Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

Abstract

Er is een dringende noodzaak om de aanpak voor het repareren van het beschadigde hart, het ontdekken van nieuwe therapeutische geneesmiddelen die geen toxische effecten op het hart hebben, en het verbeteren van de strategieën om nauwkeurig te modelleren hart-en vaatziekten te ontwikkelen. Het potentieel van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) technologie benutten om de hartspier te genereren "in een schotel" voor deze toepassingen blijft hoog enthousiasme te genereren. De laatste jaren heeft de mogelijkheid om efficiënt genereren cardiomyogene cellen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) sterk verbeterd, biedt ons nieuwe mogelijkheden model zeer vroege stadia van menselijke hartontwikkeling zonder dergelijke. In tegenstelling tot vele eerdere werkwijzen hartspierdifferentiatie protocol beschreven here ofwel geen celaggregatie of toevoeging van activine A of BMP4 vereisen en robuust genereert celkweken die sterk positief zijn voor cardiaal troponine I en T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klasse homeodomein eiwitIRX-4 (IRX4), myosine regulerende lichte keten 2, ventriculaire / hartspier isovorm (MLC2v) en myosine regulerende lichte keten 2, atriale isovorm (MLC2a) op dag 10 in alle menselijke embryonale stamcellen (hESC) en hiPSC lijnen getest datum. Cellen kunnen worden gepasseerd en onderhouden voor meer dan 90 dagen in de cultuur. De strategie is technisch eenvoudig te implementeren en kosteneffectief. Karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van pluripotente cellen omvat vaak de analyse van referentiemarkeringen, zowel op mRNA en eiwitniveau. Voor eiwitanalyse flowcytometrie een krachtig analytisch hulpmiddel voor de beoordeling van cellen in kweek en het bepalen subpopulatie homogeniteit. Echter, technische variatie in monstervoorbereiding significante invloed kwaliteit van flowcytometrie data. Daarom moet standaardisatie van kleuringsprotocollen vergelijkingen tussen verschillende differentiatie strategieën vergemakkelijken. Bijgevolg geoptimaliseerd kleuringsprotocollen voor de analyse van IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 en TNNT2 door flowcytometrie beschreven.

Introduction

De generatie van hartspiercellen uit hPSCs, inclusief hESC en hiPSC, kan functioneren als een in vitro model van de zeer vroege menselijke cardiale ontwikkelingsprocessen, die inzicht geven in etappes anders niet toegankelijk zijn voor mechanistische studies. Dit model biedt unieke mogelijkheden om de moleculaire pathways die cardiale lineage inzet en lot van de cel specificatie controle te bestuderen. De laatste jaren heeft de mogelijkheid om efficiënt genereren cardiomyogene cellen van hPSCs sterk verbeterd 1-15. Echter, onder protocollen er cellijn variatie met betrekking tot de efficiëntie van het genereren cardiomyogene cellen en timing waarmee de cellen tot expressie kamer merkers (bijvoorbeeld ventrikel en atria). Idealiter voor toekomstige toepassingen van dit modelsysteem homogenere populatie van functioneel gedefinieerde cellen gewenst. In tegenstelling tot eerdere methoden hartspierdifferentiatie protocol beschreven here ofwel ce vereisenll aggregatie of de toevoeging van Activin A of Bone morfogenetische eiwit 4 (BMP4) en robuust genereert culturen zeer positief voor TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v en MLC2a bij dag 10 cellen in alle hESC en hiPSC lijnen getest tot nu toe. De strategie is technisch eenvoudig te implementeren, vooral in vergelijking met driedimensionale kweken, massacultuur of embryoid body strategieën 4-9, en is recentelijk gedefinieerd in een studie die een klein molecuul met selectieve toxiciteit voor hPSCs beschreven (Boheler et al. ) 65. Kenmerken van dit protocol zijn onder andere differentiatie van hPSCs in monolaagkweek behulp van een enkele laag van een hESC gekwalificeerde matrix (Matrigel), volledig gedefinieerde media met behulp van kleine moleculen aan Wnt-signalering (vergelijkbaar, maar toch onderscheiden van 1,2,7,13) moduleren, en geoptimaliseerde flowcytometrie kleuring methoden voor het evalueren van differentiatie efficiency en celidentiteit. Kortom, de voordelen van dit protocol vergeleken met de vorige verslagen zijn onder meer de kosten-effectiveness, reproduceerbaarheid, en zijn hoge efficiency voor het genereren van hartspiercellen tussen meerdere HPSC lijnen, met inbegrip van hESC en hiPSC lijnen.

