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Biology

फ्लो द्वारा उच्च क्षमता cardiomyocytes को मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और विशेषता

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

लेख कुशलता से चुनिंदा संदर्भ मार्कर का विश्लेषण आबादी की एकरूपता और पहचान का आकलन करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा पीछा Wnt मार्ग, modulating द्वारा cardiomyocytes में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन है.

Abstract

क्षतिग्रस्त दिल की मरम्मत के दिल पर विषाक्त प्रभाव नहीं है कि नई चिकित्सकीय दवाओं की खोज, और सही ढंग से हृदय रोग मॉडल के लिए रणनीति में सुधार के लिए दृष्टिकोण विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है. इन अनुप्रयोगों के लिए "एक थाली में" हृदय की मांसपेशी उत्पन्न करने के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) प्रौद्योगिकी शोषण के संभावित उच्च उत्साह उत्पन्न करने के लिए जारी है. हाल के वर्षों में, कुशलता मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से cardiomyogenic कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता बहुत अन्यथा सुलभ नहीं मानव हृदय के विकास के बहुत प्रारंभिक दौर मॉडल करने के लिए हमें नए अवसरों की पेशकश, में सुधार हुआ है. पिछले कई तरीकों के विपरीत, cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल सेल एकत्रीकरण या Activin एक या BMP4 के अलावा आवश्यकता नहीं है यहाँ वर्णित और मजबूती कार्डियक ट्रोपोनिन के लिए बेहद सकारात्मक हैं कि कोशिकाओं की संस्कृतियों उत्पन्न मैं और टी (TNNI3, TNNT2), iroquois- वर्ग homeodomain प्रोटीनIRX -4 (IRX4), मायोसिन- विनियामक प्रकाश श्रृंखला 2, निलय / हृदय की मांसपेशी isoform (MLC2v) और मायोसिन विनियामक प्रकाश श्रृंखला 2, सभी मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) और hiPSC लाइनों के पार सुबह 10 से आलिंद isoform (MLC2a) के लिए परीक्षण किया तिथि. कोशिकाओं passaged और संस्कृति में अधिक से अधिक 90 दिनों के लिए रखा जा सकता है. रणनीति तकनीकी रूप से लागू करने के लिए सरल और लागत प्रभावी है. Pluripotent कोशिकाओं से व्युत्पन्न cardiomyocytes की विशेषता अक्सर mRNA और प्रोटीन के स्तर पर दोनों संदर्भ मार्कर का विश्लेषण भी शामिल है. प्रोटीन विश्लेषण के लिए, प्रवाह cytometry संस्कृति में कोशिकाओं की गुणवत्ता का आकलन करने और subpopulation एकरूपता का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है. हालांकि, नमूना तैयार करने में तकनीकी भिन्नता काफी डाटा प्रवाह cytometry की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. इस प्रकार, धुंधला प्रोटोकॉल का मानकीकरण विभिन्न भेदभाव रणनीतियों के बीच तुलना की सुविधा चाहिए. तदनुसार, IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, और टाइम्स न्यूज नेटवर्क के विश्लेषण के लिए धुंधला प्रोटोकॉल अनुकूलितप्रवाह से टी 2 cytometry वर्णित हैं.

Introduction

hESC और hiPSC सहित hPSCs, से cardiomyocytes की पीढ़ी यंत्रवत अध्ययनों के लिए अन्यथा सुलभ नहीं चरणों में अंतर्दृष्टि प्रदान, बहुत जल्दी मानव हृदय विकासात्मक प्रक्रियाओं के इन विट्रो मॉडल के रूप में कार्य कर सकते हैं. इस मॉडल प्रणाली हृदय वंश प्रतिबद्धता और सेल भाग्य विनिर्देश कि नियंत्रण आणविक मार्ग का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. हाल के वर्षों में, कुशलता hPSCs से cardiomyogenic कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता बहुत 1-15 सुधार हुआ है. हालांकि, प्रोटोकॉल के बीच कोशिकाओं कक्ष विशिष्ट मार्कर (जैसे, निलय और अटरिया) व्यक्त जिस पर cardiomyogenic कोशिकाओं और समय पैदा करने में दक्षता के संबंध में सेल लाइन भिन्नता है. आदर्श रूप में, इस मॉडल प्रणाली के भविष्य के लिए आवेदन पत्र, कार्यात्मक रूप में परिभाषित कोशिकाओं की अधिक सजातीय आबादी वांछित हैं. पिछले विधियों के विपरीत, cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल CE आवश्यकता नहीं है यहाँ वर्णितडालूँगा एकत्रीकरण या मजबूती Activin एक या हड्डी Morphogenetic प्रोटीन 4 (BMP4) और के अलावा दिन से TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, और MLC2a के लिए संस्कृतियों अत्यधिक सकारात्मक तारीख को सभी परीक्षण hESC और hiPSC लाइनों भर में 10 कोशिकाओं को उत्पन्न करता है. रणनीति विशेष रूप से तीन आयामी संस्कृतियों, जन संस्कृति, या embryoid शरीर आधारित रणनीतियों 4-9 की तुलना में लागू करने के लिए तकनीकी रूप से सरल है, और हाल ही में hPSCs को चयनात्मक विषाक्तता के साथ एक छोटा सा अणु का वर्णन है कि एक अध्ययन (Boheler एट अल में परिभाषित किया गया था. ) 65. इस प्रोटोकॉल की विशेषताएं, छोटे अणुओं का उपयोग पूरी तरह से परिभाषित मीडिया (अभी तक अलग 1,2,7,13 से इसी तरह,) Wnt संकेतन मिलाना एक hESC योग्य मैट्रिक्स (Matrigel) की एक परत का उपयोग monolayer संस्कृति में hPSCs का भेदभाव शामिल हैं, और भेदभाव दक्षता और सेल पहचान के मूल्यांकन के लिए धुंधला तरीकों cytometry अनुकूलित प्रवाह. पिछली रिपोर्टों इसकी लागत प्रभावी ढंग से शामिल करने के लिए संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के फायदे की तुलनाeness, reproducibility, और hESC और hiPSC लाइनों सहित कई hPSC लाइनों के बीच cardiomyocytes पैदा करने के लिए अपने उच्च दक्षता.

