Summary
Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.
Abstract
Es ist dringend notwendig, um Ansätze für die Reparatur der geschädigten Herz, die Entdeckung neuer therapeutischer Medikamente, die nicht über toxische Wirkungen auf das Herz, und die Verbesserung der Strategien, um genau zu modellieren Herzkrankheit zu entwickeln. Das Potenzial der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Technik zur Nutzung zu Herzmuskel "in einer Schale" für diese Anwendungen zu generieren weiterhin hohe Begeisterung zu erzeugen. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) effizient zu erzeugen stark verbessert, bietet uns neue Möglichkeiten sehr frühen Stadien der menschlichen Herzentwicklung modelliert nicht zugänglich. Im Gegensatz zu vielen früheren Verfahren, die hier beschrieben Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll keine Zellaggregation oder die Zugabe von Activin A oder BMP4 erfordern und robust erzeugt Kulturen von Zellen, die stark positiv für Herz-Troponin I und T (TNNI3, TNNT2) iroquois- Klasse homeodomain ProteinIRX-4 (IRX4), Myosin regulatorische leichte Kette 2, ventrikuläre / Herzmuskel-Isoform (MLC2v) und Myosin regulatorische leichte Kette 2, Vorhof Isoform (MLC2a) am Tag 10 in allen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) und hiPSC Linien getestet Datum. Zellen können agiert und für mehr als 90 Tage in Kultur gehalten werden. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren und kostengünstig. Charakterisierung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Zellen abgeleitet sind oft die Analyse von Referenz-Markierungen sowohl auf der mRNA-und Proteinebene. Zur Proteinanalyse, Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges analytisches Werkzeug für die Beurteilung der Qualität der Zellen in Kultur und Bestimmen Subpopulation Homogenität. Allerdings können technische Variation in der Probenvorbereitung erheblich beeinträchtigen die Qualität der Durchflusszytometrie Daten. So sollte die Standardisierung von Färbeprotokollen Vergleiche zwischen verschiedenen Differenzierungsstrategien erleichtern. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 und TNNT2 durch Durchflusszytometrie beschrieben.
Introduction
Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hPSCs, einschließlich hESC und hiPSC, kann als ein in vitro-Modell der sehr frühen menschlichen Entwicklungsprozesse Herz funktionieren, die einen Einblick in Stadien nicht anders für mechanistische Studien zugänglich. Dieses Modellsystem bietet einzigartige Möglichkeiten, um die molekularen Signalwege, die Herzlinie Engagement und das Schicksal der Zelle steuern Spezifikation zu studieren. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen effizient zu erzeugen aus hPSCs stark verbessert 1-15. Jedoch unter Protokolle gibt es Zellinie Variation in Bezug auf den Wirkungsgrad bei der Erzeugung von Herzmuskel Zellen und Zeitpunkt, zu dem die Zellen exprimieren Kammer spezifische Marker (zB Ventrikel und Vorhof). Idealerweise sollte für zukünftige Anwendungen dieses Modellsystems, homogener Populationen von Zellen funktionell definiert sind erwünscht. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden, die hier beschriebene Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll nicht ce erfordernll Aggregation oder die Zugabe von Activin A oder Bone morphogenetic protein 4 (BMP4) und robust erzeugt Kulturen sehr positiv für TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v und MLC2a Tag 10 Zellen in allen bisher getesteten humanen embryonalen Stammzellen und hiPSC Linien. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren, insbesondere im Vergleich zu dreidimensionalen Kulturen Massenkultur oder Embryoidkörperbildung basierte Strategien 4-9 und wurde vor kurzem in einer Studie, die ein kleines Molekül mit selektiver Toxizität gegen hPSCs beschreibt (Boheler et al. ) 65. Merkmale dieses Protokoll enthalten Differenzierung hPSCs in Monolayer-Kultur mit einer einzigen Schicht einer hESC qualifizierte Matrix (Matrigel), vollständig definierten Medien mit kleinen Molekülen, um Wnt-Signal (ähnlich, aber unterscheidet sich von 1,2,7,13) modulieren, und optimiert Durchflusszytometrie Färbemethoden für die Bewertung der Effizienz und Differenzierung Zellidentität. Zusammenfassend Vorteile dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Berichten sind die Kosten-Wirksamfreundlicher Genehmigung von Eness, Reproduzierbarkeit und der hohen Effizienz für die Erzeugung Kardiomyozyten unter mehreren HPSC Linien, einschließlich hESC und hiPSC Linien.
