Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att generera mänskliga inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod med hjälp av en episom baserad omprogrammering strategi och histondeacetylas hämmare.
Abstract
Detta manuskript illustrerar ett protokoll för effektivt skapa integrationsfria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från perifert blod med hjälp av episomala plasmider och histondeacetylas (HDAC) -hämmare. Fördelarna med denna metod innefattar: (1) användning av en minimal mängd av perifert blod som utgångsmaterial; (2) nonintegrating omprogrammering vektorer; (3) en kostnadseffektiv metod för att generera vektorfria iPSCs; (4) en enda transfektion; och (5) användning av små molekyler för att underlätta epigenetisk omprogrammering. Kortfattat, perifera mononukleära blodceller (PBMC) isolerades från rutin flebotomi prover och odlades sedan i definierade tillväxtfaktorer för att ge ett starkt proliferativt erytrocyt populationen av progenitorceller som är anmärkningsvärt mottaglig för omprogrammering. Nonintegrating, nontransmissible episomala plasmider uttrycker Oct4, Sox2, Klf4, MYCL, LIN28A och en p53 kort hårnål (sh) RNA är introduced in de härledda erytroblaster via en enda nucleofection. Samtransfektion av en episom som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) möjliggör enkel identifiering av transfekterade celler. En separat replikerande plasmid som uttrycker Epstein-Barr-kärnantigen 1 (EBNA1) sätts också till reaktionsblandningen för ökad expression av episomala proteiner. Transfekterade celler stryks sedan ut på ett skikt av bestrålat mus embryonala fibroblaster (iMEFs) för fortsatt omprogrammering. Så snart iPSC lika kolonier uppträder vid ungefär tolv dagar efter nucleofection, är HDAC-hämmare sättas till mediet för att underlätta epigenetisk ombyggnad. Vi har funnit att införlivandet av HDAC-hämmare rutinmässigt ökar alstringen av fullt omprogrammerade IPSC kolonier av 2-faldigt. När IPSC kolonier uppvisar typiska mänskliga embryonala stamceller (hESC) morfologi, de är försiktigt över till enskilda Imef-belagda vävnadsodlingsplattor för fortsatt tillväxt och expansion.
Introduction
iPSCs härrör från somatiska vävnader via ektopisk uttryck för en minimal uppsättning pluripotensbestämmande gener. Denna teknik var ursprungligen visas genom retroviral transduktion av humana fibroblaster med Oct4, Sox2, Klf4 och cMYC, som är mycket uttrycks i pluripotent tillstånd 1. Dessa övergående uttryckt "omprogrammering faktorer" förändrar målcellens epigenetisk landskapet och genuttryck profil analog med mänskliga embryonala stamceller 2. När du väl skapat, kan iPSCs potentiellt differentieras i någon vävnadstyp för vidare utredning. Således håller de lovande för användning inom regenerativ medicin, sjukdomsmodellering och genterapitillämpningar. Men stör genomet med integrerande virus har potential att förändra endogen genexpression, inflytande cellulär fenotyp, och i slutändan förspänna vetenskapliga resultat. Dessutom kan slump virala integrationer leda till skadlig cellulär effekter, bland annat möjligheten för malign transformation 3 eller åter uttryck av de onkogena transgener 4. Framtida kliniska applikationer kommer att kräva icke-integrerande iPSC generation.
Episomer, som är extra kromosom cirkulära DNA-molekyler, har en strategi för att skapa kostnadseffektiva, integration fria iPSCs 5. Kombinationen av episomala vektorer som visas i tabell 1 uttrycka omprogrammeringen faktorer Oct4, Sox2, Klf4, MYCL och LIN28A. Den pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-plasmiden innehåller även ett p53 shRNA för tillfällig suppression av TP53 för att förbättra cellulär omprogrammering 6. Den replikerande pCXWB-EBNA1 vektor främjar amplifieringen av omprogrammeringsinstruktioner faktorer och ökad omprogrammering effektivitet genom att tillhandahålla en övergående ökning av EBNA1 expression 7. Den pCXLE_EGFP plasmiden kan tillsättas till den nucleofection blandningen i syfte att determining transfektionseffektiviteten eller för cellsorteringstillämpningar. Med undantag för p CXWB-EBNA1 de episomala plasmider som används i detta protokoll innehåller Epstein-Barr-virus ursprung av viral replikation och EBNA1-genen, som medierar replikation och delning av episom under delning av värdcellen 8. De episomer spontant förlorade med successiv iPSC expansionen 7. Subkloning och karakterisering av iPSCs med episomal vektor förlust, vilket kan utläsas av förlust av EGFP uttryck, kan leda till helt integrations fria iPSCs för framtida kliniska tillämpningar.
Inneboende till processen för iPSC generation är undertryckande av härstamning specifika gener och reaktivering av pluripotens-associerade gener. Reglering av genuttryck sker på flera nivåer i kärnan, inbegripet ändringar DNA och kromatin att tillåta transkriptionsfaktorer, regulatoriska DNA-element, och RNA-polymeras tillgång till målgener. Ombyggnad av den epigenetiska landskapet via globala kromatin ändringar är en viktig komponent för att åter uttryck för pluripotens genetiska programmet. En specifik kromatin modifiering som är viktig i regleringen av genuttryck är acetylering av histoner vid särskilda lysinrester, vilket ger tillgång till målet gener genom minskad spänning histon-DNA pole. HDAC-hämmare är små molekyler som har visat sig öka iPSC omprogrammering och hESC självförnyelse 9,10, sannolikt på grund av att stödja den acetylerade staten 11. Protokollet som beskrivs nedan, anpassad från en tidigare publikation med hjälp av integrerande lentiviruses 12, ger en steg-för-steg metod för optimerad iPSC generering från perifert blod med hjälp episomer och HDAC-hämmare. Koncentrationerna HDAC-inhibitor som används här är hälften av de som beskrivs av Ware et al., 9, och har rutinmässigt lett till en 2-faldig ökning i fullt omprogrammerade IPSC kolonier över standardenepisomala omprogrammering protokoll utan HDAC-hämmare. Denna nivå av omprogrammering är i nivå med effektiviteten som vi observerar med lentivirala metoder. Med hjälp av detta protokoll, har vi på ett effektivt sätt genererat iPSC från individer som gamla som 87 år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftligt informerat samtycke, som godkänts av Institutional Review Boards för Fred Hutchinson Cancer Research Center och Children "s Hospital of Philadelphia, erhölls från patienter innan samla perifera blodprover. Alla institutionella riktlinjer observerades. Alla djurförsök inklusive MEF generation och teratom bildningen godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Ficoll Separation av PBMC och Expansion av erytroblaster - Dag 0
- Späd perifert blod 1: 1 med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). I en 15 ml rundbottnad polystyrenrör, noggrant skikt 7 ml utspätt blod på 3 ml rumstemperatur Ficoll-Hypaque.
- Centrifugera provet vid 400 xg under 30 min.
- PBMC kommer ha löst till gränsytan mellan plasman och Ficoll-Hypaque, sedd som en grumlig vit skiktet. Använd en steril överföringspipett, samla PBMCs i ett 15 ml koniskt rör. Ta volymen till 10 ml med hjälp DPBS.
- Med hjälp av en hemacytometer, räkna PBMCs.
- Pipettera 2 x 10 6 PBMC till en separat 15 ml koniska rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min. Centrifugera ner de kvarvarande celler och frysning vid en koncentration av 2 x 10 6 PBMC / ml i 90% fetalt bovint serum (FBS) / 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Förbered Expansion Medium: QBSF-60 serumfritt medium (skyddat från ljus) + penicillin / streptomycin (1%) + askorbinsyra (50 ng / ml) + stamcellsfaktor (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + erytropoietin (EPO, 2 U / ml) + insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexametason (1 uM; skydda mot ljus; tina en färsk alikvot varje media ändras).
- Resuspendera 2 × 10 6 PBMC i 2 ml nybakade Expansion Medium och placera i en brunn i en 12 brunnars vävnadsodlingsplatta och inkubera i 37 ° C fuktad inkubator med en atmosfär av 5% O2, 5% CO2, och 90% N2.
- På dag 3 och dag 6, byt media.
- Samla upp cellerna och tvätta väl med 2 ml av QBSF-60 för att samla eventuella återstående celler.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g under 5 min och aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 2 ml ny Expansion Medium och återföra dem till samma 12 brunnar.
2. programmera celler genom Nucleofection - Dag 9
- Pipet omprogrammeringen plasmider i en steril 1,5 ml Eppendorf-rör (Tabell 1).
- Blanda nucleofection lösningen med Supplement (tillhandahålls av tillverkaren) och pipett i en steril 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Pipettera 2 ml av expansionsmedium i en brunn i en 12-brunnsplatta och placera i en befuktad 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2, och 90% N 2) för jämviktsinställning innan tillsats av celler.
- Samlaodlade celler och tvätta väl med 2 ml av QBSF-60 för att samla in kvarvarande celler.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min och aspirera supernatanten.
- Tvätta cellerna genom återsuspendering i 5 ml DPBS och centrifugering vid 300 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 100 pl nucleofection lösning + Supplement, var noga med att undvika att skapa bubblor.
- Pipettera cellsuspensionen in i rör innehållande omprogrammeringen plasmider, pipett upp och ned en gång, och pipettera provet i botten av nucleofection kyvett.
- Placera kyvetten i nucleofection maskinen och kör program T-019.
- Överför 100 | il av förvärmt Expansion Medium (från den utjämnande plattan i steg 2,3) in i nucleofection kyvett.
- Omedelbart samla hela provet och insättning i brunnen förvärmda Expansion Medium. Undvik att samla den vita, flytande döda cellrester. Placera plattan i en fuktad 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2, och 90% N 2) för tillväxt.
3. Plating matarceller - Day 10 eller 11
- På dag 10, plattmatarceller.
- Coat en 6 och vävnadsodlingsplatta med gelatin.
- Pipettera 1 m av 0,1% gelatin i Hanks buffrade saltlösning (HBSS) till varje brunn i plattan.
- Placera plattan i en fuktad 37 ° C inkubator i åtminstone 5 min.
- Omedelbart före användning aspirera gelatinlösningen från plattan.
- Tina en ampull med 2 x 10 6 mus embryonala fibroblaster som bestrålats vid 3000 cGy i 10 ml förvärmd MEF media (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicillin / streptomycin (1%)).
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min och aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i 12 ml MEF Media och pipett 2 ml into varje brunn i gelatinbelagda 6-brunnsplatta. Placera plattan i en fuktad 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2, och 90% N 2) fram till dag 12.
- Coat en 6 och vävnadsodlingsplatta med gelatin.
4. Plätering Celler på matarceller och ändra Medium - Dag 12
- Samla nucleofected celler till ett 15 ml koniskt rör och samla eventuella återstående celler genom tvättning av brunnen med 2 ml av QBSF-60. Centrifugera provet vid 300 xg under 5 minuter.
- Förbered Omprogrammering Medium: Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) + FBS (10%) + icke-animalisk L-glutamin (1 mM) + icke-essentiella aminosyror (NEAA, 1%) + penicillin / streptomycin (1%) + β merkaptoetanol (0,1 mM) + basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, tillade färska vid utfodring, 10 ng / ml) + askorbinsyra (tillsatt färska vid utfodring, 50 mikrogram / ml).
- Aspirera supernatanten och slamma cellerna i 12 ml Omprogrammering Medium. Pipettera 2 ml per brunn av cellsuspension i6 brunnar av matarceller (framställd i avsnitt 3). Centrifugera plattan vid 50 xg under 30 min vid rumstemperatur.
- Placera plattan i en fuktad 37 ° C inkubator (5% O2, 5% CO2, och 90% N 2) för tillväxt. Ändra Omprogrammering Medium varannan dag tills IPSC kolonier börjar visas (1-2 veckor).
- Förbered hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum Byte (20%) + penicillin / streptomycin (1%) + NEAA (1%) + icke-animaliskt L-glutamin (1 mM) + natriumpyruvat (1%) + natriumbikarbonat (0,12%) + β-merkaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (tillsatt färsk vid utfodring, 10 ng / ml)
- Förbered HDAC-hämmare: natriumbutyrat (tillsatt färska vid utfodring, 100 M), suberanilohydroxamic syra (SAHA, tillade färska vid utfodring, 200 nM). När IPSC kolonier visas, börjar mata cellerna med hESC Medium + HDAC-hämmare, ändra medel varje dag.
OBSERVERA: Natriumbutyrat är en liten molekyl som är adsorberat till plaströr, thärför förvara den i ett borosilikatglas rör vid 4 ° C.
5. Isolering IPSC Kloner
- När IPSC kolonier är stora nog att isoleras (20-25 celler), plocka dem med en P20-pipett.
- Förbered HDAC-hämmare: natriumbutyrat (tillsatt färska vid utfodring, 100 M), SAHA (tillsatt färska vid utfodring, 200 nM)
- Placera isolerade kolonierna på iMEFs i enskilda 35 mm skålar innehållande hESC Medium + HDAC-hämmare + Kloning & Recovery Supplement.
- Dagen efter att plocka kolonierna, ändra på medellång till stamceller från mänskliga embryon Medium + HDAC-hämmare.
- Ändra mediet varje dag fram till IPSC kolonier är redo för passage.
- Ta HDAC-hämmare från mediet när kolonierna stabiliseras vid passage 2-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre dagar efter nucleofection och före utstrykning av nucleofected celler på iMEFs bör effektiviteten av framgångsrik nucleofection uppskattas genom fluorescensmikroskopi för EGFP. Figur 1 visar en typisk nucleofection experiment med ungefär 5-10% av den totala cellpopulationen som uttrycker EGFP.
Omprogrammerade IPSC kolonier kommer att börja visas ungefär två veckor efter nucleofection. Kolonierna är generellt cirkulär med väldefinierade gränser och kan identifieras genom karakteristiska hESC morfologi, inklusive (1) små, tätt packade celler med hög kärnvapen cytoplasma förhållande och (2) synliga nukleolerna (Figur 2, Ljusfält). Ofullständigt omprogrammerade cellerna antingen försämras eller bilda heterogena cellmassor som lätt skiljas från äkta IPSC kolonier.
Av de representativa linjer som vi har valt att karakterisera helt, alla uttrycker standard pluripotens markörer (Figur 2), aktivera endogena pluripotensbestämmande gener (figur 2) och bildar teratom när de injiceras i NOD-SCID-möss.
Figur 1: Nucleofected celler stimulerade PBMC tre dagar efter nucleofection med plasmider innehållande Oct4, Sox2, Klf4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA och eGFP (Skala bar är 100 um)..
Figur 2:. IPSC Karakterisering IPSC genereras med hjälp av denna metod uppvisar hESC-liknande morfologi när den odlas på Imef (Bright fält), testar positivt för alkaliskt fosfatas aktivitet (AP), och är positivagenom immunhistokemi för pluripotens markörer TRA-1-60, TRA-1-81, och SSEA4. Dessutom är endogen expression av pluripotens gener Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K), och cMyc (M) kan detekteras genom RT-PCR. (Alla skala barer är 100 mikrometer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Episom | Massa per reaktion (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-hSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
Tabell 1:. Optimal Förhållande Omprogrammering plasmider 6 Dessa plasmider finns att beställa via Addgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För framgångsrik iPSC generation när du använder detta protokoll, finns det flera viktiga förbehåll som bör beaktas. Under erytroblast expansionsfasen, bör medieförändringen schemat följas strikt, eftersom avvikelser kan leda till ineffektiva stimulering av målet stamceller befolkning och en lägre verkningsgrad iPSC generation. Det är viktigt att göra nya expansionen medium med färska dexametason med varje medieförändring; och QBSF-60 basmedium och dexametason bör skyddas från ljus under lagring. Under nucleofection är DPBS tvätt avgörande för att avlägsna överskott lösta ämnen från cellsuspensionen som kan orsaka den elektriska strömmen från Nucleofector till båge, med utbredd celldöd. Cirka 10 dagar efter nucleofection bör plattan undersökas dagligen för iPSC koloniutseende. När flera små kolonier är närvarande, bör Omprogrammering Medium ändras till hESC Medium (med HDAC-hämmare) som prolonged exponering för serum kan framkalla spontan differentiering.
Beroende på laboratorie installation och tillgängliga resurser, kan ändringar av protokollet övervägas. Vi föredrar en låg O2 inkubator eftersom hypoxiska förhållanden har visat sig öka effektiviteten i iPSC generation 13; har vi dock haft framgång genererar iPSCs från perifert blod med hjälp normoxiska förhållanden med 5% CO2. Därför kan en standard befuktad CO2-inkubator kan också användas. De MEF som används i detta protokoll kan köpas från ett Life Science-leverantör. Men på grund av kommersiella batch variation, föredrar vi att generera iMEFs från CF-1 möss efter en publicerad protokoll för MEF isolering, kultur, och bestrålning 14. Införandet av HDAC-hämmare är en gynnsam aspekt av detta protokoll som epigenetiska ombyggnad är en viktig aspekt av cellulär omprogrammering 9,15. HDAC-hämmare kan utelämnas, men antalet fully omprogrammerade IPSC kolonier kommer att minska. Slutligen har vi genererat iPSCs med den här metoden med en benmärgsprov med inga ytterligare ändringar behövs.
Sammanfattningsvis använder samma protokoll för en plasmid baserad omprogrammering system som undviker en del av nackdelarna med iPSC generation med integrerande vektorer, inbegripet slumpmässiga insättningar i värdgenomet och säkerhetsfrågor om hantering av rekombinant virus. Dessutom är småskalig virusproduktion och karaktärisering relativt arbetsintensiv jämfört med plasmid generation. Omprogrammering effektivitet kan också variera kraftigt beroende på batch variation inneboende virusproduktion, medan en storskalig produktion av kvalitets plasmider kan leda till konsekvent iPSC generation över tiden. Kombinerat med HDAC-hämmare, erbjuder detta protokoll en effektiv metod för att skapa integration fri och fotavtryck gratis iPSCs för stamcellsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna följande bidrag från NIH för att stödja denna forskning: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), och K12HL0806406 (SKS); och JP McCarthy Foundation (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