प्रवाह cytometry संस्कृति में कोशिकाओं की गुणवत्ता का आकलन करने और subpopulation एकरूपता का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है, और उचित प्रायोगिक डिजाइन के साथ, मात्रात्मक माप प्रदान कर सकते हैं. सभी प्रतिरक्षी आधारित रणनीति के साथ के रूप में, प्रयोगात्मक परिणामों की सही व्याख्या उप इष्टतम स्थितियों में काफी एंटीबॉडी की क्षमता को प्रभावित के रूप में एंटीबॉडी एकाग्रता और निर्धारण और permeabilization शर्तों (intracellular एंटीजन को लक्ष्य बनाते समय) सहित परख डिजाइन के तत्वों के प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए जांच की जाती है कि आवश्यकता , परिणामों की व्याख्या बंधन, और इसलिए. Quantitation आवश्यक है, तो पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी कई epitopes पहचान और बैच करने वाली बैच भिन्नता होने का खतरा हो सकता है के रूप में महत्वपूर्ण बात है,, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, आवश्यक हैं. वर्तमान में, एंटीबॉडी के एक किस्म (पीओlyclonal और मोनोक्लोनल) और धुंधला प्रोटोकॉल यह मुश्किल प्रोटोकॉल 1,2,9,11 बीच cardiomyogenesis की दक्षता तुलना करने के लिए कर रही है, इन विट्रो भेदभाव के आकलन के लिए वर्णित किया गया है. सभी फ्लो विश्लेषण के लिए उपलब्ध है जब कि कारण के लिए, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है. आगे जा रहे हैं, यह बेहतर भेदभाव रणनीतियों के बीच तुलना की अनुमति चाहिए, विशेष रूप से quantitation का संबंध है, ये धुंधला प्रोटोकॉल की कि मानकीकरण की उम्मीद है.

इन विट्रो cardiomyogenesis की शुद्धता का आकलन किया मार्कर का विकल्प है, और उनके इसी एंटीबॉडी, रिपोर्टों के बीच बदलता है. TNNT2 cardiomyogenic भाग्य के लिए प्रतिबद्ध कोशिकाओं का सूचक माना गया है और नियमित हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल की दक्षता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, TNNT2 भी जल्दी लड़की और चूहे विकास 16,17 दौरान कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त किया है और यह मानव चिकनी पेशी 18 में मौजूद है विट्रो में मानव cardiomyogenesis की एक विशिष्ट मार्कर नहीं है. MLC2v और MLC2a नियमित क्रमशः, निलय और आलिंद उपप्रकार के किराए मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है. हालांकि, इन विट्रो भेदभाव के संदर्भ में cardiomyocyte उप प्रकार निर्धारित करने के लिए MLC2v और MLC2a पर निर्भर के साथ चुनौतियों इन जीन उत्पादों वयस्क के माध्यम से दिल ट्यूब से, हृदय के विकास में एक विशिष्ट कक्ष तक ही सीमित नहीं किया जा सकता है कि इस तथ्य से उत्पन्न होती हैं. कृंतक दिल looped में, MLC2a mRNA आलिंद / प्रवाह पथ के क्षेत्र में प्रमुख है और MLC2v mRNA निलय / बहिर्वाह पथ क्षेत्रों में प्रमुख है. Looped दिल में, MLC2a और MLC2v mRNAs के सह अभिव्यक्ति प्रवाह पथ, atrioventricular नहर, और बहिर्वाह पथ 19,20 में मनाया जाता है. जन्म के बाद 3 दिन तक, MLC2v mRNA निलय तक ही सीमित है और जन्म के बाद 10 दिन से, MLC2a नवजात चूहे दिल 19 में अटरिया के लिए प्रतिबंधित है. इसलिए, व्याख्याcardiomyogenesis दक्षता और उप पहचान केवल संदर्भ मार्कर के स्तर की उपस्थिति और मात्रा पर विचार नहीं करना चाहिए, लेकिन जो विश्लेषण कर रहे हैं कि भेदभाव की timepoints अनुरूप करने के लिए विकास मंच (ओं) पर विचार करना चाहिए के बारे में डेटा की. इस hPSCs की इन विट्रो भेदभाव से उत्पन्न cardiomyogenic कोशिकाओं की परिपक्वता चरण सबसे निकट भ्रूण / भ्रूण के विकास 21-25 के उन जैसा होता है पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, प्रसव के बाद दिल में एक मार्कर के स्थानिक अभिव्यक्ति पर भरोसा कम से कम कुछ मामलों में hPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं के आकलन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता.