Durchflusszytometrie ist ein leistungsstarkes Analyse-Tool zur Bewertung der Qualität von Zellen in Kultur und Bestimmung Subpopulation Homogenität, und mit der richtigen experimentellen Design, können quantitative Messungen liefern. Wie bei allen Antikörpern basierenden Strategien genaue Interpretation der experimentellen Ergebnisse, müssen Teile des Assaydesign einschließlich Antikörperkonzentration und der Fixierung und Permeabilisierung Bedingungen (bei intrazelluläre Targeting-Antigene) werden sorgfältig für jeden Antikörper getestet suboptimalen Bedingungen Leistungsfähigkeit der Antikörper signifikant beeinflussen Bindung und daher die Interpretation der Ergebnisse. Wichtiger ist, wenn die Quantifizierung erforderlich ist, sind monoklonale Antikörper wesentlich, da polyklonale Antikörper können mehrere Epitope erkennen, und sind anfällig für Batch-to-Batch-Variante. Derzeit ist eine Vielzahl von Antikörpern (polyclonal und monoklonal) und Färbungsprotokolle sind für die Bewertung der in vitro Differenzierung beschrieben worden ist, macht es schwierig, die Effizienz der Kardiomyogenese unter 1,2,9,11-Protokolle zu vergleichen. Aus diesem Grund werden monoklonale Antikörper verwendet, wenn verfügbar für alle Durchflusszytometrie analysiert. In Zukunft ist zu erwarten, dass die Standardisierung dieser Färbeprotokollen, insbesondere im Hinblick auf die Quantifizierung, sollte besser zu ermöglichen Vergleich unter Differenzierungsstrategien.
Die Wahl der Marker und ihre entsprechenden Antikörper, verwendet, um die Reinheit des in vitro Kardiomyogenese beurteilen variiert unter Berichte. TNNT2 wurde als Indikator für die Zellen an der Herzmuskel Schicksal gebunden und wird routinemäßig verwendet, um die Effizienz der Herzdifferenzierungsprotokollen zu bewerten. Allerdings TNNT2 wird auch in der Skelettmuskulatur während der frühen Entwicklung Küken und Ratten 16,17 ausgedrückt und in humanen glatten Muskelzellen 18 vorhanden ist in vitro. MLC2v und MLC2a routinemäßig als Surrogatmarker der ventrikulären und atrialen Subtypen verwendet wurden. Herausforderungen mit sich auf MLC2v und MLC2a zu Kardiomyozyten Subtyp im Zusammenhang mit der in vitro Differenzierung bestimmen ergeben sich jedoch aus der Tatsache, dass diese Genprodukte nicht auf einen bestimmten Herzkammer während der Entwicklung durch Erwachsenen beschränken, Herzrohr. In das Nagetier geschleift Herz, MLC2a mRNA vorherrschende in den Trakt Bereich Vorhof / Zufluss und MLC2v mRNA überwiegt in den ventrikulären / Ausflusstrakt Regionen. In der geloopten Herzen, sind Co-Expression von MLC2a und MLC2v mRNAs in den Einflusstrakt, AV-Kanal, und der Ausflusstrakt 19,20 beobachtet. Von 3 Tagen nach der Geburt wird MLC2v mRNA an den Ventrikel eingeschränkt und 10 Tage nach der Geburt wird MLC2a an die Vorhöfe des neonatalen Rattenherz 19 beschränkt. Daher InterpretationDaten hinsichtlich Kardiomyogenese Effizienz und Subtyp Identität nicht nur prüfen, das Vorhandensein und die Menge der Referenzmarker Ebenen, sondern muss die Entwicklungsphase (n), für die die Zeitpunkte der Differenzierung, die analysiert werden, entsprechen berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig, wenn man, dass die Phase der Reifung kardiomyogenen Zellen durch in vitro Differenzierung von hPSCs erzeugt ähnelt am ehesten denen von embryonalen / fetalen Entwicklung 21-25. So, die sich auf räumliche Expression eines Markers in der postnatalen Herz kann nicht für die Beurteilung der HPSC-abgeleiteten Zellen, zumindest in einigen Fällen sinnvoll sein.
In dem Bemühen um die Entwicklung spezifischer Kriterien zur Definition Kardiomyozyten Identität in vitro zu erleichtern, wird TNNI3 als ein wertvoller Marker zur Bewertung Kardiomyogenese in vitro, wie sie zum Herzmuskel gesamten Embryogenese bei Küken und Zebrafisch 15,20 beschränkt seinund ist in der menschlichen fetalen Skelettmuskel 26 fehlen. Während TNNI1 in der menschlichen fetalen Herzens vorhanden ist, ist TNNI3 in normalen erwachsenen Herzen 27,28 die einzige Isoform TNNI vorhanden. In Bezug auf Kardiomyozyten Subtyp Identität, IRX4 29-31 ist eine informative Marker von Zellen mit einer ventrikulären Schicksal. Auf der Proteinebene wurde IRX4 kürzlich gezeigt, an den Ventrikel von linearen Herzrohres durch neonatale Stufen der Maus 32 beschränkt werden. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse TNNI3 und IRX4 durch Durchflusszytometrie beschrieben. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Beschreibung eines Verfahrens zur effizienten Antikörper-basierte Färbung und Analyse IRX4 in Human Kardiomyozyten durch Durchflusszytometrie.