Flow cytometrie is een krachtige analytische tool voor het beoordelen van de kwaliteit van de cellen in de cultuur en het bepalen subpopulatie homogeniteit, en met de juiste experimentele opzet, kan kwantitatieve metingen geven. Zoals met alle antilichamen gebaseerde strategieën, nauwkeurige interpretatie van experimentele resultaten vereist dat elementen van de test ontwerp met inbegrip van de concentratie en fixatie antilichaam en permeabilisatie voorwaarden (wanneer de doelgroep intracellulaire antigenen) worden zorgvuldig getest voor elk antilichaam als sub-optimale omstandigheden aanzienlijk efficiëntie van antilichaam invloed bindend, en dus, de interpretatie van de resultaten. Belangrijk, indien kwantificatie nodig, monoklonale antilichamen zijn essentieel als polyklonale antilichamen meerdere epitopen herkennen en zijn gevoelig voor batch-to-batch variatie. Momenteel, verschillende antilichamen (polyclonal en monoklonaal) en kleuring protocollen zijn beschreven voor de beoordeling van de in vitro differentiatie, waardoor het moeilijk is om de efficiëntie van cardiomyogenesis onder protocollen 1,2,9,11 vergelijken. Daarom zijn monoklonale antilichamen die beschikbaarheid voor flowcytometrie geanalyseerd. In de toekomst wordt verwacht dat normalisatie van deze kleuringsprotocollen, vooral met betrekking tot kwantificatie, moet vergelijking tussen differentiatiestrategieën beter mogelijk.

De keuze van merkers, en hun overeenkomstige antilichamen worden gebruikt om de zuiverheid van in vitro cardiomyogenesis beoordelen varieert tussen rapporten. TNNT2 is beschouwd als een indicator van de cellen zich in voor de cardiomyogene lot en wordt routinematig gebruikt om de efficiëntie van de cardiale differentiatie protocollen te beoordelen. Echter, wordt TNNT2 ook tot uitdrukking in de skeletspier tijdens de vroege chick en rat ontwikkeling 16,17 en het aanwezig is in de menselijke gladde spier 18 is in vitro. MLC2v en MLC2a worden routinematig gebruikt als surrogaat markers van ventriculaire en atriale subtypes, respectievelijk. Echter, de uitdagingen met vertrouwen op MLC2v en MLC2a om cardiomyocyte subtype te bepalen in het kader van de in vitro differentiatie voort uit het feit dat deze genproducten niet kan worden beperkt tot een specifieke kamer hele ontwikkeling van het hart, van het hart buis door volwassenen. In een lus het knaagdier hart, MLC2a mRNA is overheersend in het atrium / instroom darmkanaal gebied en MLC2v mRNA is overheersend in de ventriculaire / uitstroombaan regio. In de lus hart, co-expressie van MLC2a en MLC2v mRNA waargenomen in de instroom darmkanaal, atrioventriculaire kanaal, en de uitstroom 19,20. Bij 3 dagen na de geboorte, is MLC2v mRNA beperkt tot de ventrikel en 10 dagen na de geboorte, is MLC2a beperkt tot de atria in de neonatale rat hart 19. Daarom interpretatievan gegevens betreffende cardiomyogenesis efficiency en subtype identiteit niet alleen naar de aanwezige hoeveelheid referentiemarkering niveaus, maar moet overwegen het ontwikkelingsstadium (s) waarop de tijdstippen van differentiatie die geanalyseerd overeenkomen. Dit is bijzonder belangrijk aangezien de rijpingsfase van cardiomyogene cellen gegenereerd door in vitro differentiatie van hPSCs lijkt meest die van embryonale / foetale ontwikkeling 21-25. Dus, met een beroep op een marker ruimtelijke expressie in de postnatale hart misschien niet geschikt voor de beoordeling van HPSC-afgeleide cellen, althans in sommige gevallen.