इन विट्रो में cardiomyocyte पहचान को परिभाषित करने के लिए और अधिक विशिष्ट मानदंडों के विकास में मदद करने के प्रयास में, TNNI3 यह लड़की और zebrafish 15,20 में embryogenesis भर में हृदय की मांसपेशी तक ही सीमित है के रूप में इन विट्रो में cardiomyogenesis के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान मार्कर माना जाता हैऔर मानव भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी 26 में अनुपस्थित है. TNNI1 मानव भ्रूण दिल में मौजूद है, TNNI3 सामान्य वयस्क दिल 27,28 में केवल TNNI isoform मौजूद है. Cardiomyocyte उप प्रकार पहचान के बारे में, IRX4 29-31 वेंट्रिकुलर भाग्य के साथ कोशिकाओं की एक जानकारीपूर्ण मार्कर है. प्रोटीन के स्तर पर, IRX4 हाल ही में माउस 32 में नवजात चरणों के माध्यम से रेखीय दिल ट्यूब से निलय के लिए प्रतिबंधित किया जा दिखाया गया है. तदनुसार, फ्लो द्वारा TNNI3 का विश्लेषण और IRX4 लिए अनुकूलित धुंधला प्रोटोकॉल वर्णित हैं. हमारे ज्ञान करने के लिए, इस फ्लो द्वारा कुशल एंटीबॉडी आधारित धुंधला और मानव cardiomyocytes में IRX4 स्तर के विश्लेषण के लिए एक विधि की पहली वर्णन है.

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Protocol

1 समाधान और मीडिया तैयारी

  1. hESC योग्य मैट्रिक्स कोटिंग स्टॉक समाधान
    1. धीरे धीरे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर hESC बर्फ पर योग्य मैट्रिक्स (5 एमएल) पिघलना. 1.5 मिलीलीटर बाँझ, पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूबों में aliquots बांटना और तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
      नोट: विभाज्य की मात्रा बहुत पर आधारित है और आम तौर पर 270-350 μl पर्वतमाला भिन्न होगी. निर्माता कदम 2.1 में वर्णित के रूप में 25 एमएल में कमजोर पड़ने पर एक 1x एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक विभाज्य की मात्रा के बारे में जानकारी प्रदान करता है.
  2. hPSC मीडिया स्टॉक समाधान
    1. जब तक अन्यथा इंगित एक मंदक के रूप में ultrapure पानी का प्रयोग करें. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग कर सभी घटकों को जीवाणुरहित. 4 डिग्री सेल्सियस पर थोक समाधान के रूप में निम्नलिखित स्टोर सोडियम बाइकार्बोनेट (75 मिलीग्राम / एमएल); साइट्रिक एसिड (10 मिमी, पीएच = 3).
    2. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर सभी घटकों को जीवाणुरहित और -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots के रूप में प्रत्येक दुकान: रो kinase (रॉक) अवरोध करनेवाला वाई 27,632 (10DPBS में मिमी, 100 μl विभाज्य); एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट (64 मिलीग्राम / एमएल, 500 μl विभाज्य); सोडियम Selenite (70 माइक्रोग्राम / एमएल, 100 μl विभाज्य); transferrin (50 मिलीग्राम / एमएल, 107 μl विभाज्य); fibroblast वृद्धि कारक 2 (FGF2, 200 एनजी / DPBS में μl, 250 μl विभाज्य); वृद्धि कारक बीटा 1 बदलने (ठंड 10 मिमी साइट्रिक एसिड में TGFβ1, 100 एनजी / μl, 10 μl विभाज्य).
  3. hPSC मीडिया E8 समाधान संगठन
    1. , एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट (500 μl, अंतिम: (; 500 मिलीलीटर एल Glutamine और HEPES के साथ), सोडियम बाइकार्बोनेट (543 माइक्रोग्राम / एमएल 3.62 मिलीग्राम अंतिम) DMEM / F12: 1.2 चरण में तैयार aliquots का उपयोग कर मीडिया को तैयार : 64 माइक्रोग्राम / एमएल), सोडियम Selenite (100 μl, अंतिम: 140 एनजी / एमएल), transferrin (107 μl, अंतिम: 10.7 माइक्रोग्राम / एमएल), इंसुलिन (1 मिलीलीटर, अंतिम: 20 माइक्रोग्राम / एमएल), FGF2 (250 μl, अंतिम: 100 एनजी / एमएल), TGFβ1 (10 μl, अंतिम: 2 एनजी / एमएल).
    2. अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी घटकों, फिल्टर बाँझ और दुकान का मिश्रण.
  4. रॉक अवरोध करनेवाला के साथ hPSC मीडिया E8
    1. ऊपर के रूप में तैयार E8 मीडिया के 12 एमएल के लिए 15 μl रॉक अवरोध जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. अंतिम एकाग्रता कदम 3.7 में / मीडिया कोशिकाओं के अलावा के बाद 10 माइक्रोन है कि सुनिश्चित करें.
  5. Wnt modulators के शेयर समाधान
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर निम्न aliquots स्टोर. चीड़ 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO में 10 मिमी, 15 μl विभाज्य). IWR -1 (4 (1,3,3a, 4,7,7a-Hexahydro-1,3 dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-YL) एन-8-quinolinyl-Benzamide; DMSO में 10 मिमी, 6 μl विभाज्य).
  6. भेदभाव मीडिया
    1. 2% B27 शून्य से इंसुलिन के पूरक के साथ (एल glutamine के साथ) 1640 RPMI साथ भेदभाव मीडिया # 1 तैयार करें.
    2. 2% B27 प्लस इंसुलिन के पूरक और 2% FBS के साथ (एल glutamine के साथ) RPMI 1640 के साथ भेदभाव मीडिया # 2 तैयार करें.
  7. सेल धोने समाधान चया सेल संस्कृति
    1. कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS), का प्रयोग करें.
  8. फ्लो के लिए सेल धोने समाधान
    1. 1% FBS के साथ (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस) फॉस्फेट खारा बफर का प्रयोग करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  9. फ्लो के लिए सेल रखरखाव समाधान
    1. 5% FBS के साथ, (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना HbSS) हांक संतुलित नमक समाधान का उपयोग. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  10. फ्लो के लिए फिक्सेशन समाधान
    1. TNNI3 और IRX4 एंटीबॉडी के लिए निर्धारण समाधान के रूप में Cytofix बफर का प्रयोग करें.
    2. TNNT2 और MLC2a एंटीबॉडी के लिए निर्धारण समाधान के रूप में 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde (ताजा बनाने) का प्रयोग करें.
    3. MLC2v एंटीबॉडी के लिए निर्धारण समाधान के रूप में 70% मेथनॉल / 30% एसीटोन का प्रयोग करें.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी समाधान स्टोर.
  11. फ्लो के लिए permeabilization समाधान
    1. Permeabilization समाधान च के रूप में Phosflow पेर्म बफर III उपयोगया TNNI3 और IRX4 एंटीबॉडी. कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर.
    2. TNNT2, MLC2v, और MLC2a एंटीबॉडी के लिए permeabilization समाधान के रूप में 1x पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 का प्रयोग करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  12. अवरुद्ध समाधान
    1. 1x पीबीएस में 10% बकरी सीरम का प्रयोग करें. ताजा करें और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