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Protocol
1. Lösung und Medienvorbereitung
- hESC Qualifizierte Matrixbeschichtung Stammlösung
- Langsam tauen hESC qualifizierte Matrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht. Verzichten Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C lagern.
HINWEIS: Das Volumen des aliquoten auf viel variieren und liegt typischerweise im Bereich von 270 bis 350 ul. Hersteller liefert Details über Volumen von aliquoten erforderlich, um eine Konzentration auf 1x Verdünnung in 25 ml zu erreichen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
- Langsam tauen hESC qualifizierte Matrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht. Verzichten Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C lagern.
- HPSC Medienstammlösungen
- Verwenden von ultrareinem Wasser als Verdünnungsmittel, sofern nicht anders angegeben. Sterilisieren alle Komponenten mit einem 0,22 um Filter. Bewahren Sie die folgenden Lösungen wie Groß bei 4 ° C: Natriumbicarbonat (75 mg / ml); Zitronensäure (10 mM, pH = 3).
- Sterilisieren alle Komponenten unter Verwendung von 0,2 um Spritzenfilter und speichern jeweils als Aliquots bei -20 ° C: Rho-Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 (10mM in DPBS, 100 ul Aliquot); L-Ascorbinsäure-2-phosphat (64 mg / ml, 500 ul Aliquote); Natriumselenit (70 ug / ml, 100 ul Aliquote); Transferrin (50 mg / ml, 107 ul Aliquote); Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2; 200 ng / ul in DPBS, 250 ul Aliquot); transforming growth factor beta 1 (TGFß1, 100 ng / ul in kaltem 10 mM Zitronensäure, 10 ul Aliquot).
- HPSC Medien E8 Lösung Zusammensetzung
- Planen Medien mit Aliquots in Schritt 1.2 hergestellt: DMEM / F12 (mit L-Glutamin und HEPES, 500 ml), Natriumbicarbonat (3,62 ml; endgültig: 543 ug / ml), L-Ascorbinsäure-2-phosphat (500 ul; endgültigen : 64 ug / ml), Natriumselenit (100 ul; endgültig: 140 ng / ml), Transferrin (107 ul; endgültig: 10,7 ug / ml), Insulin (1 ml; endgültig: 20 ug / ml), FGF2 (250 ul; Finale: 100 ng / ml), TGFß1 (10 ul; Finale: 2 ng / ml).
- Vereinen alle Komponenten, Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
- HPSC Medien E8 mit ROCK-Inhibitor
- Fügen Sie 15 ul ROCK-Hemmstoff, um 12 ml E8 Medien wie oben hergestellt und gut mischen. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration 10 uM nach Zugabe der Zellen / Medium in Schritt 3.7.
- Stammlösungen von Wnt-Modulatoren
- Bewahren Sie die folgenden Aliquots bei -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM in DMSO, 15 ul Aliquot). IWR-1-(4-(1,3,3a, 4,7,7a-Hexahydro-1,3-Dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-Chinolinyl-benzamid; 10 mM in DMSO, 6 ul Aliquot).
- Differenzierung Medien
- Vorbereitung Differenzierungsmedium # 1 mit RPMI 1640 (mit L-Glutamin) mit 2% B27 Supplement minus Insulin.
- Vorbereitung Differenzierungsmedium # 2 mit RPMI 1640 (mit L-Glutamin) mit 2% B27 Supplement plus Insulin und 2% FBS.
- Zellwaschlösung foder Zellkultur
- Verwenden Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) ohne Calcium oder Magnesium.
- Zellwaschlösung für die Durchflusszytometrie
- Verwenden phosphatgepufferter Salzlösung (PBS ohne Calcium oder Magnesium) mit 1% FBS. Bei 4 ° C lagern.
- Zellinstandhaltungslösungen für die Durchflusszytometrie
- Verwenden ausgeglichener Hank-Salzlösung (HBSS; ohne Calcium oder Magnesium) mit 5% FBS. Bei 4 ° C lagern.
- Fixierung Lösungen für die Durchflusszytometrie
- Verwenden Cytofix Puffer als Fixierungslösung für TNNI3 und IRX4 Antikörper.
- Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd in 1x PBS (machen frisch) als Fixierungslösung für TNNT2 und MLC2a Antikörper.
- Verwenden 70% Methanol / 30% Aceton als Fixierungslösung für MLC2v Antikörper.
- Speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° C.
- Permeabilisierung Lösungen für die Durchflusszytometrie
- Verwenden Phosflow Perm Buffer III als Permeabilisierung Lösung foder TNNI3 und IRX4 Antikörper. Lagerung bei Raumtemperatur (25 ° C).
- Verwenden Sie 0,2% Triton X-100 in 1x PBS als Permeabilisierung Lösung für TNNT2, MLC2v und MLC2a Antikörper. Bei 4 ° C lagern.
- Blocking Solution
- Verwenden 10% Ziegenserum in PBS 1x. Machen frisch und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
2. Plattenbeschichtung
- Langsam tauen 1 Aliquot hESC qualifizierte Matrix bei 4 ° C für 30 min in den 25 ml gekühltes DMEM / F12 und gut mischen in sterilisierten Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung 6-Well-Platten.
- 1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte unter sterilen Gewebekulturhaube (1 Aliquot der hESC qualifizierte Matrix ist die ausreicht, um vier 6-Well-Platten).
- Ermöglichen hESC qualifizierte Matrix für 30 min bei Raumtemperatur unter der Haube gesetzt. Saugen Sie das überschüssige hESC qualifizierte Matrix und 2 ml E8 Medien mit ROCK-Inhibitor in jede Vertiefung. Verwendung Platten sofort, oder wenn desired, Lagerung bei 4 ° C unmittelbar nach der Beschichtung für bis zu 1 Woche und ins Gleichgewicht zu Raumtemperatur für 30 min vor der Verwendung.
3. Passagierung und Wartung von undifferenzierten hPSCs in Monolayer-Kultur
- Pflegen hPSCs in Monolayer-Kultur in 6-Well-Platten und alle Schritte unter einem sterilen Gewebekultur Kapuze.
- Verwenden HPSC Linien, die gut etabliert sind (> P20) und weisen eine homogene Morphologie ohne die Anwesenheit von Zellen mit einem neuronalen, epithelial- oder Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Stellen Sie sicher, Zellen vermehren robust, und im Durchschnitt Durchgang alle drei Tage bei 75% Konfluenz, wenn bei 0,75 x 10 6 pro Vertiefung.
- Passage hPSCs mit Dissoziation in die Einzelzellebene mindestens 5x vor der Differenzierung beginnen, um eine maximale Effizienz zu gewährleisten Differenzierung. Um den Durchgang hPSCs absaugen E8 Medien und waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml 1x DPBS (auf Raumtemperatur vorgewärmt). 1 ml der Zelltrennungsment-Lösung (auf Raumtemperatur vorgewärmt) in jede Vertiefung und lassen Sie das auch ungestört für 3-7 min, bis die Zellgrenzen beginnen, Round-up.
- Verwenden Sie einen Watte-steckt Glaspipette mit Lampe, um Zellen zu entfernen und Transfer in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml DMEM / F12 Medien (um die Zellablösung Lösung inaktivieren).
- Entfernen Sie 10 ul Aliquot der Zelllösung und mit 10 ul Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Zählen von Zellen (beispielsweise automatisiert oder manuell Zählkammer), während der Rest Zellen werden durch Zentrifugation bei 130 × g für 5 min bei Raumtemperatur gesammelt. Über dieses Protokoll, erwarten 70-80% Lebensfähigkeit mit Hilfe eines automatisierten Hämozytometers und Vorwärtsgehen, Grund alle Zellzahlen auf die Gesamtzellzahl.
- Aspirat Medien und Zellpellet in DMEM / F12 bis zu einer Endkonzentration von 0,75 × 10 6 Zellen pro 500 ul.
- Fügen Sie 500 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, wo jeder gut contains 2 ml E8 Medien mit ROCK-Inhibitor, in Schritt 2.3 vorbereitet. Verlassen Platte auf der Arbeitsplatte, sanft in einer Front-to-Back-und Side-to-Side Bewegung gleichmäßig zu verteilen Zellen bewegen sich über den Brunnen. Rück Zellen in 5% CO 2, 37 ° C Inkubator.
- Ab 24 Stunden nach der Passage, ersetzen Medien täglich mit 2 ml / Vertiefung E8 ohne ROCK-Inhibitor. Aussaatdichte zu optimieren, um 100% Zusammenfluss vor der Differenzierung beginnen zu erzielen. Saatgut 0,75 x 10 6 Zellen / 4 Tage vor der Differenzierung beginnen, aber für jede Zelllinie zu optimieren, wie gebraucht.
4. Cardiomyocyte Induktion von hPSCs durch selektive Modulation des Wnt Pathway
- Aktualisieren Medien (2 ml / Vertiefung) täglich während 0-7 Tagen, und jeden zweiten Tag für Tag 8.