In een poging om de ontwikkeling van meer specifieke criteria voor het bepalen van identiteit cardiomyocyten in vitro te vergemakkelijken, wordt TNNI3 beschouwd als een waardevolle marker voor het evalueren cardiomyogenesis in vitro kunnen alleen de hartspier gedurende embryogenese in kuiken en zebravis 15,20 zijnen afwezig is in menselijke foetale skeletspier 26. Terwijl TNNI1 aanwezig in humane foetale hart is, TNNI3 is de enige TNNI isovorm aanwezig is in de normale volwassen hart 27,28. Wat betreft cardiomyocyte subtype identiteit, IRX4 29-31 is een informatieve marker van cellen met een ventriculaire lot. Op het eiwitniveau, is IRX4 onlangs aangetoond worden beperkt tot de ventrikel van lineaire hartbuis door neonatale stadia van de muis 32. Bijgevolg geoptimaliseerd kleuringsprotocollen voor de analyse van TNNI3 en IRX4 door flowcytometrie beschreven. Bij ons weten is dit de eerste beschrijving van een werkwijze voor efficiënte antilichamen gebaseerde kleuring en analyse van IRX4 niveaus in cardiomyocyten door flowcytometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Oplossing en Mediavoorbereiding

  1. hESC Gekwalificeerde Matrix Coating Stock Solution
    1. Langzaam ontdooien hESC gekwalificeerde matrix (5 ml) op ijs bij 4 ° C 's nachts. Doseer porties in pre-gekoeld, 1,5 ml steriele microcentrifugebuizen en onmiddellijk op te slaan bij -20 ° C.
      OPMERKING: Het volume van de hoeveelheid zal variëren op basis van veel en meestal varieert 270-350 ul. Merk geeft details over volume hoeveelheid vereist om een ​​1x concentratie bij verdunning bekomen in 25 ml zoals beschreven in stap 2.1.
  2. HPSC Media Stock Solutions
    1. Gebruik ultrazuiver water als verdunningsmiddel, tenzij anders aangegeven. Steriliseren van alle onderdelen met behulp van een 0,22 pm filter. Bewaar de volgende als bulkoplossingen bij 4 * C: natriumbicarbonaat (75 mg / ml); citroenzuur (10 mM, pH = 3).
    2. Steriliseren van alle onderdelen met behulp van 0,2 um spuit filter en leg elk als fracties bij -20 ° C: Rho kinase (ROCK) remmer Y-27632 (10mM in DPBS, 100 ui aliquot); L-ascorbinezuur 2-fosfaat (64 mg / ml, 500 ul aliquot); natriumseleniet (70 ug / ml, 100 ui aliquot); transferrine (50 mg / ml, 107 pl aliquot); fibroblastgroeifactor 2 (FGF2, 200 ng / ul in DPBS, 250 ul aliquot); transforming growth factor beta 1 (TGFB1, 100 ng / ul koud 10 mM citroenzuur, 10 pi aliquot).
  3. HPSC Media E8 Solution Samenstelling
    1. Bereid media met aliquots bereid in Stap 1.2: DMEM / F12 (met L-glutamine en HEPES, 500 ml), natriumbicarbonaat (3,62 ml; final: 543 ug / ml), L-ascorbinezuur 2-fosfaat (500 ui; final : 64 ug / ml), natriumseleniet (100 pl, final: 140 ng / ml), transferrine (107 pl, final: 10,7 ug / ml), insuline (1 ml; final: 20 ug / ml), FGF2 (250 gl; final: 100 ng / ml), TGFB1 (10 pl, final: 2 ng / ml).
    2. Combineer alle componenten, filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
  4. HPSC Media E8 met ROCK Inhibitor
    1. Voeg 15 ul ROCK inhibitor tot 12 ml E8 media bereid zoals hierboven en meng. Ervoor te zorgen dat de uiteindelijke concentratie is 10 uM na toevoeging van cellen / media in stap 3.7.
  5. Stock Solutions van Wnt Modulators
    1. Bewaar de volgende fracties bij -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM in DMSO, 15 pl aliquot). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-chinolinyl-benzamide; 10 mM in DMSO, 6 ui aliquot).
  6. Differentiatie Media
    1. Bereid differentiatie media # 1 met RPMI 1640 (met L-glutamine) met 2% B27 minus insuline aan te vullen.
    2. Bereid differentiatie media # 2 met RPMI 1640 (met L-glutamine) met 2% B27 plus insuline te vullen en 2% FBS.
  7. Cel Wash Solution fof Cell Culture
    1. Gebruik Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium of magnesium.
  8. Cel Wash Solution voor flowcytometrie
    1. Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS zonder calcium of magnesium) met 1% FBS. Bewaren bij 4 ° C.
  9. Cel Onderhoud Oplossing voor flowcytometrie
    1. Gebruik Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, zonder calcium of magnesium) met 5% FBS. Bewaren bij 4 ° C.
  10. Fixatie Oplossingen voor flowcytometrie
    1. Gebruik Cytofix buffer als fixatie-oplossing voor TNNI3 en IRX4 antilichamen.
    2. Gebruik 4% paraformaldehyde in 1x PBS (maak vers) als fixatie-oplossing voor TNNT2 en MLC2a antilichamen.
    3. Gebruik 70% methanol / 30% aceton fixatie oplossing MLC2v antilichaam.
    4. Alle oplossingen bij 4 ° C.
  11. Permeabilisatie Oplossingen voor flowcytometrie
    1. Gebruik Phosflow Perm Buffer III als permeabilisatie oplossing fof TNNI3 en IRX4 antilichamen. Bewaren bij kamertemperatuur (25 ° C).
    2. Gebruik 0.2% Triton X-100 in 1x PBS zoals permeabilisatie oplossing TNNT2, MLC2v en MLC2a antilichamen. Bewaren bij 4 ° C.
  12. Blocking Solution
    1. Gebruik 10% geit serum in 1x PBS. Maak verse en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.

2 Plaat Coating

  1. Langzaam ontdooien 1 portie van hESC gekwalificeerde matrix bij 4 ° C gedurende 30 minuten, voeg 25 ml koud DMEM / F12 en meng goed in gesteriliseerd weefselkweek kap onmiddellijk voor het coaten van 6-well platen.
  2. Voeg 1 ml per putje van een 6-well plaat onder gesteriliseerd weefselkweek kap (1 aliquot van de hESC gekwalificeerde matrix voldoende coaten vier 6-well platen).
  3. Laat hESC gekwalificeerd matrix gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder de motorkap te stellen. Zuig het overtollige hESC gekwalificeerde matrix en voeg 2 ml E8 media met ROCK-remmer aan elk putje. Gebruik platen direct, of desired bewaren bij 4 ° C onmiddellijk na plating maximaal 1 week op kamertemperatuur gedurende 30 min vóór gebruik.

3 Passage en onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs in monolaagkweek

  1. Behouden hPSCs in monolaagcultuur in 6-well platen en voer alle stappen onder een steriele weefselkweek kap.
  2. Gebruik HPSC lijnen die goed worden vastgesteld (> p20) en vertonen een homogene morfologie zonder de aanwezigheid van cellen met een neurale, epithelial- of fibroblast-achtige morfologie. Zorg prolifereren robuust en gemiddeld passage drie dagen bij 75% confluentie bij gezaaid 0.75 x 10 6 per putje.
  3. Passage hPSCs met dissociatie van de enkele cel niveau minstens 5x voor aanvang van de differentiatie naar maximale differentiatie efficiëntie te garanderen. Om passage hPSCs, aspireren E8 media en wassen cellen tweemaal met 4 ml van 1x DPBS (voorverwarmd tot kamertemperatuur). Voeg 1 ml van de cel detachment oplossing (voorverwarmd tot kamertemperatuur) aan elk putje en laat het goed rusten gedurende 3-7 minuten, tot celgrenzen beginnen round-up.
  4. Gebruik een katoenen aangesloten glazen pipet met gloeilamp cellen los en overbrengen naar een 15 ml conische buis met 1 ml DMEM / F12 media (de cellen loslaten oplossing inactiveren).
  5. Breng 10 pl aliquot van cellen en meng met 10 pi trypan blauw in een microcentrifugebuis. Telling cellen (bijvoorbeeld automatische of handmatige hemocytometer) terwijl overige cellen verzameld door centrifugatie bij 130 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Met behulp van dit protocol, verwachten dat 70-80% levensvatbaarheid behulp van een geautomatiseerd hemocytometer en gaan vooruit, basis van alle mobiele nummers op het totaal-cel-tellingen.
  6. Zuig media en resuspendeer de celpellet in DMEM / F12 tot een eindconcentratie van 0,75 x 10 6 cellen per 500 ui.
  7. Voeg 500 ul van de celsuspensie aan elk putje van een 6-well plaat waarbij elk putje contains 2 ml E8 media met ROCK-remmer, bereid in stap 2.3. Het verlaten van plaat op het werkblad, zachtjes bewegen in een front-to-back en side-to-side beweging gelijkmatig verspreiden cellen over het goed. Terug cellen incubator bij 5% CO2, 37 ° C.
  8. Beginnen 24 uur na passage, vervang de media dagelijks met 2 ml / putje E8 zonder ROCK inhibitor. Optimaliseer entdichtheid tot 100% confluentie voor aanvang van differentiatie bereiken. Seed 0.75 x 10 6 cellen / putje vier dagen voor aanvang van differentiatie, maar optimaliseren voor elke cellijn als nodig.

4 Cardiomyocyte Inductie van hPSCs door Selectieve modulatie van de Wnt-route

  1. Vernieuwen media (2 ml / putje) dagelijks gedurende 0-7 dagen, en om de andere dag na dag 8.
  2. Op dag 0, beginnen differentiatieproces door vervanging E8 media differentiatie media nr.1. Voeg 1.2 ul CHIR (6 uM definitief) aan elk putje. Herhalen op dag 1.
  3. Op dagen 2-3, te vervangen door verse differentiatie media # 1.
  4. Op dag 4 wordt verse differentiatie medium nr.1. Voeg 1 ul IWR-1 (5 uM final) aan elk putje. Herhalen op dag 5.
  5. Op dagen 6-7, vervangen met verse differentiatie medium nr.1.
  6. Op dag 8, te vervangen door verse differentiatie media # 2.
  7. Blijf vervangen differentiatie media nr.2 elke dag gewenste cultuur.
  8. Indien gewenst, passage hartspiercellen met behulp van de cel detachement oplossing volgende stappen in 3,3-3,6, maar het vervangen van de media met differentiatie media # 2. Tijdens de passage, distantiëren hartspiercellen in kleine clusters van ~ 3-10 cellen. Zaad op ~ 6 x 10 5 cellen per putje met hESC gekwalificeerde matrix beklede putjes en differentiatie media 2 #.

5 Het verzamelen van cellen voor flowcytometrie

  1. Voer alle overige aspecten van de stappen 5-9 op het lab bank (dat wil zeggen, niet steriel).
  2. Zuig groeimedia en wassen cellen tweemaal met 1x PBS.Voeg 1 ml van de cellen loslaten oplossing (voorverwarmd tot kamertemperatuur) aan elk putje en laat men het gedurende 3-7 minuten, tot celgrenzen beginnen round-up. Gebruik een katoenen aangesloten borosilicaatglas wegwerp 9 "pipet met lamp aan cellen los en breng in een 15 ml conische buis op ijs.
  3. Gedurende verdere protocol handhaven cellen op ijs en centrifugeren uitgevoerd bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 * C.
  4. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Resuspendeer cellen in 10 ml cel wasoplossing met een 10 ml serologische pipet met herhaalde trituratie naar cel klonten waarborgen worden gedispergeerd in afzonderlijke cellen. Tellen cellen zoals in stap 3.5, terwijl overige cellen verzameld door centrifugatie.
  5. Resuspendeer cellen in cel wasoplossing zorg volledig disaggregeren cel pellet en hoeveelheid 1 x 10 6 cellen per buisje met ronde bodem. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing.

6 Fixatie enPermeabilisatie van Cellen voor intracellulaire Antigen kleuring

  1. Voeg 100 ul fixatie oplossing celpellet. Toevoegen oplossing druppelsgewijs onder voortdurend zachtjes vortexen en vervolgens op ijs gedurende 15 minuten.
  2. Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing.
  3. Voeg 100 ul permeabilisatie oplossing cel pellet. Toevoegen oplossing druppelsgewijs onder voortdurend zachtjes vortexen vervolgens op ijs gedurende 30 minuten. Gebruik fixatie en permeabilisatie voorwaarden als beschreven voor elk antilichaam in tabel 1.
  4. Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten na permeabilisatie.
Primary Antibody (Clone) Immunogeen / Epitoop Erkend Istotype Controle Bedrag van primair antilichaam per 1 x 10 6 cellen in 100 ul Fixatie Solution Permeabilisatie Solution Secundair antilichaam Hoeveelheid secundaire antilichaam / 1 x 10 6 cellen in 100 ul
Voor percentage positieve metingen Voor Antigen Kwantificering
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (menselijke) Muis IgG2b 1,0 ug 3,0 g BD Cytofix BD Phosflow perm III Geit anti-muis IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Volledige lengte gezuiverd natief menselijk troponine T eiwit. Muis IgG1 1,0 ug 2,0 g 4% PFAin 1% PBS 0.2% Triton X-100 in 1% PBS Geit anti-muis IgG 1 - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Mouse IgG2a 2,0 g 3,0 g 70% methanol / 30% aceton 0.2% Triton X-100 in 1% PBS Geit anti-muizen IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) volledige lengte humaan recombinant eiwit van humane MYL7 geproduceerd in E. coli Muis IgG1 0.5 ug 3,0 g 4% PFA in 1% PBS 0.2% Triton X-100 in 1% PBS Geit anti-muis IgG 1 - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		Konijn IgG 0.5 ug 0.5 ug BD Cytofix BD Phosflow perm III Geit anti-raBBIT IgG-PE 600 ng

Tabel 1 antilichaamconcentraties. Vind je het primaire antilichaam, kloon (indien monoklonale), geoptimaliseerde concentraties en fixatie en permeabilisatie voorwaarden voor elke primaire en secundaire antilichaam gebruikt voor flowcytometrie analyses. Zoals antilichaam stock concentraties variëren tussen verkopers van dezelfde kloon, eindconcentraties van elk antilichaam per 1 x 10 6 cellen in een vaste testvolume, dan verdunningen, worden voorzien. Het immunogeen gebruikt om het antilichaam te genereren, of epitoop herkend door antilichamen, zoals voorzien door de fabrikant, is genoteerd, maar werd hier niet experimenteel geverifieerd.

7 antilichaamkleuring

  1. Voor elk experiment, inclusief een onbesmet controle per fixatie / permeabilisatie conditie en de juiste isotypecontrole voor elke primaire antilichaam gebruikt. Omvatten niet-cardiomyocyte celtypes als negatieve controles (bijvoorbeeld pluripotente stamcellen of fibroblasten). Gebruik isotype controles in dezelfde concentratie als overeenkomstige primaire antilichaam (zie tabel 1).
  2. Resuspendeer cellen in 100 ul blokkeren oplossing met behulp van een P200 pipet om cellen van elkaar te scheiden. Set monsters op ijs gedurende 25 min met zachte wiegen.
  3. Zonder het verwijderen blokkeeroplossing toevoegen primair antilichaam of isotype controle per richtlijnen in tabel 1. Incubeer 45 min op ijs met zachte wiegen.
  4. Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten na het primaire antilichaam labeling.
  5. Als een fluorofoor-geconjugeerde primaire antilichaam wordt gebruikt, gaat u verder met 8.1. Wanneer een geconjugeerde primaire antilichaam wordt gebruikt (bijvoorbeeld voor alle markers beschreven), voert labeling met secundaire antilichaam dat als volgt geconjugeerd aan een fluorofoor.
  6. Resuspendeer cellen in 100 ul blokkeren oplossing met behulp van een P200 pipet om DISAggregate cellen.
  7. Voeg secundair antilichaam per richtlijnen in tabel 1. Incubeer 30 min op ijs met zachte wiegen.
  8. Voeg 3 ml cel wasoplossing. Verzamel cellen door centrifugeren en zuig oplossing. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten na het secundair antilichaam labeling.

8 Voorbereiding van de cellen voor flowcytometrie

  1. Resuspendeer cellen in 400 ul celonderhoud oplossing met behulp van een P1000 pipet om cellen van elkaar te scheiden.
  2. Bereid een cel zeef dop op een ronde bodem buis door voorbevochtiging met 50 ul celonderhoud oplossing. Stel buis op ijs. Gebruik de cel zeef muts om te voorkomen celaggregaten van verstopping van de flowcytometer.
  3. Transfer cel oplossing voor zeefdop cel en laat celsuspensie uitlekken door de zwaartekracht. Tik onderkant van de buis zachtjes op de bank top als nodig, zodat cellen worden verzameld in de buis en zo snel terug zetten op ijs mogelijk. Spoel zeef met 250 ul celonderhoud zolution om maximale herstel van cellen te verzekeren.
  4. Aanvullen cellen op ijs en bescherm tegen licht tot door stroomcytometrie geanalyseerd.

9 Flowcytometrieanalyse

Gedetailleerde overname instellingen zal variëren naargelang de instrumenten. Fundamentele parameters te overwegen voor optimale gegevensverzameling worden hieronder beschreven.

  1. Voor optimale stabiliteit stroom voor dat de spuitmond overschrijdt 5-6x de diameter van de cel wordt geanalyseerd.
    OPMERKING: Dit kan variëren tussen instrumenten, maar is een belangrijke overweging, zowel voor de analyseapparatuur en het selecteren van de juiste nozzle grootte voor cel sorteren. De gemiddelde diameter van dag 10 cardiomyocyten 11 urn (tussen 8-14 micrometer); dus een standaard 150 urn monsterinjectie buis analysator werkt goed.
  2. Vlak voor gegevensanalyse, vortex elke buis kort cel aggregaten te dispergeren.
  3. Optimaliseer voorwaartse en zijwaartse verstrooiing voltage instellingen voor elk celtype gebaseerd opongekleurde control elk fixatie / permeabilisatie conditie gebruikt in het experiment zodanig dat de populaties van belang op schaal en gecentreerd (figuur 2A).
    1. Handhaaf deze instellingen gedurende een enkel experiment en zijn consistent van experiment om te experimenteren op hetzelfde instrument, als belangrijke verschuivingen potentiële problemen met de flowcytometer of monstervoorbereiding kunnen wijzen.
  4. Voor elke fluorofoor, analyseren de isotypecontrole en stel de juiste laser spanning aan de minimaal vereiste lichtsterkte van een fluorescentie histogram dat zowel de linker en rechterkant van de piek geeft verkrijgen bepalen. Handhaving van de laser-instellingen voor elke isotypecontrole bij de verwerving van gegevens op overeenkomstige-antilichaam gekleurd monsters.
    OPMERKING: Signal drift vaak optreedt na verloop van tijd op hetzelfde instrument. Het is cruciaal om laser hier op het begin van elk experiment op basis van de juiste isotype regelaar.
  5. Verzamel minimaal10.000 evenementen. 50.000 events voorkeur.
  6. Voor statistische analyses, de poort van de levende cellen bevolking om vuil (Figuur 2A) uit te sluiten. Bepaal percentage positieve cellen in de populatie op basis gated marker plaatsing die ≤2% bijdrage maakt van isotype controle, zoals getoond in figuur 2B, C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Op dag 0, cellen 100% confluent met compact morfologie en minimale celresten. Op dagen 1-2 is het gebruikelijk aanzienlijke celdood (40-50%) zien, maar verbonden cellen compact morfologie (figuur 1A) behouden. Gedurende deze tijd, media oranje en troebel. Roze media geeft overmatige celdood, en in dit geval, bevestig met trypaanblauw en staken indien celdood hoger is dan 70%. Cellen zal herstellen tijdens dagen 3-4 en de dichtheid toeneemt. Tijdens de dagen 5-6, minimal celdood optreedt en dichte patches kunnen beginnen te verschijnen. Per dag 7-8, wordt een samenvloeiende monolaag bereikt met compacte morfologie afgewisseld met dichte patches. Cellen beginnen spontaan een krimp van dag 8 en de eerste weeën zullen vaak zichtbaar in de dichte vlekken zijn. Per dag 10, is robuuster krimp waargenomen en zal blijven verspreid over de cultuur in de daaropvolgende dagen. Immunocytochemie kleuring voor α-actinine en TNNT2 tonen sarcomeer structuur(Figuur 1A). Zoals gemeten met behulp van kwantitatieve real time polymerase-kettingreactie (qRT-PCR), mRNA niveaus van referentiemarkeringen van mesoderm en cardiomyogene engagement weergave tijdelijke profielen zoals verwacht (Figuur 1B), met robuuste expressie van cardiale markers Homeobox eiwit NKX-2.5 (Nkx2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v en myosine-6 ​​(MYH6). Zeer laag tot niet-detecteerbare niveaus van de gladde spieren (myosine zware keten 11, MYH11) en de skeletspieren (myogenin, MYOG) markers zijn routine. Consistent met de vroege ontwikkeling waar expressie wordt waargenomen in zowel de hartspier en skeletspieren alvorens wordt beperkt tot de skeletspier in de volwassen 20,27,28, troponine isovormen TNNI1 en TNNI2 zijn robuust ontdekt tijdens dagen 7-8.

Consistent met andere rapporten, dit in vitro differentiatie strategie genereert cardiomyocyten met kenmerken van vroege cardiale voorlopercellen (afgeronde morfologie, co-expressie van MLC2a, MLC2v) 19 30,32. In flowcytometrie, zal de lichtverstrooiing profielen variëren tussen celtypen en veranderen aanzienlijk tussen fixatie / permeabilisatie omstandigheden (figuur 2A). Onder deze verschillende cellen bereidingsomstandigheden, flowcytometrie analyse blijkt isotype controles enkele pieken met een duidelijk onderscheid tussen isotype controle-antilichaam en (Figuur 2B). Pluripotente cellen of andere niet-cardiomyocyt cellen zijn negatief voor de hier gebruikte markers.

Met behulp van deze differentiatie en kleuringsprotocol, de resulterende cel bevolking is gewoonlijk 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v +, en 96% MLC2a + per dag 10 van differentiatie, zoals gemeten door middel van flowcytometrie. 99% TNNT2 + cellen waargenomen (figuren 2C, 2D), maar zoals hierboven beschreven, TNNT2 is niet uniektot hartspiercellen tijdens de ontwikkeling en dus de stelling dat de cellen zijn 99% authentieke hartspiercellen na dag 10 is gebaseerd op TNNI3 eiwit. Opgemerkt wordt dat bij voortgezette kweken na dag 10, eiwitniveaus structurele eiwitten high hoewel relatieve genexpressie niveaus overblijven opzichte verlaagd tot expressie piek zoals gemeten met qRT-PCR, overeenkomstig eiwitstabiliteit en personeelsverloop van 3,2 en 3,5 dagen, respectievelijk voor TNNI en TNNT 33. Een voorbeeld van deze waarneming wordt voor TNNT2 (piek mRNA expressie op dag 11 (Figuur 1B), robuust eiwitniveaus op dag 20 + (Figuur 2E).

Figuur 1
Figuur 1 algemeen schema van hartspierceldifferentiatie uit hPSCs en representatieve gegevens. (A) Schematische voorstelling van cardiomyocyte differentiatio n protocol geannoteerd met de bijbehorende fase van afstamming en / of cel lot inzet. Vertegenwoordiger fasecontrastbeelden van cellen bij de grote fasen van het proces van differentiatie. Schaalbalk = 10 um. Uiterst rechts = immuuncytochemie beeld van α-actinine (groen) bedekt met TNNT2 (rood) en kernen (blauw). (B) qRT-PCR-analyse (sonde set, zie de tabel Materials) van 18 referentie-mesoderm en ontwikkeling van het hart markers tijdens de eerste 17 dagen van differentiatie. Alle gegevens zijn een gemiddelde van drie herhalingen biologische elk in drievoud geanalyseerd, waarbij de foutbalken geven standaardfout van het gemiddelde en genormaliseerd tegen actine (ACTB). Bericht niveaus voor alle tijdstippen zijn ten opzichte van de eerste dag van differentiatie waarbij de Ct-waarden zijn detecteerbaar (dwz Ct <35). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 2
Figuur 2 Karakterisering van hartspiercellen door flowcytometrie en elektrofysiologie. (A) lichtverstrooiing profielen van dag 10 hiPSC-afgeleide cardiomyocyten onder verschillende fixatie en permeabilisatie voorwaarden. 50.000 evenementen werden verzameld en de gated bevolking (dwz exclusief afval) worden gebruikt voor statistische analyses wordt in rood weergegeven. (B) histogrammen van IRX4 op dag 10 van de differentiatie met behulp van drie verschillende fixatie / permeabilisatie voorwaarden, ter illustratie van de verschillen in kleuren van de efficiëntie van de methoden. Inzetstukken tonen verschillen in kleuring van IRX4 op hiPSCs met elke conditie. Deze gegevens illustreren waarom methanol / aceton wordt vermeden IRX4 gevolg van lage, maar detecteerbare, vlekken op hiPSCs. (C) histogrammen van TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a op dag 10 versc atie met geoptimaliseerde vlekken voorwaarden voor maximale percentage positieve cellen in tabel 1. (D) histogrammen van TNNT2 van titratie van antilichamen experimenten, die illustreert dat 0,5 ug is het minimum dat vereist is voor het meten van 99% TNNT2 + cellen hoeveelheid, maar dat 2 ug is het verzadigingspunt vereist voor kwantificering. Slechts een isotype controle wordt getoond, maar titratie experimenten worden berekend gebaseerd op het vergelijken elk antilichaam zijn overeenkomstige titratie van isotype controle. (E) Kwantificering van TNNT2 eiwit op cardiomyocyten op dagen 0-24 van differentiatie, voorgesteld als de gemiddelde fluorescentie-intensiteit verschil tussen antilichaam en isotype controle voor elk tijdstip. (F) Actiepotentiaal opgenomen van een spontaan samentrekkende ventriculaire-achtige cardiomyocyt op dag 46 van ontwikkeling met behulp van de gehele celstroom clamp configuratie van de patch-clamp techniek.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

Cellular Biology humane geïnduceerde pluripotente stamcellen flowcytometrie geregisseerd differentiatie cardiomyocyte IRX4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter