्रदर्शन किया गया. ये क्षणिक व्यक्त "reprogramming के कारकों" मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से 2 लक्ष्य सेल के epigenetic परिदृश्य और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अनुरूप बदल. बनाया एक बार, IPSCs संभवतः आगे की जांच के लिए किसी भी ऊतक प्रकार में भेदभाव किया जा सकता. इस प्रकार, वे पुनर्योजी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए वादा पकड़. हालांकि, को एकीकृत वायरस के साथ जीनोम में खलल न डालें अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति, प्रभाव सेलुलर फेनोटाइप को बदलने की क्षमता है, और अंत में वैज्ञानिक परिणाम पूर्वाग्रह. इसके अलावा, यादृच्छिक वायरल एकीकरण हानिकारक सेलुलर ई करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंघातक परिवर्तन 3 या oncogenic ट्रांसजीन 4 की फिर से अभिव्यक्ति की संभावना सहित ffects,. भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों गैर समेकित करने IPSC पीढ़ी की आवश्यकता होगी.
अतिरिक्त गुणसूत्र परिपत्र डीएनए अणु होते हैं जो Episomes, लागत प्रभावी, एकीकरण से मुक्त IPSCs 5 उत्पन्न करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं. तालिका 1 में दिखाया गया episomal वैक्टर के संयोजन reprogramming OCT4, Sox2, KLF4, MYCL, और LIN28A कारकों व्यक्त करते हैं. pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-एफ प्लाज्मिड भी सेलुलर reprogramming 6 बढ़ाने के लिए TP53 के अस्थायी दमन के लिए एक p53 shRNA गये हैं. प्रतिकृति की कमी pCXWB-EBNA1 वेक्टर EBNA1 अभिव्यक्ति 7 में एक क्षणिक वृद्धि प्रदान करके reprogramming के कारकों के प्रवर्धन और बढ़ reprogramming दक्षता को बढ़ावा देता है. pCXLE_EGFP प्लाज्मिड देते के प्रयोजन के लिए nucleofection मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा सकता हैसेल छँटाई अनुप्रयोगों के लिए अभिकर्मक दक्षता या rmining. पी CXWB-EBNA1 के अपवाद के साथ, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया episomal प्लास्मिड मेजबान सेल 8 के विभाजन के दौरान नकल और episome का विभाजन मध्यस्थता जो वायरल प्रतिकृति और EBNA1 जीन, के एपस्टीन-बर्र वायरस मूल होते हैं. episomes अनायास लगातार IPSC विस्तार 7 के साथ खो रहे हैं. Subcloning और EGFP अभिव्यक्ति की हानि से अनुमान लगाया जा सकता है जो episomal वेक्टर नुकसान, साथ IPSCs के लक्षण, भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए पूरी तरह से एकीकरण मुक्त IPSCs बढ़ सकता है.
IPSC पीढ़ी की प्रक्रिया के लिए निहित वंश विशिष्ट जीन का दमन और pluripotency जुड़े जीन की पुनर्सक्रियन है. जीन अभिव्यक्ति के नियमन को लक्षित करने के प्रतिलेखन कारक अनुमति देने के लिए डीएनए और chromatin के लिए संशोधन, विनियामक डीएनए तत्वों, और शाही सेना पोलीमरेज़ उपयोग सहित, नाभिक के भीतर कई स्तरों पर होता हैजीन. वैश्विक क्रोमेटिन संशोधनों के माध्यम से epigenetic परिदृश्य के पुनर्गठन फिर से अभिव्यक्ति के लिए एक प्रमुख घटक pluripotency आनुवंशिक प्रोग्राम की है. जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण है कि एक विशिष्ट क्रोमेटिन संशोधन हिस्टोन-डीएनए का तार की कमी हुई तनाव के माध्यम से जीन को लक्षित करने के लिए उपयोग की अनुमति देता है जो विशेष लाइसिन अवशेषों पर हिस्टोन के एसिटिलीकरण, है. HDAC अवरोधकों के कारण acetylated राज्य में 11 का समर्थन करने की संभावना है, IPSC reprogramming और hESC आत्म नवीकरण 9,10 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है कि छोटे अणु होते हैं. एकीकृत करने lentiviruses 12 का उपयोग करते हुए एक पूर्व प्रकाशन से अनुकूलित नीचे वर्णित प्रोटोकॉल, परिधीय रक्त का उपयोग episomes और HDAC अवरोधकों से अनुकूलित IPSC पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम विधि प्रदान करता है. यहां इस्तेमाल HDAC अवरोध करनेवाला सांद्रता वेयर द्वारा वर्णित उन में से आधे हैं, एट अल. 9, और नियमित रूप से मानक से अधिक पूरी तरह से reprogrammed IPSC कालोनियों में एक 2 गुना वृद्धि हुई हैHDAC inhibitors के बिना episomal reprogramming प्रोटोकॉल. Reprogramming की इस स्तर हम lentiviral तरीकों के साथ निरीक्षण दक्षता के साथ बराबर है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम कुशलतापूर्वक उम्र के 87 वर्ष के रूप में के रूप में पुराने व्यक्तियों से IPSC उत्पन्न किया है.
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Protocol
फ्रेड हचिंसन कैंसर रिसर्च सेंटर के संस्थागत समीक्षा बोर्ड और बच्चे "के फिलाडेल्फिया के अस्पताल द्वारा अनुमोदित के रूप में, सूचित सहमति लिखा, परिधीय रक्त के नमूने इकट्ठा करने से पहले मरीजों से प्राप्त हुई थी. सभी संस्थागत दिशा निर्देशों मनाया गया. MEF पीढ़ी सहित सभी पशु प्रयोगों और teratoma गठन संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
PBMCs और Erythroblasts के विस्तार के 1. Ficoll पृथक्करण - 0 दिन
- है Dulbecco फास्फेट buffered खारा (DPBS) के साथ 1: परिधीय रक्त 1 पतला. एक 15 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब में, ध्यान से कमरे के तापमान Ficoll-Hypaque के 3 मिलीग्राम पर पतला रक्त की 7 मिलीलीटर परत.
- 30 मिनट के लिए 400 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- PBMCs प्लाज्मा और एक बादल सफेद परत के रूप में देखा Ficoll-Hypaque, बीच इंटरफेस के लिए तय हो चुका है होगा. एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, पंजाब इकट्ठाएक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में MCs. DPBS का उपयोग 10 एमएल मात्रा लाओ.
- एक hemacytometer का उपयोग, PBMCs गिनती.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में पिपेट 2 × 10 6 PBMCs. 90% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) / 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 2 × 10 6 PBMCs / एमएल के एक एकाग्रता में शेष कोशिकाओं और फ्रीज नीचे स्पिन.
- विस्तार मध्यम तैयार: QBSF-60 सीरम मुक्त मध्यम सेल कारक (प्रकाश से रक्षा) + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) + एस्कॉर्बिक एसिड (50 एनजी / एमएल) + स्टेम (एस सी एफ, 50 एनजी / एमएल) + इंटरल्यूकिन 3 (IL- 3, 10 एनजी / एमएल) + erythropoietin (ईपीओ, 2 यू / मिलीलीटर) + इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर 1 (आईजीएफ -1, 40 एनजी / एमएल) + dexamethasone (1 माइक्रोन, प्रकाश से सुरक्षित रखें, एक ताजा विभाज्य पिघलना प्रत्येक मीडिया ) बदल जाते हैं.
- ताजा बना विस्तार मध्यम 2 मिलीलीटर और में Resuspend 2 × 10 6 PBMCs एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं में डाल दिया और 5 के माहौल के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में सेते% 2 हे, 5% सीओ 2, और 90% 2 एन.
- 3 दिन और दिन 6 पर, मीडिया की जगह.
- कोशिकाओं लीजिए और किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए QBSF-60 के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो लें.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- नए विस्तार मध्यम 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और वही 12 अच्छी तरह से थाली में उन्हें वापस.
Nucleofection द्वारा 2. Reprogramming प्रकोष्ठों - दिन 9
- एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब (1 टेबल) में reprogramming प्लास्मिड पिपेट.
- एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में अनुपूरक (निर्माता द्वारा आपूर्ति) और पिपेट साथ nucleofection समाधान मिलाएं.
- पिपेट 2 एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक 12 अच्छी तरह से थाली और जगह से एक कुएँ में विस्तार मध्यम (5% 2 हे, 5% सीओ 2, और 90% एन 2) पूर्व कोशिकाओं को जोड़ने के लिए संतुलन के लिए की मिलीलीटर.
- लीजिएसंवर्धित कोशिकाओं शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए QBSF-60 के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो लें और.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- DPBS के 5 मिलीलीटर में resuspending और 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें.
- सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- पैदा बुलबुले से बचने के ख्याल रख रही है, nucleofection समाधान + अनुपूरक के 100 μl में सेल गोली Resuspend.
- नीचे एक बार reprogramming प्लास्मिड, पिपेट ऊपर और युक्त ट्यूब में सेल निलंबन पिपेट, और nucleofection क्युवेट के तल में नमूना पिपेट.
- Nucleofection मशीन में क्युवेट और चलाने कार्यक्रम टी 019 रखें.
- Nucleofection क्युवेट में (2.3 कदम में equilibrating थाली से) prewarmed विस्तार मध्यम के 100 μl स्थानांतरण.
- इसके तत्काल बाद पूर्व गर्म विस्तार मध्यम के कुएं में पूरे नमूना और जमा इकट्ठा. सफेद, चल मृत सेल मलबा इकट्ठा करने से बचें. विकास के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (5% 2 हे, 5% सीओ 2, और 90% एन 2) में प्लेट रखें.
3. चढ़ाना फीडर कोशिकाओं - दिन 10 या 11
- 10 दिन पर, थाली फीडर कोशिकाओं.
- जिलेटिन के साथ कोट एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट.
- पिपेट थाली में से प्रत्येक कुएं में हांक बफर नमकीन घोल (HbSS) में 1 एम 0.1% की जिलेटिन.
- कम से कम 5 मिनट के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली रखें.
- तुरंत उपयोग करने से पहले, थाली से जिलेटिन समाधान aspirate.
- Prewarmed MEF मीडिया (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + FBS के (10%) + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%)) के 10 एमएल में 3,000 cGy पर विकिरणित 2 × 10 6 माउस भ्रूण fibroblasts की एक शीशी पिघलना.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate. 12 MEF मीडिया की मिलीलीटर और पिपेट 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend मैंजिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह Nto. 12 दिन तक एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (5% 2 हे, 5% सीओ 2, और 90% एन 2) में प्लेट रखें.
- जिलेटिन के साथ कोट एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट.
4. फीडर कोशिकाओं पर चढ़ाना कोशिकाओं और मध्यम बदलना - 12 दिन
- एक 15 मिलीलीटर में शंक्वाकार ट्यूब nucleofected कोशिकाओं को इकट्ठा और QBSF-60 के साथ अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर धोने से किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा. 5 मिनट के लिए 300 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- तैयार Reprogramming मध्यम: Iscove संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM) + FBS के (10%) + गैर पशु एल glutamine (1 मिमी) + गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA, 1%) + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 मिमी) + बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक + एस्कॉर्बिक एसिड (bFGF, खिला, 10 एनजी / एमएल पर ताजा जोड़ा) (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, खिलाने पर ताजा जोड़ा).
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और Reprogramming मध्यम की 12 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend. सेल निलंबन के प्रति अच्छी तरह पिपेट 2 मिलीलीटर मेंफीडर कोशिकाओं की 6 अच्छी तरह से थाली (के रूप में धारा 3 में तैयार). कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 50 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
- विकास के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (5% 2 हे, 5% सीओ 2, और 90% एन 2) में प्लेट रखें. IPSC कालोनियों (1-2 सप्ताह) प्रदर्शित होने शुरू तक Reprogramming मध्यम हर दूसरे दिन बदलें.
- HESC मध्यम तैयार: DMEM / F12 1: 1 नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (20%) + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) + NEAA (1%) + गैर पशु एल glutamine (1 मिमी) + सोडियम पाइरूवेट (1%) + सोडियम बाइकार्बोनेट (0.12%) + β-mercaptoethanol (0.1 मिमी) + bFGF (खिलाने पर ताजा जोड़ा, 10 एनजी / एमएल)
- HDAC अवरोधकों तैयार: (खिला पर ताजा जोड़ा, 100 माइक्रोन) सोडियम butyrate, suberanilohydroxamic एसिड (साहा, 200 एनएम, खिलाने पर ताजा जोड़ा). IPSC कालोनियों दिखाई देते हैं एक बार, हर दिन मध्यम बदल रहा है, hESC मध्यम + HDAC inhibitors के साथ कोशिकाओं को खिलाने लगते हैं.
नोट: सोडियम butyrate प्लास्टिक ट्यूबों को adsorbed है कि एक छोटे अणु है, टीherefore 4 डिग्री सेल्सियस पर एक borosilicate ग्लास ट्यूब में यह दुकान.
5. अलग IPSC क्लोन
- IPSC कालोनियों (20-25 कोशिकाओं) अलग किया जाना काफी बड़े होते हैं, एक P20 विंदुक के साथ उन्हें लेने.
- HDAC अवरोधकों तैयार: सोडियम butyrate (खिलाने पर ताजा जोड़ा, 100 माइक्रोन), साहा (200 एनएम, खिलाने पर ताजा जोड़ा)
- HESC मध्यम + HDAC अवरोधकों + क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक युक्त व्यक्ति 35 मिमी बर्तन में iMEFs पर पृथक कालोनियों रखें.
- दिन कालोनियों उठा के बाद, hESC मध्यम + HDAC अवरोधकों को मध्यम बदल जाते हैं.
- IPSC कालोनियों passaging के लिए तैयार हैं जब तक हर दिन मध्यम बदलें.
- कालोनियों बीतने 2-3 पर स्थिर एक बार मध्यम से HDAC अवरोधकों को हटा दें.
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Representative Results
तीन दिन nucleofection के बाद और iMEFs पर nucleofected चढ़ाना कोशिकाओं से पहले, सफल nucleofection की दक्षता EGFP के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अनुमान लगाया जाना चाहिए. 1 EGFP व्यक्त कुल सेल की आबादी का लगभग 5-10% के साथ एक ठेठ nucleofection प्रयोग से पता चलता है.
Reprogrammed IPSC कालोनियों nucleofection के बाद लगभग दो सप्ताह प्रदर्शित करने के लिए शुरू हो जाएगा. कालोनियों अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं के साथ आम तौर पर परिपत्र रहे हैं और एक उच्च परमाणु cytoplasmic अनुपात और (2) दिखाई nucleoli (चित्रा 2, उज्ज्वल क्षेत्र) के साथ (1) छोटे, कसकर बांध कोशिकाओं सहित विशेषता hESC आकारिकी द्वारा पहचाना जा सकता है. अधूरे reprogrammed कोशिकाओं को खराब या आसानी से सच IPSC कालोनियों से प्रतिष्ठित हैं कि विषम सेल जनता बनेगी या तो.
हम पूरी तरह से चिह्नित करने के लिए चुना है कि प्रतिनिधि लाइनों की, सभी के व्यक्तइशारा-SCID चूहों में इंजेक्शन जब tandard pluripotency मार्कर (चित्रा 2), अंतर्जात pluripotency जीन (चित्रा 2), और फार्म teratomas पुन: सक्रिय.
चित्रा 1: Nucleofected प्रकोष्ठों प्रेरित PBMCs तीन दिनों OCT4, Sox2, KLF4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA, और EGFP (स्केल बार 100 माइक्रोन है) युक्त plasmids के साथ nucleofection के बाद..
चित्रा 2:. IMEF (उज्ज्वल क्षेत्र) पर हो जब IPSC विशेषता IPSC alkaline फॉस्फेट गतिविधि (एपी) के लिए सकारात्मक परीक्षण, और सकारात्मक हैं, इस विधि प्रदर्शनी hESC-जैसे आकृति विज्ञान का उपयोग कर उत्पन्नpluripotency मार्करों टीआरए-1-60, टीआरए-1-81, और SSEA4 के लिए immunohistochemistry के द्वारा. साथ ही, pluripotency जीन Oct4 (ओ), Sox2 (एस), Klf4 (कश्मीर), और cMyc (एम) की अंतर्जात अभिव्यक्ति आरटी-पीसीआर द्वारा detectable है. (सभी पैमाने सलाखों के 100 माइक्रोन) कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| Episome | प्रतिक्रिया प्रति मास (एनजी) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-एफ | 830 |
| pCXLE-HSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
तालिका 1:. Reprogramming प्लास्मिड 6 का इष्टतम अनुपात इन plasmids Addgene के माध्यम से ऑर्डर करने के लिए उपलब्ध हैं.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय सफल IPSC पीढ़ी के लिए, पर विचार किया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण निरंतर कर रहे हैं. विचलन लक्ष्य पूर्वज सेल की आबादी का अकुशल उत्तेजना और IPSC पीढ़ी के एक कम क्षमता को जन्म दे सकती रूप erythroblast विस्तार के चरण के दौरान, मीडिया परिवर्तन अनुसूची का कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए. यह प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के साथ नए सिरे dexamethasone के साथ नए विस्तार मध्यम बनाने के लिए महत्वपूर्ण है; और QBSF-60 आधार मध्यम और dexamethasone भंडारण के दौरान प्रकाश से रक्षा की जानी चाहिए. Nucleofection के दौरान, DPBS धोने व्यापक सेल मौत में जिसके परिणामस्वरूप, चाप को Nucleofector से विद्युत प्रवाह के कारण हो सकता है कि सेल निलंबन से अतिरिक्त विलेय दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. लगभग 10 दिनों nucleofection के बाद, थाली IPSC कॉलोनी उपस्थिति के लिए दैनिक जांच की जानी चाहिए. कई छोटे कालोनियों मौजूद हैं एक बार, Reprogramming मध्यम prolonge के रूप में (HDAC inhibitors के साथ) hESC मध्यम करने के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिएसीरम डी जोखिम सहज भेदभाव उत्पन्न हो सकता है.
प्रयोगशाला सेट-अप और उपलब्ध संसाधनों पर निर्भर करता है, प्रोटोकॉल में संशोधन पर विचार किया जा सकता है. Hypoxic शर्तों IPSC पीढ़ी 13 की दक्षता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है क्योंकि हम एक कम ओ 2 इनक्यूबेटर पसंद करते हैं; हालांकि, हम सफलता के 5% सीओ 2 के साथ normoxic शर्तों का उपयोग परिधीय रक्त से IPSCs पैदा किया है. इसलिए, एक मानक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया MEFs एक जीवन विज्ञान विक्रेता से खरीदा जा सकता है. हालांकि, वाणिज्यिक बैच परिवर्तनशीलता के लिए, हम MEF अलगाव, संस्कृति, और विकिरण 14 के लिए एक प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद CF-1 चूहों से iMEFs उत्पन्न करने के लिए पसंद करते हैं. epigenetic remodeling के सेलुलर reprogramming 9,15 का एक महत्वपूर्ण पहलू के रूप में HDAC inhibitors का समावेश इस प्रोटोकॉल की एक अनुकूल पहलू है. HDAC निरोधक, ful की लेकिन संख्या हटाया जा सकता हैly IPSC कालोनियों कम हो जाएगा reprogrammed. अन्त में, हम आवश्यक कोई अतिरिक्त संशोधनों के साथ एक अस्थि मज्जा नमूना के साथ इस पद्धति का उपयोग IPSCs उत्पन्न किया है.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल यादृच्छिक मेजबान जीनोम में सम्मिलन और पुनः संयोजक वायरस की हैंडलिंग के बारे में सुरक्षा चिंताओं सहित एकीकृत करने वैक्टर, साथ IPSC पीढ़ी की कमियों के कुछ बचा जाता है कि एक प्लाज्मिड आधारित reprogramming प्रणाली का उपयोग करता है. प्लाज्मिड पीढ़ी की तुलना में इसके साथ ही, छोटे पैमाने पर वायरस उत्पादन और लक्षण अपेक्षाकृत श्रम गहन है. गुणवत्ता plasmids के एक बड़े पैमाने पर उत्पादन के समय में लगातार IPSC पीढ़ी को जन्म दे सकता है, जबकि reprogramming दक्षता भी, कारण वायरस उत्पादन के लिए निहित बैच परिवर्तनशीलता को काफी भिन्न हो सकते हैं. HDAC inhibitors के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल मुक्त एकीकरण पैदा करते हैं और स्टेम सेल अनुसंधान के लिए मुक्त IPSCs पदचिह्न लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.
Acknowledgments
लेखकों इस शोध के समर्थन के लिए एनआईएच से निम्नलिखित अनुदान स्वीकार करने की इच्छा: K08DK082783 (एआर), P30DK56465 (बीटीएस), U01HL099993 (बीटीएस), T32HL00715036 (एसकेएस), और K12HL0806406 (एसकेएस); और जेपी मैकार्थी फाउंडेशन (एआर).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
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