- Am Tag 0 beginnen Differenzierung durch Ersetzen E8 Medien mit Differenzierungsmedium # 1. Mit 1,2 ul CHIR (6 uM final) in jede Vertiefung. Wiederholen an Tag 1.
- An den Tagen 2-3, ersetzen Sie mit frischem differenzierung Medien # 1.
- Am Tag 4, ersetzen Sie mit frischem Differenzierung Medien # 1. 1 ul IWR-1 (5 uM final) in jede Vertiefung. Wiederholen Sie am Tag 5.
- An den Tagen 6-7, ersetzen Sie mit frischem Differenzierung Medien # 1.
- Am Tag 8 ersetzen mit frischen Differenzierung Medien # 2.
- Weiterhin mit Differenzierung Medien # 2 jeden zweiten Tag für gewünschte Zeit der Kultur zu ersetzen.
- Wenn gewünscht, Gang Kardiomyozyten mit der Zellablösung Lösung folgenden Schritte in 3,3-3,6 umrissen, aber Ersetzen Medien mit Differenzierung Medien # 2. Während Passagieren, distanzieren Kardiomyozyten in kleine Gruppen von 3-10 ~ Zellen. Samen bei ~ 6 x 10 5 Zellen pro Well mit hES qualifizierte Matrix beschichteten Wells und Differenzierung Medien # 2.
5. Sammlung von Zellen für die Durchflusszytometrie
- Führen alle weiteren Aspekte der Schritte auf dem Labortisch (dh nicht steril) 5-9.
- Absaugen und waschen Wachstumsmedien Zellen zweimal mit 1x PBS.1 ml der Zellablösung Lösung (auf Raumtemperatur vorgewärmt) in jede Vertiefung und lassen Sie ungestört für 3-7 min, bis die Zellgrenzen beginnen, Round-up. Verwenden Sie einen Watte-steckt Borosilikatglas Einweg 9 "Pipette mit Lampe, um Zellen zu entfernen und Transfer in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis.
- Im gesamten Rest des Protokolls aufrechtzuerhalten Zellen auf Eis und führen Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Die Zellen in 10 ml Zellwaschlösung unter Verwendung einer 10 ml-Pipette mit serologischen wiederholt Verreiben um Zellklumpen zu gewährleisten werden in einzelne Zellen dispergiert. Zählen von Zellen, wie in Schritt 3.5, während verbleibende Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt.
- Die Zellen in Zellwaschlösung kümmert komplett zu zerlegen und Zellpellet aliquoten 1 x 10 6 Zellen pro Runde Unterrohr. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung.
6. Fixierung undPermeabilisierung der Zellen für die intrazelluläre Antigen Färbung
- 100 l Fixierungslösung zu Zellpellet. Fügen Lösung tropfenweise unter ständigem leichtem Vortexen und dann auf Eis für 15 min eingestellt.
- 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung.
- 100 l Permeabilisierung Lösung für Zellpellet. Fügen Lösung tropfenweise unter ständigem leichtem Vortexen dann auf Eis für 30 min eingestellt. Fixierung und Permeabilisierung verwenden Bedingungen wie für jeden Antikörper in Tabelle 1 dargestellt.
- 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen nach Permeabilisierung.
| Primärer Antikörper (Clone) | Immunogen / Epitop erkannt | Istotype Steuer | Menge an primärem Antikörper pro 1 x 10 6 Zellen in 100 ul | Fixierungslösung | Permeabilisierung Lösung | Sekundären Antikörper | Menge an sekundärem Antikörper / 1 x 10 6 Zellen in 100 ul | |
| Für Prozent positive Messungen | Antigen-Quantifizierung | |||||||
| TNNI3 (284 (19C7) | ISASRKLQL (Human) | Mouse IgG2b | 1,0 ug | 3.0 ug | BD Cytofix | BD Phosflow Dauerwelle III | Ziege-Anti-Maus-IgG2b-Alexa488 | 600 ng |
| TNNT2 (1C11) | In voller Länge gereinigten nativen menschlichen Protein Troponin T. | Maus IgG1 | 1,0 ug | 2.0 ug | 4% PFAin 1% PBS | 0,2% Triton X-100 in 1% PBS | Ziege-anti-Maus-IgG1 - Alexa 488 | 600 ng |
| MLC2v (330G5) | FDPEGKG | Maus-IgG2a | 2.0 ug | 3.0 ug | 70% Methanol / 30% Aceton | 0,2% Triton X-100 in 1% PBS | Ziege-Anti-Maus-IgG2a - Alexa 647 | 600 ng |
| MLC2a (4E7) | voller Länge humanen rekombinanten Protein des menschlichen MYL7 in E. hergestellt coli | Maus IgG1 | 0,5 ug | 3.0 ug | 4% PFA in 1% PBS | 0,2% Triton X-100 in 1% PBS | Ziege-anti-Maus-IgG1 - Alexa 488 | 600 ng |
| IRX4 | LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST | Kaninchen-IgG | 0,5 ug | 0,5 ug | BD Cytofix | BD Phosflow Dauerwelle III | Ziege-Anti-raBBIT IgG-PE | 600 ng |
Tabelle 1. Antikörperkonzentrationen. Aufgeführt sind der primäre Antikörper, Klon (wenn monoklonalen), optimierte Konzentrationen und Fixierung und Permeabilisierung Bedingungen für jeden primären und sekundären Antikörpers für die Durchfluss verwendet Zytometrie analysiert. Antikörperstammkonzentrationen können unter den Anbietern des gleichen Klons variieren Endkonzentrationen jedes Antikörpers pro 1 x 10 6 Zellen in einem festgelegten Testvolumen, anstatt Verdünnungen vorgesehen sind. Das Immunogen verwendet, um die Antikörper zu generieren, oder Epitop durch Antikörper erkannt, wie vom Hersteller vorgesehen ist, wird aufgeführt, aber nicht experimentell verifiziert hier.
7. Antikörper-Färbung
- Für jedes Experiment, sind eine ungefärbte Kontrolle pro Fixierung / Permeabilisierung Zustand und die entsprechende Isotyp-Kontrolle für jede Primärantikörpers verwendet. Sind nicht-Kardiomyozyten Zelltypen als Negativkontrollen (Beispiel pluripotenten Stammzellen oder Fibroblasten). Verwenden Isotypkontrollen in der gleichen Konzentration wie die entsprechenden primären Antikörper (siehe Tabelle 1).
- Die Zellen in 100 ul Blockierungslösung mit einer Pipette auf P200 Zellen zu zerlegen. Satz Proben auf Eis für 25 min unter leichtem Schütteln.
- Ohne Entfernen der Blockierungslösung, fügen primären Antikörper oder Isotypenkontrolle pro Richtlinien in Tabelle 1. Inkubation 45 min auf Eis unter leichtem Schütteln.
- 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen nach der primären Antikörpermarkierung.
- Wenn ein Fluorophor-konjugierte primäre Antikörper verwendet wird, auf 8,1 fort. Wenn ein nicht-konjugierten primären Antikörper verwendet wird (wie bei allen hier beschriebenen Marker), führen die Markierung mit sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor konjugiert ist, wie folgt.
- Die Zellen in 100 ul Blockierungslösung mit einer Pipette auf P200 DISAggregate Zellen.
- Fügen sekundären Antikörper pro Richtlinien in Tabelle 1. Inkubation 30 min auf Eis unter leichtem Schütteln.
- 3 ml Zellwaschlösung. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation und saugen Lösung. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen nach der sekundären Antikörpermarkierung.
8. Vorbereitung der Zellen für die Durchflusszytometrie
- Die Zellen in 400 ul Zellwartungslösung mit einer Pipette auf P1000 Zellen zu zerlegen.
- Bereiten Sie eine Zelle Sieb Kappe auf einem Rundrohr Vorbenetzung mit 50 ul Zellwartungslösung. Röhrchen auf Eis gesetzt. Verwenden Sie die Zelle Siebkappe zu Zellaggregaten Verstopfen der Durchflusszytometer zu verhindern.
- Übertragen Zell Lösung Siebkappe Zelle und erlauben Zellsuspension durch Schwerkraft abfließen. Tippen Sie auf dem Boden des Röhrchens vorsichtig auf Tisch wie nötig, so dass die Zellen in Röhrchen gesammelt und so schnell wie möglich wieder auf Eis gesetzt. Rinse-Sieb mit 250 ul Zell Wartung sosung, um eine maximale Verwertung der Zellen zu gewährleisten.
- Pflegen Zellen auf Eis und vor Licht schützen, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert.
9. Durchflusszytometrie
Detaillierte Erfassung Einstellungen werden unter Instrumente variieren. Grundparameter für eine optimale Datenerfassung berücksichtigen sind unten beschrieben.
- Für eine optimale Stabilität Strom, sicherzustellen, dass die Düsengröße überschreitet 5-6x der Durchmesser der Zelle analysiert wird.
Hinweis: Dies kann unter Instrumente variieren, aber ist ein wichtiger Aspekt sowohl für Analysegeräte und Auswahl geeigneter Düsengröße für die Zellsortierung. Der durchschnittliche Durchmesser der Tag 10 Kardiomyozyten ist 11 um (im Bereich 8-14 um); So ein Standard-150 um Probeninjektionsrohr auf einem Analysegerät funktioniert gut. - Unmittelbar vor der Datenanalyse, Wirbel jedes Rohr kurz auf Zellaggregate zu zerstreuen.
- Optimierung der vorderen und Seitenstreuspannungseinstellungen für jeden Zelltyp, basierend aufungefärbten Kontrolle für jede Fixierung / Permeabilisierung Zustand, in dem Experiment, dass die Bevölkerung von Interesse sind die auf Umfang und zentriert (2A) verwendet.
- Pflegen Sie diese Einstellungen über einen einzigen Versuch und konsistent von Experiment zu auf dem gleichen Instrument auszuprobieren, wie signifikante Verschiebungen können mögliche Probleme mit dem Durchflusszytometer oder Probenvorbereitung anzugeben.
- Für jedes Fluorophor, analysieren die Isotyp-Kontrolle und stellen geeignete Laserspannung, um die Mindestintensität erforderlich, um ein Fluoreszenz-Histogramm, das den linken und rechten Kanten der Spitze zeigt erhalten bestimmen. Pflegen Sie die Einstellungen für die einzelnen Laser Isotypenkontrolle beim Erwerb von Daten auf entsprechende Antikörper-gefärbten Proben.
HINWEIS: Signaldrift tritt häufig im Laufe der Zeit auf dem gleichen Instrument. Es ist kritisch, Lasereinstellungen zu Beginn jedes Experiments auf der Basis der entsprechenden Isotyp-Kontrolle einzustellen. - Sammeln ein Minimum von10.000 Veranstaltungen. 50.000 Veranstaltungen werden bevorzugt.
- Für statistische Analysen, Tor die Lebendzellpopulation um Verschmutzungen (2A) auszuschließen. Bestimmen Prozent positive Zellen innerhalb der Gated Bevölkerung auf Basis von Markerplatzierung, die ≤2% ermöglicht Beitrag von Isotypenkontrolle, wie in Abbildung 2B, C gezeigt.
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Representative Results
Am Tag 0 wurden die Zellen zu 100% konfluent mit kompakten Morphologie und minimalen Zelltrümmer. An den Tagen 1-2, ist es üblich, den Zelltod signifikant (40-50%) zu beobachten, aber anhaftenden Zellen werden kompakte Morphologie (1A) zu erhalten. Während dieser Zeit ist die Medien orange und trüb. Rosa Medien zeigt übermäßigen Zelltod, und in diesem Fall, bestätigen Sie mit Trypanblau und einzustellen, wenn Zelltod übersteigt 70%. Zellen während der Tage 3-4 erholen und Dichte zu erhöhen. Während der Tage 5-6, tritt minimal Zelltod und dichten Flecken können beginnen zu erscheinen. Nach Tagen 7-8 wird ein Monolayer mit kompakten Morphologie mit dichten Flecken durchsetzt erreicht. Zellen beginnen spontan kontra Tag 8 und die ersten Kontraktionen oft in den dichten Flecken sichtbar sein. Am Tag 10, ist robuster Kontraktion beobachtet und wird auch weiterhin in der gesamten Kultur in den folgenden Tagen zu verbreiten. Immunzytochemie Färbung für α-Actinin und TNNT2 Show Sarkomerstruktur(1A). Durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) gemessen, mRNA-Level von Referenzmarken von Mesoderm und kardiomyogenen Engagement Display zeitlichen Verläufe wie erwartet (Abbildung 1B), mit robusten Ausdruck der kardialen Marker Homeobox Protein Nkx-2.5 (Nkx2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, und Myosin-6 (MYH6). Sehr gering bis nicht nachweisbaren Mengen von glatten Muskelzellen (Myosin schwere Kette 11, MYH11) und Skelettmuskel (Myogenin, MYOG) sind Marker Routine. Im Einklang mit der frühen Entwicklung bei dem die Expression sowohl in Herz-und Skelettmuskulatur, bevor sie in der Skelettmuskulatur in der Erwachsenen 20,27,28 eingeschränkt beobachtet, Troponin-Isoformen TNNI1 und TNNI2 sind robust während der Tage 7-8 erkannt.
In Übereinstimmung mit anderen Berichten, erzeugt dieser in-vitro-Differenzierungsstrategie Kardiomyozyten mit Eigenschaften von frühen Herzvorläuferzellen (abgerundete Morphologie, Co-Expression von MLC2a, MLC2v) 19 30,32 begangen werden. In der Durchflusszytometrie werden die Lichtstreuung Profile unter Zelltypen variieren und verändern erheblich unter Fixierung / Permeabilisierung Bedingungen (Abbildung 2a). Unter diesen verschiedenen Zellherstellungsbedingungen, Durchflusszytometrie-Analyse zeigt Isotypkontrollen mit Einzelspitzen mit einer klaren Unterscheidung zwischen Isotypenkontrolle und Antikörper (2B). Pluripotenten Zellen oder anderen nicht-Kardiomyozyten-Zellen sind negativ für den hier verwendeten Marker.
Mit Hilfe dieser Differenzierung und Färbungsprotokoll, ist die resultierende Zellpopulation in der Regel 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v + und + 96% MLC2a von Tag 10 der Differenzierung durch Durchflusszytometrie gemessen. 99% TNNT2 + Zellen beobachtet (2C, 2D), aber, wie oben beschrieben ist, ist nicht eindeutig TNNT2Kardiomyozyten während der Entwicklung und somit die Behauptung, daß die Zellen 99% authentischen Kardiomyozyten von Tag 10 an TNNI3 Proteins. Es wird angemerkt, dass bei fort Kultivierung über 10 Tage, Proteinspiegel von Strukturproteinen wird relativ hoch, obwohl Genexpressionsniveaus bleiben relative Abnahme der Expression Peak durch qRT-PCR überwacht wird, die mit der Proteinstabilität und Umsatzraten von 3,2 und 3,5 Tagen jeweils für TNNI und TNNT 33. Ein Beispiel dieser Beobachtung wird für TNNT2 (Peak der mRNA-Expression am Tag 11 (1B) gezeigt, robust Proteinspiegel am Tag 20 + (2E).
Abbildung 1. Gesamt Schema Kardiomyozytendifferenzierung von hPSCs und repräsentative Daten. (A) Schematische Darstellung der Kardiomyozyten differentiatio n-Protokoll mit entsprechenden Stufe Abstammung und / oder Zell Schicksal Engagement kommentiert. Vertreter Phasenkontrastaufnahmen von Zellen auf den großen Bühnen des Differenzierungsprozesses. Maßstab = 10 um. Rechts = Immunzytochemie Bild von α-Actinin (grün) überlagert mit TNNT2 (rot) und Zellkerne (blau). (B) qRT-PCR-Analyse (für Sondensatz finden Sie in der Materialtabelle) von 18 Referenz Mesoderm und Herzentwicklung Marker während die ersten 17 Tage der Differenzierung. Alle Daten sind ein Durchschnitt von drei Replikaten biologischen jeweils in dreifacher Ausführung, wo die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert analysiert und normiert auf Actin (ACTB). Nachricht Stufen für alle Zeitpunkte beziehen sich auf den ersten Tag der Differenzierung, wo die Ct-Werte nachweisbar sind (dh Ct <35). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Charakterisierung von Kardiomyozyten mittels Durchflusszytometrie und Elektrophysiologie. (A) Lichtstreuungsprofile Tag 10 hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten unter verschiedenen Fixierung und Permeabilisierung Bedingungen. 50.000 Ereignisse wurden gesammelt und die Wohnbevölkerung (dh ohne Schmutz) für statistische Auswertungen verwendet wird rot dargestellt. (B) Histogramme der IRX4 am Tag 10 der Differenzierung mit drei verschiedenen Fixierung / Permeabilisierung Bedingungen, veranschaulicht Unterschiede in der Färbung Effizienz unter den Methoden. Einschübe zeigen Unterschiede in der Färbung der IRX4 auf hiPSCs Verwendung jeder Bedingung. Diese Daten veranschaulichen, warum Methanol / Aceton wird IRX4 vermieden durch geringe, aber nachweisbare Anfärbung auf hiPSCs. (C) Histogramme TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a am 10. Tag der Differenzd ation mit optimierten Färbebedingungen für maximale Prozent positiver Zellen in der Tabelle 1 aufgeführt. (D) Histogramme TNNT2 von Antikörper-Titration, veranschaulicht, daß 0,5 ug beträgt die Mindestmenge für die Messung von 99% TNNT2 +-Zellen erforderlich ist, sondern daß 2 ug der Sättigungspunkt zur Quantifizierung erforderlich. Nur eine einzige Isotyp-Kontrolle gezeigt, aber Titration werden basierend auf dem Vergleich jedes Antikörpers an sein entsprechendes Titration der Isotyp-Kontrolle berechnet. (E) Die Quantifizierung der Protein TNNT2 auf Kardiomyozyten an den Tagen 0-24 der Differenzierung, wie die mittlere Fluoreszenzintensitätsdifferenz dargestellten zwischen Antikörper und Isotyp-Kontrolle für jeden Zeitpunkt. (F) Aktionspotential aus einer spontan kontra ventrikulären artigen Kardiomyozyten an Tag 46 der Differenzierung unter Verwendung der Ganzzellstromklemme Konfiguration der Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow Cytometry Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6-well Flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 ml Syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 | |
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