2 प्लेट कोटिंग

  1. धीरे धीरे, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर hESC योग्य मैट्रिक्स के 1 विभाज्य पिघलना ठंडा DMEM / F12 के 25 मिलीलीटर जोड़ने और तुरंत 6 अच्छी तरह प्लेटें कोटिंग से पहले निष्फल टिशू कल्चर हुड में अच्छी तरह से मिश्रण.
  2. निष्फल टिशू कल्चर हुड के तहत 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर जोड़ें (hESC योग्य मैट्रिक्स के 1 विभाज्य कोट चार 6 अच्छी तरह प्लेटों के लिए पर्याप्त है).
  3. HESC योग्य मैट्रिक्स हुड के तहत कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए निर्धारित करने की अनुमति. अतिरिक्त hESC योग्य मैट्रिक्स Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए रॉक अवरोध साथ E8 मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें. इस्तेमाल की प्लेटों तुरंत, या अगर डेसiRed, 4 डिग्री पर दुकान तुरंत बाद अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए चढ़ाना और उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को संतुलित सी.

3 Passaging और Monolayer संस्कृति में Undifferentiated hPSCs का रखरखाव

  1. 6 अच्छी तरह प्लेटों में monolayer संस्कृति में hPSCs बनाए रखने और एक बाँझ टिशू कल्चर हुड के तहत सभी चरणों को पूरा.
  2. HPSC अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं कि लाइनों (> P20) का प्रयोग करें और एक तंत्रिका, epithelial- या fibroblast तरह आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं की उपस्थिति के बिना एक सजातीय आकारिकी दिखा रहे हैं. अच्छी तरह से प्रति 0.75 x 10 6 पर वरीयता प्राप्त जब कोशिकाओं 75% संगम पर हर तीन दिन मजबूती के साथ पैदा करना, और औसत, बीतने पर सुनिश्चित करें.
  3. एकल कोशिका स्तर तक हदबंदी के साथ पारित होने hPSCs कम से कम 5x पूर्व अधिकतम भेदभाव दक्षता सुनिश्चित करने के लिए भेदभाव के शुरू करने के लिए. बीतने hPSCs करने के लिए, महाप्राण E8 मीडिया और 1x DPBS (कमरे के तापमान को पूर्व गर्म) के 4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें. सेल अलग से 1 मिलीलीटर जोड़ेंजाहिर प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान (कमरे के तापमान को पूर्व गर्म) और सेल सीमाओं राउंड अप करने के लिए शुरू तक, 3-7 मिनट के लिए अच्छी तरह से अछूता छोड़ दें.
  4. कोशिकाओं हटाना और DMEM / F12 मीडिया के 1 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बल्ब के साथ एक कपास खामियों को दूर गिलास पिपेट का उपयोग करें (सेल टुकड़ी समाधान को निष्क्रिय करने के लिए).
  5. सेल के समाधान के 10 μl विभाज्य निकालें और एक microcentrifuge ट्यूब में trypan नीले रंग के 10 μl के साथ मिश्रण. कोशिकाओं के शेष कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 130 XG पर centrifugation द्वारा एकत्र कर रहे हैं, जबकि कोशिकाओं (जैसे स्वचालित या मैनुअल hemocytometer) गणना. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, 70-80% व्यवहार्यता एक स्वचालित hemocytometer का उपयोग और कुल कोशिकाओं की गिनती के आधार पर सभी सेल नंबर, आगे जा रहा है उम्मीद है.
  6. महाप्राण मीडिया 500 μl प्रति 0.75 x 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता DMEM / F12 में सेल गोली resuspend और.
  7. 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 500 μl जोड़ें जहां प्रत्येक अच्छी तरह contaiरॉक अवरोध करनेवाला के साथ एन एस 2 मिलीलीटर E8 मीडिया, 2.3 कदम में तैयार किया. Worktop पर थाली छोड़कर, धीरे अच्छी तरह से भर में एक सामने से वापस और पक्ष की ओर गति समान रूप से फैलाने के लिए कोशिकाओं में स्थानांतरित. 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
  8. Passaging के बाद 24 घंटा शुरू, दैनिक रॉक अवरोध के बिना 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह E8 का उपयोग कर मीडिया की जगह. भेदभाव के शुरू करने से पहले 100% संगम को प्राप्त करने के लिए बोने घनत्व का अनुकूलन. 0.75 x 10 6 कोशिकाओं बीज / अच्छी तरह से चार दिनों के भेदभाव से शुरू है, लेकिन जरूरत के रूप में प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलन करने से पहले.

Wnt मार्ग के चुनिंदा मॉडुलन द्वारा hPSCs के 4 cardiomyocyte प्रेरण

  1. दिन 0-7 के दौरान दैनिक (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) मीडिया ताज़ा करे, और 8 दिन के बाद हर दूसरे दिन.
  2. 0 दिन में, भेदभाव मीडिया # 1 के साथ E8 मीडिया की जगह से भेदभाव की प्रक्रिया शुरू. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1.2 μl चीड़ (6 माइक्रोन अंतिम) जोड़ें. दिन 1 पर दोहराएँ.
  3. दिन 2-3 पर, ताजा एडवेंचर्स के साथ बदलेंtiation मीडिया # 1.
  4. 4 दिन, ताजा भेदभाव मीडिया # 1 के साथ बदलें. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 μl IWR -1 (अंतिम 5 माइक्रोन) जोड़ें. सुबह 5 पर दोहराएँ.
  5. दिन 6-7 पर, ताजा भेदभाव मीडिया # 1 के साथ बदलें.
  6. सुबह 8 में, ताजा भेदभाव मीडिया # 2 के साथ बदलें.
  7. भेदभाव मीडिया # 2 संस्कृति के वांछित समय के लिए हर दूसरे दिन के साथ बदलने के लिए आगे बढ़ें.
  8. अगर वांछित, 3.3-3.6 में उल्लिखित चरणों का पालन, लेकिन भेदभाव मीडिया # 2 के साथ मीडिया प्रतिस्थापन सेल टुकड़ी समाधान का उपयोग बीतने cardiomyocytes. Passaging के दौरान, ~ 3-10 कोशिकाओं के छोटे समूहों में cardiomyocytes अलग कर देना. अच्छी तरह से उपयोग कर hESC योग्य मैट्रिक्स लेपित कुओं और भेदभाव मीडिया # 2 प्रति ~ 6 x 10 5 कोशिकाओं में बीज.

फ्लो के लिए कोशिकाओं की 5 संग्रह

  1. प्रयोगशाला बेंच (यानी, बाँझ नहीं) पर 5-9 कदम के सभी शेष पहलुओं प्रदर्शन करना.
  2. महाप्राण विकास मीडिया और 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें.सेल सीमाओं राउंड अप करने के लिए शुरू तक, (कमरे में अस्थायी करने के लिए पूर्व गर्म) प्रत्येक के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ें और 3-7 मिनट तक अछूता छोड़ दें. कोशिकाओं हटाना और बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बल्ब के साथ एक कपास खामियों को दूर borosilicate ग्लास डिस्पोजेबल 9 "पिपेट का उपयोग करें.
  3. प्रोटोकॉल के शेष के दौरान, बर्फ पर कोशिकाओं को बनाए रखने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugations प्रदर्शन करते हैं.
  4. Centrifugation और महाप्राण समाधान से कोशिकाओं को इकट्ठा. सेल clumps सुनिश्चित करने के लिए दोहराया विचूर्णन साथ एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग 10 मिलीलीटर सेल धोने समाधान में Resuspend कोशिकाओं एकल कक्षों में बिखरे हैं. कोशिकाओं के शेष centrifugation द्वारा एकत्र कर रहे हैं, जबकि 3.5 चरण में के रूप में कोशिकाओं की गणना.
  5. सेल धोने समाधान देखभाल में Resuspend कोशिकाओं को पूरी तरह सेल गोली और विभाज्य दौर नीचे ट्यूब प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं disaggregate लिए. Centrifugation और महाप्राण समाधान से कोशिकाओं को इकट्ठा.

6 फिक्सेशन औरIntracellular एंटीजन धुंधला के लिए कोशिकाओं के permeabilization

  1. सेल गोली 100 μl निर्धारण समाधान जोड़ें. समाधान बूंद के लिहाज से सतत कोमल vortexing के साथ और फिर 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेट जोड़ें.
  2. 3 मिलीलीटर सेल धोने समाधान जोड़ें. Centrifugation और महाप्राण समाधान से कोशिकाओं को इकट्ठा.
  3. सेल गोली 100 μl permeabilization समाधान जोड़ें. समाधान ड्रॉप वार फिर 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेट सतत कोमल vortexing साथ जोड़ें. तालिका 1 में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए दिए गए के रूप निर्धारण और permeabilization शर्तों का उपयोग करें.
  4. 3 मिलीलीटर सेल धोने समाधान जोड़ें. Centrifugation और महाप्राण समाधान से कोशिकाओं को इकट्ठा. Permeabilization के बाद दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
प्राथमिक एंटीबॉडी (क्लोन) Immunogen / मिलान मान्यता Istotype नियंत्रण 100 μl में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रति प्राथमिक एंटीबॉडी की राशि फिक्सेशन समाधान Permeabilization समाधान माध्यमिक एंटीबॉडी 100 μl में माध्यमिक एंटीबॉडी की राशि / 1 x 10 6 कोशिकाओं
प्रतिशत सकारात्मक माप के लिए एंटीजन quantitation के लिए
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (मानव) माउस IgG2b 1.0 माइक्रोग्राम 3.0 माइक्रोग्राम बी.डी. Cytofix बी.डी. Phosflow पर्म III बकरी विरोधी माउस IgG2b-Alexa488 600 एनजी
TNNT2 (1C11) पूर्ण लंबाई शुद्ध देशी मानव ट्रोपोनिन टी प्रोटीन. माउस IgG1 1.0 माइक्रोग्राम 2.0 माइक्रोग्राम 4% पीएफए1% पीबीएस में 1% पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 बकरी विरोधी माउस IgG1 - एलेक्सा 488 600 एनजी
MLC2v (330G5) FDPEGKG माउस IgG2a 2.0 माइक्रोग्राम 3.0 माइक्रोग्राम 70% मेथनॉल / 30% एसीटोन 1% पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 बकरी विरोधी माउस IgG2a - एलेक्सा 647 600 एनजी
MLC2a (4E7) ई में उत्पादित मानव MYL7 की पूरी लंबाई मानव पुनः संयोजक प्रोटीन कोलाई माउस IgG1 0.5 माइक्रोग्राम 3.0 माइक्रोग्राम 1% पीबीएस में 4% पीएफए 1% पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 बकरी विरोधी माउस IgG1 - एलेक्सा 488 600 एनजी
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		खरगोश आईजीजी 0.5 माइक्रोग्राम 0.5 माइक्रोग्राम बी.डी. Cytofix बी.डी. Phosflow पर्म III बकरी विरोधी आरएआईजीजी पीई bbit 600 एनजी

प्रत्येक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित सांद्रता और निर्धारण और permeabilization शर्तों प्रवाह के लिए इस्तेमाल किया (मोनोक्लोनल अगर) तालिका 1 प्रतिरक्षी सांद्रता. सूचीबद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी हैं, क्लोन cytometry विश्लेषण करती है. एंटीबॉडी शेयर सांद्रता एक ही क्लोन के विक्रेताओं के बीच भिन्न हो सकते हैं, अंतिम एक निश्चित परख मात्रा में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रति प्रत्येक एंटीबॉडी की सांद्रता, बजाय dilutions, प्रदान की जाती हैं. immunogen प्रतिरक्षी उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, या निर्माता द्वारा प्रदान के रूप में मिलान, एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त है, सूचीबद्ध है लेकिन प्रयोगात्मक यहाँ सत्यापित नहीं किया गया था.

7 एंटीबॉडी धुंधला

  1. हर प्रयोग के लिए, एक निर्धारण / permeabilization हालत प्रति बेदाग नियंत्रण और प्रयोग प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए उचित निर्धारण नियंत्रण शामिल हैं. (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर cardiomyocyte सेल प्रकार में शामिलजैसे, pluripotent स्टेम कोशिकाओं या fibroblasts). प्राथमिक एंटीबॉडी इसी रूप में एक ही एकाग्रता में निर्धारण नियंत्रण का प्रयोग करें (1 टेबल देखें).
  2. कोशिकाओं disaggregate को एक P200 पिपेट का उपयोग अवरुद्ध समाधान 100 μl में कोशिकाओं Resuspend. कोमल कमाल के साथ 25 मिनट के लिए बर्फ पर सेट नमूने.
  3. अवरुद्ध समाधान निकाले बिना,. प्राथमिक एंटीबॉडी या तालिका 1 में दिशा निर्देशों के अनुसार निर्धारण नियंत्रण जोड़ने कोमल कमाल के साथ बर्फ पर 45 मिनट सेते हैं.
  4. 3 मिलीलीटर सेल धोने समाधान जोड़ें. Centrifugation और महाप्राण समाधान से कोशिकाओं को इकट्ठा. प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के बाद दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
  5. एक फ्लोरोफोरे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है, तो 8.1 के लिए आगे बढ़ें. एक विसंयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे यहाँ वर्णित सभी मार्करों के लिए) के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार एक फ्लोरोफोरे संयुग्मित है कि माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग प्रदर्शन करते हैं.
  6. ईंट के लिए एक P200 पिपेट का उपयोग अवरुद्ध समाधान 100 μl में Resuspend कोशिकाओंggregate कोशिकाओं.
  7. . तालिका 1 में दिशा निर्देशों के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें कोमल कमाल के साथ बर्फ पर 30 मिनट सेते हैं.
  8. 3 मिलीलीटर सेल धोने समाधान जोड़ें. Centrifugation और महाप्राण समाधान से कोशिकाओं को इकट्ठा. माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के बाद दो washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.

फ्लो के लिए कोशिकाओं की 8 तैयारी

  1. कोशिकाओं disaggregate को एक P1000 पिपेट का उपयोग कर 400 μl सेल रखरखाव समाधान में कोशिकाओं Resuspend.
  2. 50 μl सेल रखरखाव समाधान के साथ पूर्व गीला द्वारा एक दौर नीचे ट्यूब पर एक सेल झरनी टोपी तैयार करें. बर्फ पर ट्यूब सेट करें. प्रवाह clogging से सेल समुच्चय को रोकने के लिए सेल झरनी टोपी का प्रयोग करें.
  3. झरनी टोपी सेल और सेल निलंबन के गुरुत्वाकर्षण से पलायन करने की अनुमति देने के लिए सेल समाधान स्थानांतरण. कोशिकाओं ट्यूब में एकत्र की है और जल्दी से जल्दी वापस बर्फ पर टिकी हैं कि इतना आवश्यक रूप बेंच शीर्ष पर धीरे ट्यूब के नीचे ठोकर. 250 μl सेल रखरखाव इतने से कुल्ला छलनीlution कोशिकाओं का अधिक से अधिक वसूली सुनिश्चित करने के लिए.
  4. बर्फ पर कोशिकाओं को बनाए रखने और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जब तक प्रकाश से रक्षा करते हैं.

9 फ्लो विश्लेषण

विस्तृत अधिग्रहण सेटिंग्स उपकरणों के बीच अलग अलग होंगे. इष्टतम डेटा संग्रह के लिए विचार करने के लिए बुनियादी मानकों से नीचे वर्णित हैं.

  1. इष्टतम धारा स्थिरता के लिए, नोक आकार सेल के व्यास का विश्लेषण किया जा रहा है 5-6x से अधिक है कि यह सुनिश्चित करें.
    नोट: इस यंत्र में भिन्नता है लेकिन एनालाइजर के लिए और सेल छँटाई के लिए उपयुक्त नोक आकार का चयन दोनों एक महत्वपूर्ण विचार है हो सकता है. सुबह 10 cardiomyocytes की औसत व्यास (8-14 माइक्रोन लेकर) 11 माइक्रोन है; इस प्रकार, एक विश्लेषक पर एक मानक 150 माइक्रोन नमूना इंजेक्शन ट्यूब में अच्छी तरह से काम करता है.
  2. तुरंत पहले डेटा विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब संक्षिप्त भंवर सेल समुच्चय को फैलाने के लिए.
  3. आगे अनुकूलन और प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए पक्ष बिखराव वोल्टेज सेटिंग के आधार परब्याज की आबादी पैमाने पर कर रहे हैं और (2A चित्रा) केंद्रित है कि इस तरह प्रयोग में इस्तेमाल प्रत्येक निर्धारण / permeabilization हालत के लिए बेदाग नियंत्रण.
    1. महत्वपूर्ण बदलाव प्रवाह या नमूना तैयारी के साथ संभावित समस्याओं का संकेत हो सकता है, एक ही प्रयोग के दौरान इन सेटिंग्स को बनाए रखने और एक ही साधन पर प्रयोग करने के लिए प्रयोग से लगातार हो.
  4. प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए, निर्धारण नियंत्रण विश्लेषण और चोटी के बाएँ और दाएँ दोनों किनारों को प्रदर्शित करता है कि एक प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम तीव्रता का निर्धारण करने के लिए उपयुक्त लेजर वोल्टेज समायोजित. एंटीबॉडी से सना हुआ नमूने इसी पर डेटा प्राप्त जब प्रत्येक निर्धारण नियंत्रण के लिए लेजर सेटिंग्स बनाए रखें.
    नोट: सिग्नल अक्सर बहाव एक ही साधन पर समय पर होता है. यह उचित निर्धारण नियंत्रण के आधार पर प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में लेजर सेटिंग्स समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. की एक न्यूनतम जमा10,000 घटनाओं. 50,000 घटनाओं पसंद कर रहे हैं.
  6. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, गेट लाइव सेल आबादी मलबे (2A चित्रा) को बाहर करने के लिए. चित्रा 2 बी, सी के रूप में दिखाया, निर्धारण नियंत्रण से ≤2% योगदान देता है कि मार्कर नियुक्ति पर आधारित gated आबादी के भीतर प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं का निर्धारण करते हैं.

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Representative Results

0 दिन में, कोशिकाओं कॉम्पैक्ट आकारिकी और न्यूनतम सेल मलबे के साथ 100% मिला हुआ हैं. दिन में 1-2, यह महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु (40-50%) निरीक्षण करने के लिए आम बात है, लेकिन संलग्न कोशिकाओं कॉम्पैक्ट आकारिकी (चित्रा 1 ए) रख सकेंगे. इस समय के दौरान, मीडिया नारंगी और परेशान है. गुलाबी मीडिया अत्यधिक कोशिका मृत्यु को इंगित करता है, और इस मामले में, trypan नीले रंग के साथ की पुष्टि करें और कोशिका मृत्यु 70% से अधिक है बंद. प्रकोष्ठों दिनों 3-4 के दौरान ठीक हो जाएगी और घनत्व में वृद्धि होगी. दिन 5-6 के दौरान, कम से कम कोशिका मृत्यु होती है और घने पैच प्रकट करने के लिए शुरू हो सकता है. दिन 7-8 से, एक मिला हुआ monolayer घने पैच के साथ interspersed कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान के साथ हासिल की है. कोशिकाओं अनायास दिन 8 से करार के शुरू और पहली संकुचन अक्सर घने पैच में दिखाई जाएगी. सुबह 10 से, और अधिक मजबूत संकुचन मनाया जाता है और बाद के दिनों में संस्कृति भर में प्रसार करने के लिए जारी रहेगा. Α-actinin और TNNT2 शो sarcomere संरचना के लिए Immunocytochemistry धुंधला(चित्रा 1 ए). मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT पीसीआर) द्वारा मापा, mesoderm और cardiomyogenic प्रतिबद्धता प्रदर्शन लौकिक प्रोफाइल के संदर्भ मार्कर का mRNA स्तर हृदय मार्करों Homeobox प्रोटीन Nkx-2.5 (NKX2.5 की मजबूत अभिव्यक्ति के साथ, (चित्रा 1 बी) के रूप में उम्मीद ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, और मायोसिन- 6 (MYH6). चिकनी पेशी (मायोसिन भारी श्रृंखला 11, MYH11) और कंकाल की मांसपेशी की गैर detectable स्तर बहुत कम (myogenin, MYOG) मार्करों दिनचर्या हैं. अभिव्यक्ति TNNI1 और TNNI2 मजबूती दिनों 7-8 के दौरान पता चला रहे हैं isoforms ट्रोपोनिन, वयस्क 20,27,28 में कंकाल की मांसपेशी के लिए प्रतिबंधित किया जा रहा से पहले दोनों हृदय और कंकाल की मांसपेशी में मनाया जाता है, जहां प्रारंभिक विकास के अनुरूप.

अन्य रिपोर्टों के अनुरूप, यह इन विट्रो भेदभाव रणनीति जल्दी हृदय progenitors की विशेषताओं के साथ cardiomyocytes (गोल आकृति विज्ञान, MLC2a के सह अभिव्यक्ति, MLC2v) 19 उत्पन्न 30,32 करने के लिए प्रतिबद्ध होना दिखाई देते हैं. प्रवाह cytometry में, प्रकाश बिखराव प्रोफाइल के प्रकार की कोशिकाओं के बीच अलग अलग होंगे और निर्धारण / permeabilization शर्तों (2A चित्रा) के बीच काफी बदल जाते हैं. विश्लेषण निर्धारण नियंत्रण और एंटीबॉडी (चित्रा 2 बी) के बीच एक स्पष्ट अंतर के साथ एकल चोटियों के साथ निर्धारण नियंत्रण से पता चलता है cytometry इन विभिन्न सेल तैयारी शर्तों के तहत, प्रवाह. Pluripotent कोशिकाओं या अन्य गैर cardiomyocyte कोशिकाओं का यहां इस्तेमाल मार्करों के लिए नकारात्मक हैं.

इस भेदभाव और धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करना, जिसके परिणामस्वरूप सेल की आबादी 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v + आम तौर पर है, और 96% MLC2a + भेदभाव के दिन 10 से प्रवाह cytometry द्वारा मापा. 99% TNNT2 + कोशिकाओं (आंकड़े -2 सी, 2 डी) मनाया जाता है, लेकिन के रूप में ऊपर वर्णित है, TNNT2 अद्वितीय नहीं हैकोशिकाओं दिन 10 से 99% प्रामाणिक cardiomyocytes TNNI3 प्रोटीन पर आधारित है कि विकास और इस तरह जोर दौरान cardiomyocytes को. यह QRT- पीसीआर द्वारा निगरानी के रूप में 10 दिन से परे निरंतर संवर्धन के साथ, संरचनात्मक प्रोटीन की प्रोटीन का स्तर, अभिव्यक्ति चोटी के सापेक्ष कमी होगी प्रोटीन स्थिरता और 3.2 और 3.5 दिनों के कारोबार दरों के साथ संगत रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति के स्तर हालांकि उच्च रहेगा उल्लेखनीय है कि क्रमशः, TNNI और TNNT 33 के लिए. इस अवलोकन का एक उदाहरण TNNT2 (11 दिन (चित्रा 1 बी) में चोटी mRNA अभिव्यक्ति के लिए दिखाया गया है, दिन 20 + में मजबूत प्रोटीन का स्तर (चित्रा 2 ई).

चित्रा 1
चित्रा 1 hPSCs और प्रतिनिधि डेटा से cardiomyocyte भेदभाव के समग्र योजनाबद्ध. (ए) cardiomyocyte differentiatio के योजनाबद्ध n प्रोटोकॉल वंश और / या सेल भाग्य प्रतिबद्धता की इसी चरण के साथ एनोटेट. भेदभाव प्रक्रिया के प्रमुख चरणों में कोशिकाओं के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों. स्केल बार 10 माइक्रोन =. अभी तक सही = α-actinin (हरा) के immunocytochemistry छवि के दौरान TNNT2 (लाल) और नाभिक (नीला). (बी) QRT- पीसीआर विश्लेषण (जांच सेट के लिए, सामग्री तालिका देखें) 18 संदर्भ mesoderm की और हृदय विकास मार्कर के साथ मढ़ा भेदभाव के पहले 17 दिनों के लिए. सभी डेटा प्रत्येक त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां तीन प्रतियों में विश्लेषण किया तीन जैविक प्रतिकृति के एक औसत रहे हैं, और actin (ACTB) के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. सीटी मूल्यों (यानी सीटी <35) detectable हैं, जहां हर समय बिंदुओं के लिए संदेश स्तर भेदभाव के पहले दिन के रिश्तेदार हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

हमेशा ">:" रखने together.within पृष्ठ = के लिए "टी चित्रा 2
प्रवाह cytometry और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा cardiomyocytes के चित्रा 2 विशेषता. (ए) विभिन्न निर्धारण और permeabilization शर्तों के तहत सुबह 10 hiPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes के बिखराव प्रकाश प्रोफाइल. 50,000 घटनाओं एकत्र किए गए थे और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया gated आबादी (यानी छोड़कर मलबे) लाल रंग में दिखाया गया है. (बी) Histograms तीन अलग निर्धारण / permeabilization शर्तों का उपयोग भेदभाव के दिन 10 पर IRX4 की, तरीकों में दक्षता धुंधला में मतभेद illustrating. Insets हर हालत उपयोग कर hiPSCs पर IRX4 का धुंधला में अंतर दिखा. Differenti के दिन 10 पर TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a के इन आंकड़ों मेथनॉल / एसीटोन कारण hiPSCs पर कम, लेकिन detectable, धुंधला करने IRX4 के लिए बचा है क्यों उदाहरण देकर स्पष्ट करना. (सी) Histograms 0.5 माइक्रोग्राम 99% TNNT2 + कोशिकाओं को मापने के लिए आवश्यक न्यूनतम राशि है कि है, लेकिन 2 ग्राम संतृप्ति बिंदु है कि illustrating एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोगों से TNNT2 की व्यावहारिक तालिका 1 में विस्तृत अधिकतम प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं के लिए अनुकूलित धुंधला शर्तों का उपयोग. (डी) histograms, quantitation के लिए जरूरी है. केवल एक ही निर्धारण नियंत्रण दिखाया गया है, लेकिन अनुमापन प्रयोगों निर्धारण नियंत्रण की अपनी इसी अनुमापन करने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी की तुलना के आधार पर गणना कर रहे हैं. TNNT2 प्रोटीन (ई) Quantitation cardiomyocytes पर भेदभाव के 0-24 दिन पर, मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता अंतर के रूप में प्रतिनिधित्व हर समय बिंदु पैच दबाना तकनीक के पूरे सेल वर्तमान दबाना विन्यास का उपयोग भेदभाव के दिन 46 पर एक भी अनायास करार निलय तरह cardiomyocyte से दर्ज की गई. (एफ) के संभावित कार्रवाई के लिए एंटीबॉडी और निर्धारण नियंत्रण के बीच.तों / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 91 मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल cytometry निर्देशित भेदभाव cardiomyocyte IRX4 MLC2a TNNI3 TNNT2 MCL2v प्रवाह
फ्लो द्वारा उच्च क्षमता cardiomyocytes को मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और विशेषता
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Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

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