Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Effektiv iPS Cell Generation fra Blood hjelp episomer og HDAC hemmere

doi: 10.3791/52009 Published: October 28, 2014

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å generere menneskeskapte pluripotente stamceller fra perifert blod ved hjelp av en episom basert omprogrammering strategi og histondeacetylase hemmere.

Abstract

Dette manuskriptet illustrerer en protokoll for effektivt å skape integrasjon frie menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) fra perifert blod ved hjelp episomale plasmider og histondeacetylase (HDAC) hemmere. Fordelene med denne tilnærming omfatter: (1) bruk av en minimal mengde av perifert blod som en kilde materiale; (2) nonintegrating omprogrammering vektorer; (3) en kostnadseffektiv fremgangsmåte for å generere vektor frie iPSCs; (4) en enkelt transfeksjon; og (5) anvendelse av små molekyler for å lette epigenetisk omprogrammering. I korthet, blir perifere mononukleære blodceller (PBMC) isolert fra flebotomi rutineprøver og deretter dyrket i definerte vekstfaktorer for å gi et sterkt proliferativ erytrocytt progenitor-cellepopulasjonen som er bemerkelsesverdig mottagelig for omprogrammering. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmider uttrykker OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, og en p53 kort hårnål (sh) RNA er introduced inn i de avledet erytroblaster via en enkelt nucleofection. Kotransfeksjon av en episom som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) gir mulighet for enkel identifisering av transfekterte celler. En separat replikasjon-manglende plasmid som uttrykker Epstein-Barr-atom antigen 1 (EBNA1) blir også tilsatt til reaksjonsblandingen for økt ekspresjon av episomale proteiner. Transfekterte celler blir deretter sådd ut på et lag av bestrålte mus embryoniske fibroblaster (iMEFs) for fortsatt omprogrammering. Så snart IPSC-kolonier som vist på omtrent tolv dager etter nucleofection, er HDAC-inhibitorer tilsettes til mediet for å lette epigenetisk remodeling. Vi har funnet at inkludering av HDAC-inhibitorer øker rutinemessig generering av fullt omprogrammeres IPSC kolonier av 2-fold. Når IPSC kolonier utviser typisk humane embryonale stamceller (hESC) morfologi, de er forsiktig overført til individuelle iMEF-belagt vevskulturplater for fortsatt vekst og ekspansjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

iPSCs er utledet fra somatiske vev via ektopisk uttrykk for et minimalt sett med pluripotency gener. Denne teknikken ble først demonstrert av retrovirale transduksjon av humane fibroblaster med OCT4, SOX2, KLF4, og cMYC, som er høyt uttrykt i pluripotent tilstand 1. Disse forbigående uttrykt "omprogrammering faktorer" endre målcellens epigenetisk landskapet og genuttrykk profil analogt til humane embryonale stamceller 2. Når den er laget, kan iPSCs potensielt bli differensiert i noen vevstype for videre etterforskning. Dermed holder de løftet for bruk i regenerativ medisin, sykdom modellering, og genterapi applikasjoner. Imidlertid, forstyrre genomet med integrerende viruser har potensial til å endre endogent gen-ekspresjon, påvirker cellulær fenotype, og til slutt å forspenne vitenskapelige resultater. Videre kan tilfeldige integreringer virale føre til skadelige cellulære effekter, inkludert muligheten for malign transformasjon tre eller re-uttrykk av de onkogene transgener 4. Fremtidige kliniske applikasjoner vil kreve ikke-integrere IPSC generasjon.

Episomer, som er ekstra kromosom sirkulære DNA-molekyler, har en strategi for å generere kostnadseffektive, integrasjon frie iPSCs 5. Kombinasjonen av episomale vektorer som er vist i tabell 1 uttrykke omprogrammering faktorer OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, og LIN28A. Den pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-plasmidet inneholder også en p53 shRNA for midlertidig undertrykkelse av TP53 å forbedre mobilnettet omprogrammering 6. Replikering mangel pCXWB-EBNA1 vektor fremmer forsterkning av omprogrammering faktorer og økt omprogrammering effektivitet ved å tilby en forbigående økning i EBNA1 uttrykk 7. Den pCXLE_EGFP plasmid kan legges til nucleofection blandingen i den hensikt å Determining transfeksjonseffektiviteten eller cellesorterings anvendelser. Med unntak av p-CXWB EBNA1, de episomale plasmider anvendt i denne protokollen inneholder Epstein-Barr virus opprinnelse av viral replikasjon og EBNA1-genet, som formidler replikasjon og oppdeling av episom under delingen av vertscellen 8. De episomer er spontant tapt med påfølgende IPSC ekspansjon 7. Subkloning og karakterisering av iPSCs med episomal vektor tap, som kan utledes fra tap av EGFP uttrykk, kan føre til helt integrering gratis iPSCs for fremtidige kliniske applikasjoner.

Iboende til prosessen med IPSC generasjon er undertrykkelse av avstamning spesifikke gener og reaktivering av pluripotency assosierte gener. Regulering av gen-ekspresjon forekommer på flere nivåer i kjernen, herunder modifiseringer av DNA og kromatin å tillate transkripsjonsfaktorer, regulatoriske DNA-elementer, og RNA-polymerase tilgang til måletgener. Ombygging av epigenetisk landskapet via globale kromatin modifikasjoner er en viktig komponent for å re-uttrykk for pluripotency genetisk program. En spesifikk modifikasjon kromatin som er viktig i reguleringen av genekspresjon er acetylering av histoner på bestemte lysinrester, som tillater tilgang til målgener ved redusert spenning av histon-DNA-spiral. HDAC hemmere er små molekyler som har vist seg å forbedre IPSC omprogrammering og hESC selvfornyelse 9,10, trolig på grunn av støtte acetylerte staten 11. Protokollen er beskrevet nedenfor, tilpasset fra en tidligere publikasjon hjelp integrere lentiviruses 12, gir en trinn-for-trinn metode for optimalisert IPSC generasjon fra perifert blod ved hjelp episomer og HDAC hemmere. De HDAC-inhibitor-konsentrasjoner som brukes her, er halvparten av de som er beskrevet av Ware, et al. 9, og har rutinemessig ført til en to gangers økning i fullt omprogrammerte IPSC kolonier enn standardepisomale omprogrammering protokoller uten HDAC hemmere. Dette nivået av omprogrammering er på linje med effektiviteten vi observerer med lentiviral metoder. Ved hjelp av denne protokollen, har vi effektivt generert IPSC fra enkeltpersoner så gammel som 87 år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skriftlig informert samtykke, som er godkjent av Institutional Review Styrene i Fred Hutchinson Cancer Research Center og Children "s Hospital of Philadelphia, ble innhentet fra pasienter før samle perifere blodprøver. Alle institusjonelle retningslinjer ble observert. Alle dyreforsøk inkludert MEF generasjon og teratom dannelse ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Ficoll Separasjon av PBMC og Utvidelse av erytroblaster - dag 0

  1. Fortynne perifert blod 1: 1 med Dulbeccos Fosfatbufret Saline (DPBS). I en 15 ml rundbunnet polystyren-rør, nøye sjikt 7 ml fortynnet blod på 3 ml Ficoll romtemperatur-Hypaque.
  2. Sentrifugere prøven ved 400 xg i 30 min.
  3. PBMC vil ha lagt seg på grensesnittet mellom plasma og Ficoll-Hypaque, sett på som en uklar, hvit lag. Ved hjelp av en steril overførings pipette, samle PBMCs i en 15 ml konisk tube. Bringe volumet til 10 ml ved hjelp DPBS.
  4. Ved hjelp av en hemacytometer, telle PBMCer.
  5. Pipette 2 x 10 6 PBMC til en separat 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Spinne ned de gjenværende celler og fryse ved en konsentrasjon på 2 x 10 til 6 PBMC / ml i 90% føtalt bovint serum (FBS) / 10% dimetylsulfoksid (DMSO).
  6. Forbered Ekspansjons Medium: QBSF-60 serumfritt medium (beskytte mot lys) + penicillin / streptomycin (1%) + askorbinsyre (50 ng / ml) + stamcellefaktor (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + erytropoietin (EPO, 2 U / ml) + insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexamethasone (1 uM; beskytte mot lys; tine en frisk alikvot hver medier endre).
  7. Resuspender 2 x 10 6 PBMC i 2 ml rykende utvidelsesmedium og fyll i en brønn av en 12 brønners vevskulturplate og inkuberes i et 37 ° C fuktet inkubator med en atmosfære av 5O% 2, 5% CO2 og 90% N2.
  8. På dag 3 og dag 6, erstatte media.
    1. Samle cellene og vaskes godt med 2 ml QBSF-60 for å samle eventuelle gjenværende celler.
    2. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 min og supernatanten aspireres.
    3. Suspender cellene i 2 ml ny Expansion Medium og returnere dem til den samme 12-brønners plate.

2. omprogrammering celler ved nucleofection - Day 9

  1. Pipettere reprogrammerings-plasmider inn i en steril 1,5 ml Eppendorf-rør (tabell 1).
  2. Bland nucleofection løsning med Supplement (levert av produsenten) og pipette i en steril 1,5 ml Eppendorf rør.
  3. Pipetter 2 ml Ekspansjons medium inn i en brønn av en 12 brønners plate, og plasser i en fuktet 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2 og 90% N2) etter ekvilibrering før tilsetning av cellene.
  4. Samledyrkede celler og vaskes godt med 2 ml av QBSF-60 for å samle gjenværende celler.
  5. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min, og supernatanten aspireres.
  6. Vask cellene ved resuspendering i 5 ml DPBS og sentrifugering ved 300 xg i 5 min.
  7. Aspirer supernatanten.
  8. Cellepelleten suspenderes i 100 ul nucleofection løsning + Supplement, ta vare å unngå å generere bobler.
  9. Pipetter cellesuspensjonen inn i rør inneholdende reprogrammerings-plasmider, pipette opp og ned en gang, og pipettere prøven inn i bunnen av nucleofection kyvette.
  10. Sett kyvetten inn i nucleofection maskin og kjøre Program T-019.
  11. Overfør 100 ul av den prewarmed Expansion Medium (fra den ekvilibrerende platen i trinn 2.3) inn i nucleofection kyvette.
  12. Umiddelbart samle hele prøven og innskudd i brønnen av forvarmet Expansion Medium. Unngå å samle den hvite, flytende døde cellerester. Plassere platen i en fuktet 37 ° C inkubator (5% O 2, 5% CO2 og 90% N2) for vekst.

3. Plating Feeder Cells - Day 10 eller 11

  1. På dag 10, celler plate materen.
    1. Coat en seks godt vevkulturplate med gelatin.
      1. Pipetter 1 m av 0,1% gelatin i Hanks saltløsning (HBSS) i hver brønn av platen.
      2. Plassere platen i en fuktet 37 ° C inkubator i minst 5 min.
      3. Umiddelbart før bruk, aspirere den gelatinoppløsning fra platen.
    2. Tine ett hetteglass med 2 × 10 6 mus embryonale fibroblaster bestrålt på 3000 cGy inn 10 ml forvarmet MEF Media (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicillin / streptomycin (1%)).
    3. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min, og supernatanten aspireres. Resuspender cellene i 12 ml MEF Medier og 2 ml pipette jegnto hver brønn på gelatin-belagte 6 brønners plate. Plassere platen i en fuktet 37 ° C inkubator (5% O 2, 5% CO2 og 90% N2) inntil Dag 12.

4. Plating Cells om Feeder Cells og Endre Medium - Dag 12

  1. Samle nucleofected cellene inn i en 15 ml konisk rør og samle eventuelle gjenværende celler ved vasking av godt med 2 ml QBSF-60. Sentrifugere prøven ved 300 xg i 5 min.
  2. Forbered Omprogrammering Medium: Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) + FBS (10%) + ikke-animalsk L-glutamin (1 mM) + ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, 1%) + penicillin / streptomycin (1%) + β p-merkaptoetanol (0,1 mM) + basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, tilsatt friskt i føde, 10 ng / ml) + askorbinsyre (tilsatt frisk i forings, 50 ug / ml).
  3. Aspirere supernatanten og resuspender cellene i 12 ml av Medium ny programmering. Pipette 2 ml pr brønn av cellesuspensjonen i6-brønn plate av feeder-celler (som fremstilt i avsnitt 3). Sentrifuger plate ved 50 xg i 30 min ved romtemperatur.
  4. Plassere platen i en fuktet 37 ° C inkubator (5% O 2, 5% CO2 og 90% N2) for vekst. Endre Omprogrammering Medium annenhver dag frem til IPSC kolonier begynne å vises (1-2 uker).
  5. Forbered hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum erstatning (20%) + penicillin / streptomycin (1%) + NEAA (1%) + ikke-animalsk L-glutamin (1 mM) + natriumpyruvat (1%) + natriumbikarbonat (0,12%) + β-merkaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (tilsatt frisk i forings, 10 ng / ml)
  6. Forbered HDAC hemmere: natriumbutyrat (lagt frisk på fôring, 100 mm), suberanilohydroxamic syre (Saha, lagt frisk på fôring, 200 nM). Når IPSC kolonier vises, begynner å mate cellene med hESC Medium + HDAC hemmere, endre medium hver dag.
    MERK: Natrium-butyrat er et lite molekyl som er adsorbert til plastrørene, therefore lagre den i en borsilikatglass rør ved 4 ° C.

5. Isola IPSC Clones

  1. Når IPSC kolonier er store nok til å bli isolert (20-25 celler), plukke dem med et P20-pipette.
  2. Forbered HDAC hemmere: natriumbutyrat (lagt frisk på fôring, 100 mm), Saha (lagt frisk på fôring, 200 nM)
  3. Plasser de isolerte kolonier på iMEFs i enkelt 35 mm retter som inneholder hESC Medium + HDAC hemmere + Kloning & Recovery Supplement.
  4. Dagen etter plukking koloniene, bytter mediet som hESC Medium + HDAC hemmere.
  5. Endre mediet hver dag frem til IPSC kolonier er klar for passaging.
  6. Fjern HDAC hemmere fra mediet når kolonier stabilisere seg på passasje 2-3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tre dager etter nucleofection og før utplating av cellene på nucleofected iMEFs, bør effektiviteten av vellykket nucleofection estimeres ved fluorescens mikroskopi for EGFP. Figur 1 viser et typisk eksperiment nucleofection med ca. 5-10% av den totale cellepopulasjon som uttrykker EGFP.

Omprogrammerte IPSC kolonier vil begynne å dukke opp ca to uker etter nucleofection. Koloniene er generelt rundskriv med veldefinerte grenser og kan identifiseres ved karakteristiske hESC morfologi inkludert (1) små, tettpakkede celler med et høyt atom cytoplasma ratio og (2) synlig nucleoli (figur 2, Bright feltet). Ufullstendig omprogrammeres celler vil enten forringes eller danne heterogene cellemasser som er lett skilles fra ekte IPSC kolonier.

Av de representative linjer som vi har valgt å karakterisere helt, alle uttrykker standard pluripotency markører (figur 2), reaktivere endogene pluripotency gener (figur 2) og skjema teratomas når det injiseres NOD-SCID mus.

Figur 1

Figur 1: Nucleofected celler stimulert PBMC tre dager etter nucleofection med plasmider som inneholder OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA, og EGFP (Scale bar er 100 mikrometer)..

Figur 2
Figur 2:. IPSC Karakterisering IPSC generert ved hjelp av denne metoden utstillings hESC-lignende morfologi når dyrket på iMEF (Bright feltet), teste positivt for alkalisk fosfatase aktivitet (AP), og er positiveved immunhistokjemi for pluripotency markører TRA-1-60, TRA-1-81, og SSEA4. I tillegg er endogen ekspresjon av gener pluripotency Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K), og cMyc (M) detekteres ved hjelp av RT-PCR. (Alle skala barer er 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Episom Mass per reaksjon (ng)
pCXLE-hOct3 / 4-F-shp53 830
pCXLE-HSK 830
830
pCXLE-EGFP 500
pCXWB-EBNA1 500

Tabell 1:. Optimal Forhold av Omprogrammering Plasmider 6 Disse plasmidene er tilgjengelig for bestilling gjennom Addgene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For vellykket IPSC generasjon når du bruker denne protokollen, er det flere viktige begrensninger som bør vurderes. Under erytroblast utvidelse scenen, bør media endring planen følges nøye, som avvik kan føre til ineffektiv stimulering av målet stamcelle befolkning og en lavere virkningsgrad på IPSC generasjon. Det er viktig å lage nye utvidelsen medium med frisk deksametason med hver medie endring; og QBSF-60 basismedium og deksametason bør beskyttes mot lys under lagring. Under nucleofection, er DPBS vaske kritisk for å fjerne overskudd av soluter fra cellesuspensjonen som kan føre elektrisk strøm fra Nucleofector å bue, noe som resulterer i utbredte celledød. Ca 10 dager etter nucleofection, bør platen undersøkes daglig i IPSC koloni utseende. Når flere små kolonier er til stede, bør Omprogrammering Medium endres til hESC Medium (med HDAC hemmere) som prolonged eksponering for serum kan indusere spontan differensiering.

Avhengig av laboratorie oppsett og tilgjengelige ressurser, kan betraktes som modifikasjoner av den protokoll. Vi foretrekker en lav O 2 inkubator fordi hypoksiske betingelser har vist seg å øke effektiviteten av IPSC generering 13; har vi imidlertid hatt suksess genererer iPSCs fra perifert blod ved hjelp normoksisk forhold med 5% CO 2. Derfor er en standard fuktet CO2-inkubator kan også brukes. De MEFs brukes i denne protokollen kan kjøpes fra et life science leverandør. Imidlertid, på grunn av kommersiell satsvis variabilitet, foretrekker vi å generere iMEFs fra CF-1 mus etter en publisert protokoll for MEF isolering, kultur, og bestråling 14. Inkludering av HDAC hemmere er en gunstig aspekt av denne protokollen som epigenetisk remodeling er en viktig del av mobilnettet omprogrammering 9,15. HDAC-inhibitorer kan utelates, men antallet fully omprogrammeres IPSC kolonier vil bli redusert. Til slutt har vi generert iPSCs ved hjelp av denne metoden med en benmargsprøve uten ekstra modifikasjoner trengs.

I sammendrag, bruker denne protokoll et plasmid basert reprogrammerings-system som unngår noen av ulempene ved IPSC generasjon med integrerende vektorer, inkludert tilfeldige innsettinger i vertsgenomet og sikkerhetsproblemer i forbindelse med håndtering av rekombinante virus. I tillegg er liten skala virusproduksjon og karakterisering relativt arbeidskrevende sammenlignet med plasmid generasjon. Reprogrammerings-effektivitet kan også variere betydelig på grunn av iboende variasjoner i sats til virusproduksjon, mens en storskala produksjon av høy kvalitet kan føre til plasmider konsistent IPSC generasjon over tid. Kombinert med HDAC hemmere, denne protokollen tilbyr en effektiv metode for å generere integrering gratis og fotavtrykk gratis iPSCs for stamcelleforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne følgende tilskudd fra NIH for å støtte denne forskningen: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), og K12HL0806406 (SKS); og JP McCarthy Foundation (AR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PLUS Fisher Scientific 45-001-750 Store at 4 °C. Warm to room temperature before use.
DPBS Life Technologies 14190-250 Store at 4 °C.
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Store at 4 °C.
fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 10437028 Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C.
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 154938 Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium Fisher Scientific 50-983-234 Store at 4 °C.
penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122 Store at 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V Lonza VCA-1003 Store at 4 °C.
2% gelatin solution Sigma-Aldrich G1393 Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) Life Technologies 14175-103 Store at 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Life Technologies 12440-061 Store at 4 °C.
L-glutamine, 200 mM Life Technologies 25030-081 Aliquot, freeze at -20 °C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X Life Technologies 11140-050 Store at 4 °C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1 Fisher Scientific SH30023.02 Store at 4 °C.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828-028 Aliquot, freeze at -20 °C.
sodium pyruvate, 100 mM Life Technologies 11360-070 Store at 4 °C.
sodium bicarbonate, 7.5% Life Technologies 25080094 Store at 4 °C.
basic fibroblast growth factor (bFGF) Life Technologies PHG0263 Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887-1G Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement Stemgent 01-0014-500 Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C.
ESC-qualified BD matrigel BD Biosciences 35-4277 Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately.
StemSpan SFEM  STEMCELL Technologies 9650 Aliquot, freeze at -20 °C.
ascorbic acid, powdered Sigma-Aldrich A4403-100MG Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
recombinant human stem cell factor (SCF) R & D Systems 255-SC-010 Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3) R & D Systems 203-IL-010 Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
erythropoietin (EPO) R & D Systems 287-TC-500 Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R & D Systems 291-G1-200 Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522 Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone Sigma-Aldrich D4902-25MG Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
SAHA (vorinostat) Cayman Chemical 149647-78-9 Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
12 well tissue culture plate Fisher Scientific 08-772-29
15 ml conical tube Sarstedt 62553002
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 well tissue culture plate Fisher Scientific 08-772-1B
35 mm tisue culture plates BD Biosciences 353001
10 ml disposable serological pipettes Fisher Scientific 13-675-20
5 ml disposable serological pipettes Fisher Scientific 13-675-22
2 ml disposable serological pipettes Fisher Scientific 13-675-17
20 μl pipette tips, barrier tips Genessee 24-404
glass Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
pipette aid Fisher Scientific 13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F Addgene 27077
pCXLE-hSK Addgene 27078
pCXLE-hUL Addgene 27080
pCXLE-EGFP Addgene 27082
pCXWB-EBNA1 Addgene 37624

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  2. Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8, (1), 96-105 (2011).
  3. Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17, (3), 253-263 (2006).
  4. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, (7151), 313-317 (2007).
  5. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, (5928), 797-801 (2009).
  6. Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460, (7259), 1132-1135 (2009).
  7. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, (5), 409-412 (2011).
  8. Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313, (6005), 812-815 (1985).
  9. Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, (4), 359-369 (2009).
  10. Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, (4), 713-720 (2010).
  11. Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8, (5), 532-538 (2006).
  12. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  13. Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
  14. Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
  15. Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3, (2), 166-179 (2011).
Effektiv iPS Cell Generation fra Blood hjelp episomer og HDAC hemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hubbard, J. J., Sullivan, S. K., Mills, J. A., Hayes, B. J., Torok-Storb, B. J., Ramakrishnan, A. Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors. J. Vis. Exp. (92), e52009, doi:10.3791/52009 (2014).More

Hubbard, J. J., Sullivan, S. K., Mills, J. A., Hayes, B. J., Torok-Storb, B. J., Ramakrishnan, A. Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors. J. Vis. Exp. (92), e52009, doi:10.3791/52009 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter