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Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Abstract

Vi è un urgente bisogno di sviluppare approcci per riparare il cuore danneggiato, la scoperta di nuovi farmaci terapeutici che non hanno effetti tossici sul cuore, e migliorare le strategie per modellare con precisione la malattia di cuore. Il potenziale di sfruttare la tecnologia umana indotto cellule staminali pluripotenti (hiPSC) per generare il muscolo cardiaco "in un piatto" per queste applicazioni continua a generare entusiasmo alto. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) è notevolmente migliorata, offrendoci nuove opportunità di modellare primissime fasi dello sviluppo cardiaco umano non altrimenti accessibili. A differenza di molti metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede l'aggregazione delle cellule o l'aggiunta di Activin A o BMP4 e genera robusta colture di cellule che sono altamente positivo per la troponina cardiaca I e T (TNNI3, TNNT2), Iroquois proteine ​​classe homeodomainIRX-4 (IRX4), miosina catena leggera normativo 2, isoforma ventricolare / muscolo cardiaco (MLC2v) e miosina catena leggera normativo 2, isoforma atriale (MLC2a) dal giorno 10 in tutti cellule staminali embrionali umane (hESC) e le linee hiPSC testato per data. Le celle possono essere diversi passaggi e mantenuti per più di 90 giorni di coltura. La strategia è tecnicamente semplice da implementare e conveniente. Caratterizzazione dei cardiomiociti derivati ​​da cellule pluripotenti spesso include l'analisi dei marcatori di riferimento, sia a livello di mRNA e proteine. Per l'analisi delle proteine, citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità. Tuttavia, la variazione tecnica in preparazione del campione può influenzare significativamente la qualità della citometria a flusso di dati. Così, la standardizzazione dei protocolli di colorazione dovrebbe facilitare il confronto tra le varie strategie di differenziazione. Di conseguenza, ottimizzati protocolli di colorazione per l'analisi di IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 mediante citometria di flusso sono descritti.

Introduction

La generazione di cardiomiociti da hPSCs, tra cui hESC e hiPSC, può funzionare come un modello in vitro di molto precoci processi di sviluppo cardiache umane, permettono di approfondire le fasi non altrimenti accessibili per gli studi meccanicistici. Questo modello di sistema fornisce opportunità uniche per studiare i meccanismi molecolari che controllano l'impegno lignaggio cardiaco e le specifiche destino cellulare. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da hPSCs è notevolmente migliorata 1-15. Tuttavia, tra protocolli c'è variazione linea cellulare rispetto alla efficienza nella generazione di cellule cardiomyogenic ei tempi in cui le cellule esprimono marcatori specifici a camera (per esempio, ventricolo e atri). Idealmente, per le future applicazioni di questo sistema modello, le popolazioni più omogenee di cellule funzionalmente definiti sono desiderati. In contrasto con i metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede cell aggregazione o l'aggiunta di Activin A o proteina morfogenetica dell'osso 4 (BMP4) e robusta genera culture molto positivo per TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, e MLC2a di giorno 10 celle in tutte le linee di hESC e hiPSC testati fino ad oggi. La strategia è tecnicamente semplice da realizzare, soprattutto rispetto a culture tridimensionali, cultura di massa, o strategie corpo embrioide basate 4-9, ed è stato recentemente definito in uno studio che descrive una piccola molecola con tossicità selettiva per hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caratteristiche di questo protocollo sono la differenziazione delle hPSCs in coltura monostrato utilizzando un singolo strato di una matrice qualificato hESC (Matrigel), mezzi di questo tipo utilizzando piccole molecole di modulare la segnalazione Wnt (simile, ma distinto da 1,2,7,13), e citometria a flusso ottimizzato metodi di colorazione per la valutazione dell'efficienza differenziazione e l'identità delle cellule. In sintesi, i vantaggi di questo protocollo rispetto alle relazioni precedenti comprendono il suo costo-effectiveness, riproducibilità, e la sua elevata efficienza per la generazione di cardiomiociti tra più linee HPSC, comprese le linee di hESC e hiPSC.

La citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità, e con una corretta progettazione sperimentale, in grado di fornire misurazioni quantitative. Come per tutte le strategie a base di anticorpi, accurata interpretazione dei risultati sperimentali richiede che gli elementi del disegno dosaggio compreso concentrazione di anticorpi e di fissazione e permeabilizzazione (quando le condizioni di targeting antigeni intracellulari) sono accuratamente testati per ogni anticorpo in condizioni sub-ottimali influenzano in modo significativo l'efficienza di anticorpi vincolante, e quindi, l'interpretazione dei risultati. È importante sottolineare che, se è richiesta la quantificazione, gli anticorpi monoclonali sono essenziali, come gli anticorpi policlonali possono riconoscere più epitopi e sono soggetti a variazioni da lotto a lotto. Attualmente, una varietà di anticorpi (posono stati descritti i protocolli lyclonal e monoclonali) e colorazione per la valutazione di differenziazione in vitro, il che rende difficile confrontare l'efficienza di cardiomiogenesi tra protocolli 1,2,9,11. Per questo motivo, gli anticorpi monoclonali vengono utilizzati quando disponibili per tutte le analisi di citometria a flusso. Andando avanti, si prevede che la standardizzazione di questi protocolli di colorazione, soprattutto per quanto riguarda la quantificazione, dovrebbe consentire una migliore comparazione tra le strategie di differenziazione.

La scelta di marcatori, e le loro corrispondenti anticorpi, utilizzato per valutare la purezza di in vitro cardiomiogenesi varia tra i rapporti. TNNT2 è stato considerato un indicatore di cellule impegnate nel destino cardiomyogenic ed è solitamente usata per valutare l'efficienza dei protocolli di differenziamento cardiaci. Tuttavia, TNNT2 si esprime anche nel muscolo scheletrico durante l'inizio pulcino e ratto sviluppo 16,17 ed è presente nel muscolo liscio umano 18 in vitro. MLC2v e MLC2a sono abitualmente utilizzati come marcatori surrogati di ventricolari ed atriali sottotipi, rispettivamente. Tuttavia, le sfide con basandosi su MLC2v e MLC2a per determinare cardiomiociti sottotipo nel contesto di differenziazione in vitro derivano dal fatto che questi prodotti genici non possono essere limitati a una specifica camera durante lo sviluppo cardiaco, dal tubo cuore attraverso adulto. Nel roditore loop cuore, MLC2a mRNA è predominante nella atriale / zona del tratto di afflusso e MLC2v mRNA è predominante nelle regioni del tratto ventricolare / deflusso. Nel cuore loop, co-espressione di MLC2a e MLC2v mRNA si osservano nel tratto di afflusso, canale atrioventricolare, e il tratto di efflusso 19,20. Entro 3 giorni dopo la nascita, MLC2v mRNA è limitato al ventricolo e di 10 giorni dopo la nascita, MLC2a è limitata alla atri neonatale nel ratto cuore 19. Pertanto, l'interpretazionedei dati riguardanti l'efficienza cardiomiogenesi e identità sottotipo deve non solo considerare la presenza e la quantità di livelli di marcatori di riferimento, ma deve prendere in considerazione lo stadio di sviluppo (s) a cui i punti temporali di differenziazione che vengono analizzati corrispondono. Ciò è particolarmente importante se si considera che la fase di maturazione delle cellule cardiomyogenic generate dalla differenziazione in vitro di hPSCs assomiglia più da vicino quelle di sviluppo embrionale / fetale 21-25. Così, basandosi su espressione spaziale di un marcatore nel cuore postnatale potrebbe non essere adatto per la valutazione delle cellule HPSC-derivate, almeno in alcuni casi.

Nel tentativo di agevolare lo sviluppo di criteri più specifici per definire l'identità dei cardiomiociti in vitro, TNNI3 è considerato un indicatore importante per valutare cardiomiogenesi in vitro in quanto è limitato al muscolo cardiaco durante l'embriogenesi in pulcino e zebrafish 15,20ed è assente nel feto umano muscolo scheletrico 26. Mentre TNNI1 è presente nel cuore fetale umano, TNNI3 è la sola isoforma TNNI presente nel cuore adulto normale 27,28. Per quanto riguarda cardiomiociti sottotipo identità, IRX4 29-31 è un marcatore informativa di cellule con un destino ventricolare. A livello di proteine, IRX4 è stato recentemente dimostrato di essere limitato al ventricolo dal tubo lineari cuore attraverso le fasi neonatali nel topo 32. Di conseguenza, sono descritti protocolli di colorazione ottimizzati per l'analisi di TNNI3 e IRX4 mediante citometria a flusso. A nostra conoscenza, questa è la prima descrizione di un metodo efficace per la colorazione a base di anticorpi e l'analisi dei livelli di IRX4 in cardiomiociti umani mediante citometria a flusso.

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Protocol

1 Soluzione e preparazione media

  1. hESC Matrix qualificato Rivestimento Stock Solution
    1. Lentamente scongelare hESC matrice qualificato (5 ml) su ghiaccio a 4 ° C durante la notte. Distribuire aliquote in provette da microcentrifuga pre-refrigerati, 1,5 ml sterile e conservare a -20 ° C immediatamente.
      NOTA: Il volume della parte aliquota prelevata variano in base alla partita e varia tipicamente 270-350 ml. Produttore fornisce dettagli riguardanti il ​​volume di aliquota necessaria per ottenere una concentrazione 1x sulla diluizione in 25 ml come descritto al punto 2.1.
  2. HPSC media Immagini Solutions
    1. Utilizzare acqua ultrapura come diluente, se non diversamente indicato. Sterilizzare tutti i componenti utilizzando un filtro di 0,22 micron. Conservare le seguenti soluzioni rinfusa a 4 ° C: bicarbonato di sodio (75 mg / ml); acido citrico (10 mM, pH = 3).
    2. Sterilizzare tutti i componenti con 0,2 micron filtro siringa e memorizzare ogni come aliquote a -20 ° C: Rho chinasi (ROCK) inibitore Y-27632 (10mM in DPBS, 100 microlitri aliquota); Acido L-ascorbico 2-fosfato (64 mg / ml, 500 microlitri aliquota); selenito di sodio (70 mg / ml, 100 ml un'aliquota); transferrina (50 mg / ml, 107 ml aliquota); fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2; 200 ng / ml in DPBS, 250 microlitri aliquota); fattore di crescita trasformante beta 1 (TGFβ1, 100 ng / ml in freddo 10 mM acido citrico, 10 microlitri aliquota).
  3. HPSC media E8 Soluzione Composizione
    1. Preparare il supporto utilizzando le aliquote preparati nella Fase 1.2: DMEM / F12 (con L-glutammina e HEPES; 500 ml), bicarbonato di sodio (3,62 ml; finale: 543 mg / ml), acido L-ascorbico 2-fosfato (500 microlitri; finali : 64 mg / ml), selenito di sodio (100 ml; finale: 140 ng / ml), la transferrina (107 microlitri; finale: 10,7 mg / ml), insulina (1 ml; finale: 20 mg / ml), FGF2 (250 microlitri; finale: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 microlitri; finale: 2 ng / ml).
    2. Unire tutti i componenti, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
  4. HPSC media E8 con ROCK Inhibitor
    1. Aggiungi inibitore ROCK 15 ml a 12 ml di E8 supporti preparati come sopra e mescolare bene. Assicurarsi che la concentrazione finale è di 10 micron dopo l'aggiunta di cellule / dei media nel passaggio 3.7.
  5. Archivi Soluzioni di Wnt Modulatori
    1. Conservare le seguenti aliquote a -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM in DMSO, 15 microlitri aliquote). IWR-1 (a 4 (1,3,3a, 4,7,7a-esaidro-1,3-diosso-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl) -N-8-chinolinile-benzammide; 10 mM in DMSO, 6 microlitri aliquote).
  6. Differenziazione media
    1. Preparare supporti differenziazione # 1 con RPMI 1640 (con L-glutammina) con il 2% supplemento di insulina B27 meno.
    2. Preparare supporti differenziazione # 2 con RPMI 1640 (con L-glutammina) con il 2% B27 più supplemento di insulina e il 2% FBS.
  7. Cella Wash Solution Fo coltura cellulare
    1. Utilizzare fosfato soluzione salina tamponata Dulbecco (DPBS), senza calcio o magnesio.
  8. Cella soluzione di lavaggio per Citometria a flusso
    1. Utilizzare tampone fosfato (PBS senza calcio o magnesio) con 1% FBS. Conservare a 4 ° C.
  9. Soluzione Manutenzione Cell per Citometria a Flusso
    1. Utilizzare soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; senza calcio o magnesio) con il 5% FBS. Conservare a 4 ° C.
  10. Fissaggio Soluzioni per Citometria a flusso
    1. Utilizzare tampone Cytofix come soluzione di fissaggio per gli anticorpi TNNI3 e IRX4.
    2. Utilizzare 4% paraformaldeide in PBS 1x (fare fresco) come soluzione di fissaggio per gli anticorpi TNNT2 e MLC2a.
    3. Utilizzare il 70% di metanolo / acetone 30% come soluzione di fissaggio per l'anticorpo MLC2v.
    4. Conservare tutte le soluzioni a 4 ° C.
  11. Permeabilizzazione Soluzioni per Citometria a flusso
    1. Utilizzare Phosflow Perm tampone III come soluzione di permeabilizzazione fo TNNI3 e IRX4 anticorpi. Conservare a temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Utilizzare 0,2% Triton X-100 in PBS 1x, come soluzione permeabilizzazione per gli anticorpi TNNT2, MLC2v, e MLC2a. Conservare a 4 ° C.
  12. Blocking Solution
    1. Utilizzare siero di capra al 10% in PBS 1x. Fare fresco e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.

2 Piastra di rivestimento

  1. Lentamente scongelare 1 aliquota di matrice qualificato hESC a 4 ° C per 30 minuti, aggiungere 25 ml di acqua refrigerata DMEM / F12 e mescolare bene in cappa di coltura tissutale sterilizzato immediatamente prima del rivestimento 6 pozzetti.
  2. Aggiungere 1 ml per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti sotto il cofano coltura tissutale sterilizzati (1 aliquota della matrice qualificato hESC è sufficiente per rivestire quattro 6 pozzetti).
  3. Lasciare matrice qualificato hESC per impostare per 30 minuti a temperatura ambiente sotto il cofano. Aspirare l'eccesso hESC matrice qualificato e aggiungere 2 ml di E8 media con inibitore ROCK in ciascun pozzetto. Utilizzare piastre immediatamente, o se desired, conservare a 4 ° C subito dopo la placcatura per massimo 1 settimana ed equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.

3. Passaging e manutenzione di convivenze hPSCs in monostrato Cultura

  1. Mantenere hPSCs in coltura monostrato in 6 pozzetti ed eseguire tutti i passaggi sotto una cappa di coltura di tessuti sterile.
  2. Utilizzare linee HPSC che sono ben stabiliti (> P20) e mostrano una morfologia omogenea, senza la presenza di cellule con un neurale, morfologia epithelial- o fibroblasti-like. Assicurarsi cellule proliferano robusta, e in media, passaggio ogni tre giorni al 75% di confluenza, quando seminate a 0,75 x 10 6 per bene.
  3. HPSCs Passage con dissociazione a livello di singola cellula, almeno 5 volte prima di iniziare di differenziazione al fine di garantire la massima efficienza di differenziazione. Per hPSCs passaggio, i media E8 aspirare e lavare le cellule due volte con 4 ml di 1x DPBS (pre-riscaldato a temperatura ambiente). Aggiungere 1 ml di distacco delle celluleSoluzione mento (pre-riscaldato a temperatura ambiente) ad ogni pozzetto e lasciare il bene indisturbati per 3-7 minuti, fino a quando i bordi delle celle iniziano a round-up.
  4. Utilizzare una pipetta di vetro cotone collegato con bulbo per rimuovere le cellule e trasferire in un tubo da 15 ml contenente 1 ml di DMEM media / F12 (per inattivare la soluzione distacco delle cellule).
  5. Rimuovere 10 un'aliquota ml di soluzione di cellule e mescolare con 10 ml di trypan blu in una provetta. Contare le cellule (ad es automatica o manuale) emocitometro mentre restante cellule vengono raccolte mediante centrifugazione a 130 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Usando questo protocollo, si aspettano vitalità 70-80% utilizzando un emocitometro automatizzata e andare avanti, di base tutti i numeri cellulari su conta delle cellule totali.
  6. Aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare in DMEM / F12 per una concentrazione finale di 0,75 x 10 6 cellule per 500 ml.
  7. Aggiungere 500 ml di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti dove ciascuno contai purens 2 ml E8 media con inibitore ROCK, preparato al punto 2.3. Lasciando piastra sul piano di lavoro, spostare delicatamente in cellule fronte-to-back e di movimento da lato a lato per disperdere in modo uniforme in tutto il bene. Cellule Ritorno a incubatore al 5% di CO 2, 37 ° C.
  8. A partire 24 ore dopo passaging, sostituire il supporto quotidiano utilizzando 2 ml / pozzetto E8 senza inibitore ROCK. Ottimizzare la densità di semina per raggiungere il 100% di confluenza prima dell'inizio della differenziazione. Seme 0,75 x 10 6 cellule / ben quattro giorni prima dell'inizio della differenziazione, ma ottimizzare per ciascuna linea cellulare come necessario.

4 Cardiomyocyte Induzione di hPSCs da selettiva modulazione del Wnt Pathway

  1. Aggiorna i media (2 ml / pozzetto) al giorno durante i giorni 0-7, e ogni altro giorno dopo giorno 8.
  2. Il giorno 0, iniziare il processo di differenziazione sostituendo E8 dei media con i media differenziazione # 1. Aggiungere 1,2 microlitri CHIR (6 mM finale) in ciascun pozzetto. Ripetere il giorno 1.
  3. Nei giorni 2-3, sostituirlo con differen frescamultimediale ziazione # 1.
  4. Il giorno 4, sostituire con differenziazione fresco multimediale # 1. Aggiungere 1 ml IWR-1 (5 mM finale) in ciascun pozzetto. Ripetere il giorno 5.
  5. Nei giorni 6-7, sostituirlo con differenziazione fresco multimediale # 1.
  6. Il giorno 8, sostituire con differenziazione fresco multimediale # 2.
  7. Continuare a sostituire con i media differenziazione # 2 a giorni alterni per tempo desiderato della cultura.
  8. Se lo si desidera, cardiomiociti passaggio utilizzando la soluzione di distacco delle cellule seguendo i passaggi descritti in 3,3-3,6, ma sostituendo media con i media differenziazione # 2. Durante passaging, dissociare cardiomiociti in piccoli gruppi di ~ 3-10 cellule. Seed a ~ 6 x 10 5 cellule per pozzetto utilizzando hESC pozzetti rivestiti matrice qualificato e mezzi di differenziazione 2 #.

5. insieme di cellule di Citometria a Flusso

  1. Eseguire tutti gli aspetti rimanenti passaggi 5-9 sul banco di laboratorio (ad esempio, non sterile).
  2. Supporti di crescita Aspirare e lavare le cellule due volte con PBS 1x.Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco delle cellule (pre-riscaldato a temperatura ambiente) ad ogni pozzetto e lasciare riposare per 3-7 minuti, fino a quando i bordi delle celle iniziano a round-up. Utilizzare un usa e getta 9 "pipetta di vetro borosilicato cotone collegato con bulbo per rimuovere le cellule e trasferire in un tubo da 15 ml su ghiaccio.
  3. Durante resto del protocollo, mantenere le cellule in ghiaccio ed eseguire centrifugazioni a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  4. Raccogliere le cellule per centrifugazione e la soluzione di aspirare. Risospendere le cellule in soluzione di lavaggio cella 10 ml con una pipetta 10 ml sierologico con triturazione ripetuto per garantire grumi di cellule sono disperse in celle singole. Contare le cellule come al punto 3.5 mentre restante cellule vengono raccolte mediante centrifugazione.
  5. Risospendere le cellule in soluzione di lavaggio delle cellule avendo cura di disaggregare completamente pellet e un'aliquota 1 x 10 6 cellule per provetta a fondo tondo. Raccogliere le cellule per centrifugazione e la soluzione di aspirare.

6 Fissazione ePermeabilizzazione delle cellule per intracellulare Antigen colorazione

  1. Aggiungere la soluzione di fissaggio 100 ml di pellet. Aggiungere la soluzione goccia a goccia con continuo vortex dolce e quindi impostare in ghiaccio per 15 min.
  2. Aggiungere la soluzione di lavaggio delle cellule 3 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione e la soluzione di aspirare.
  3. Aggiungere la soluzione di permeabilizzazione 100 ml di pellet. Aggiungere la soluzione goccia a goccia con continuo vortex delicato quindi impostare in ghiaccio per 30 min. Utilizzare metodiche di fissazione e permeabilizzazione come indicato per ogni anticorpo in Tabella 1.
  4. Aggiungere la soluzione di lavaggio delle cellule 3 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione e la soluzione di aspirare. Ripetere per un totale di due lavaggi dopo permeabilizzazione.
Anticorpo primario (Clone) Immunogeno / epitopi riconosciuta Istotype controllo Quantità di anticorpo primario per 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri Fissazione Soluzione Permeabilization Soluzione Anticorpo secondario Quantità di anticorpo secondario / 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri
Per misure positive per cento Per Antigen quantificazione
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (umano) Mouse IgG2b 1.0 mcg 3.0 mcg BD Cytofix BD Phosflow perm III Capra anti-topo IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Lunghezza totale purificato nativo troponina T proteina umana. Topo IgG1 1.0 mcg 2.0 mcg 4% PFA1% in PBS 0.2% Triton X-100 in PBS 1% Capra anti-topo IgG1 - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Mouse IgG2a 2.0 mcg 3.0 mcg 70% metanolo / acetone 30% 0.2% Triton X-100 in PBS 1% Capra anti-topo IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) pieno lunghezza proteina umana ricombinante di MYL7 umano prodotto in E. coli Topo IgG1 0,5 mcg 3.0 mcg 4% PFA 1% in PBS 0.2% Triton X-100 in PBS 1% Capra anti-topo IgG1 - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		Coniglio IgG 0,5 mcg 0,5 mcg BD Cytofix BD Phosflow perm III Capra anti-rabbit IgG-PE 600 ng

Tabella 1 Concentrazioni anticorpi. Elencati sono l'anticorpo primario, clone (se monoclonali), le concentrazioni ottimizzate e metodiche di fissazione e permeabilizzazione per ogni anticorpo primario e secondario utilizzati per analisi di citometria a flusso. Poiché le concentrazioni di anticorpi azionari può variare tra i fornitori dello stesso clone, concentrazioni finali di ciascun anticorpo per 1 x 10 6 cellule in un volume di dosaggio fisso, piuttosto che diluizioni, sono forniti. Il immunogeno usato per generare l'anticorpo, o epitopo riconosciuto da anticorpi, come previsto dal costruttore, è elencata ma non è stato verificato sperimentalmente qui.

7 Antibody colorazione

  1. Per ogni esperimento, includere un controllo senza macchia per il fissaggio / condizioni permeabilizzazione ed il controllo isotipico appropriato per ogni anticorpo primario utilizzato. Includi tipi di cellule non-cardiomiociti come controlli negativi (ad esempio, le cellule staminali pluripotenti o fibroblasti). Utilizzare controlli isotipici alla stessa concentrazione come corrispondente anticorpo primario (vedi Tabella 1).
  2. Risospendere le cellule in 100 microlitri di blocco soluzione con una pipetta P200 disaggregare le cellule. Impostare i campioni in ghiaccio per 25 min con dolce dondolio.
  3. Senza rimuovere soluzione bloccante, aggiungere l'anticorpo primario o controllo isotipico per le linee guida in Tabella 1. Incubare 45 min in ghiaccio con dolce dondolio.
  4. Aggiungere la soluzione di lavaggio delle cellule 3 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione e la soluzione di aspirare. Ripetere per un totale di due lavaggi successivi etichettatura anticorpo primario.
  5. Se si utilizza un anticorpo primario fluoroforo coniugato, procedere alla 8.1. Quando viene utilizzato un anticorpo primario non coniugato (come per tutti gli indicatori descritti qui), eseguire marcatura con anticorpo secondario che è coniugato ad un fluoroforo come segue.
  6. Risospendere le cellule in 100 microlitri di blocco soluzione con una pipetta P200 per disacellule ggregate.
  7. Aggiungi anticorpo secondario per le linee guida in Tabella 1. Incubare 30 min in ghiaccio con dolce dondolio.
  8. Aggiungere la soluzione di lavaggio delle cellule 3 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione e la soluzione di aspirare. Ripetere per un totale di due lavaggi dopo etichettatura anticorpo secondario.

8 Preparazione di cellule di Citometria a Flusso

  1. Risospendere le cellule in 400 microlitri soluzione di manutenzione cella utilizzando una pipetta P1000 di disaggregare le cellule.
  2. Preparare un tappo filtro cella di un tubo fondo rotondo da pre-bagnare con la soluzione di manutenzione cella 50 ml. Situato provetta in ghiaccio. Utilizzare il tappo filtro cella per impedire che aggregati di cellule che potrebbero ostruire il citofluorimetro.
  3. Trasferire la soluzione cellula a cellula tappo filtro e permettere sospensione cellulare scolare per gravità. Toccare fondo della provetta delicatamente sul banco come necessario, in modo che le cellule sono raccolti in provetta e impostare di nuovo sul ghiaccio il più rapidamente possibile. Filtro Sciacquare con 250 microlitri di manutenzione cella in modoluzione per garantire il recupero massimo delle cellule.
  4. Mantenere le cellule in ghiaccio e proteggere dalla luce fino analizzati mediante citometria di flusso.

9 Citometria a flusso Analisi

Impostazioni di acquisizione dettagliate varieranno tra gli strumenti. Parametri fondamentali da considerare per la raccolta dei dati ottimale sono descritte di seguito.

  1. Per una stabilità ottimale flusso, accertarsi che le dimensioni dell'ugello supera 5-6x il diametro della cella analizzato.
    NOTA: Questo può variare fra gli strumenti, ma è una considerazione importante sia per gli analizzatori e si seleziona l'appropriata dimensione dell'ugello per l'ordinamento delle cellule. Il diametro medio del giorno 10 cardiomiociti è di 11 micron (che vanno 8-14 micron); quindi, uno standard tubo di iniezione del campione 150 micron su un analizzatore funziona bene.
  2. Immediatamente prima analisi dei dati, vortice ogni provetta brevemente per disperdere aggregati di cellule.
  3. Ottimizzare l'ora e le impostazioni della tensione side scatter per ogni tipo di cellula basano sucontrollo senza macchia per ogni condizione di fissaggio / permeabilizzazione utilizzato per l'esperimento in modo che le popolazioni di interesse sono in scala e centrati (Figura 2A).
    1. Mantenere queste impostazioni in tutto un solo esperimento e di essere coerente da esperimento a esperimento sullo stesso strumento, come cambiamenti significativi possono indicare potenziali problemi con il citometro a flusso o la preparazione del campione.
  4. Per ogni fluoroforo, analizzare il controllo isotipico e regolare alla tensione laser per determinare l'intensità minima richiesta per ottenere un istogramma di fluorescenza che visualizza i bordi destro e sinistro del picco. Mantenere le impostazioni laser per ciascun isotipo di controllo cui si acquisiscano dati sul corrispondente campioni anticorpo-macchiato.
    NOTA: Segnale deriva spesso avviene nel tempo sullo stesso strumento. È fondamentale per regolare le impostazioni laser all'inizio di ogni esperimento basato sul controllo isotipico appropriato.
  5. Raccogliere un minimo di10.000 eventi. 50.000 eventi sono preferiti.
  6. Per le analisi statistiche, porta la popolazione di cellule vive per escludere detriti (Figura 2A). Determinare cellule positive per cento nella popolazione gated in base al posizionamento marcatore che permette contributo ≤2% da isotipo di controllo, come mostrato in Figura 2B, C.

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Representative Results

Il giorno 0, le cellule sono al 100% confluenti con morfologia compatta e detriti cellulari minima. Nei giorni 1-2, è comune osservare significativo morte cellulare (40-50%), ma le cellule attaccate manterrà morfologia compatta (Figura 1A). Durante questo periodo, i media è arancione e torbido. Rosa supporto indica morte cellulare eccessiva, e in questo caso, confermare con trypan blu e interrompere se la morte cellulare supera il 70%. Le cellule si riprenderà nei giorni 3-4 e la densità aumenteranno. Durante i giorni 5-6, la morte cellulare minima verifica e patch dense può iniziare a comparire. Da giorni 7-8, un monostrato confluente è realizzato con morfologia compatta intervallati da macchie dense. Cellule iniziano spontaneamente contraenti dal giorno 8 e le prime contrazioni sono spesso visibili nelle zone dense. Di giorno 10, più robusta contrazione si osserva e continuerà a diffondersi in tutta la cultura nei giorni successivi. Immunocitochimica colorazione per α-actinina e TNNT2 struttura spettacolo sarcomero(Figura 1A). Come misurata mediante real time PCR quantitativa (qRT-PCR), i livelli di mRNA di markers di riferimento del mesoderma e visualizzazione impegno cardiomyogenic profili temporali come previsto (Figura 1B), con una robusta espressione della proteina cardiaca marcatori Homeobox NKX-2.5 (NKX2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, e miosina-6 (MYH6). Molto bassa a livelli non rilevabili di muscolatura liscia (catena pesante della miosina 11, MYH11) e muscolo scheletrico (miogenina, MYOG) marcatori sono di routine. Coerentemente con lo sviluppo precoce in cui l'espressione si osserva sia in muscolo cardiaco e scheletrico, prima di essere limitato al muscolo scheletrico negli adulti 20,27,28, troponina isoforme TNNI1 e TNNI2 sono robustamente rilevati durante i giorni 7-8.

Coerentemente con altri rapporti, questo vitro strategia di differenziazione in cardiomiociti genera con le caratteristiche dei primi progenitori cardiaci (morfologia arrotondata, co-espressione di MLC2a, MLC2v) 19 30,32. In citometria a flusso, i profili di dispersione di luce varieranno tra i tipi di cellule e cambiare considerevolmente tra fissazione / condizioni permeabilizzazione (Figura 2A). In queste diverse condizioni di preparazione delle cellule, citometria a flusso analisi rivela controlli isotipici con picchi singoli con una chiara distinzione tra controllo isotipo e anticorpi (Figura 2B). Cellule pluripotenti o altre cellule non cardiomiociti sono negativi per i marcatori utilizzati qui.

Utilizzando questo protocollo di differenziazione e di colorazione, la popolazione di cellule risultante è in genere il 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v +, e il 96% MLC2a + dal giorno 10 di differenziazione come misurato mediante citometria a flusso. TNNT2 + cellule il 99% sono osservate (Figure 2C, 2D), ma, come sopra descritte, TNNT2 non è unicadi cardiomiociti durante lo sviluppo e, quindi, l'affermazione che le cellule sono il 99% cardiomiociti autentici di giorno 10 si basa sulla proteina TNNI3. Si segnala che con la continua coltura oltre il giorno 10, i livelli proteici di proteine ​​strutturali rimarranno elevati anche se i livelli di espressione genica relativa diminuirà rispetto al picco di espressione, come monitorato da qRT-PCR, compatibile con la stabilità proteica e tassi di turnover di 3,2 e di 3,5 giorni, rispettivamente, per TNNI e TNNT 33. Un esempio di questa osservazione è mostrato per TNNT2 (mRNA picco a giorno 11 (Figura 1B), i livelli di proteina robusti a giorno 20 + (Figura 2E).

Figura 1
Figura 1 Schema generale di cardiomiociti differenziazione dai hPSCs e dati rappresentativi. (A) Schema di cardiomiociti differentiatio protocollo n annotato con corrispondente fase di lignaggio e / o impegno destino cellulare. Immagini a contrasto di fase rappresentative di cellule in fasi principali del processo di differenziazione. Barra della scala = 10 micron. Estrema destra = immagine immunocitochimica di α-actinina (verde) ricoperto di TNNT2 (rosso) e nuclei (blu). (B) qRT-PCR analisi (per set di sonde, vedere la tabella dei materiali) del 18 mesoderma riferimento e indicatori di sviluppo cardiaci durante i primi 17 giorni di differenziamento. Tutti i dati sono una media di tre repliche biologiche ogni analizzati in triplice copia, in cui le barre di errore rappresentano l'errore standard della media, e sono normalizzati di actina (ACTB). Livelli di segnalazione per tutti i punti di tempo sono relative al primo giorno di differenziazione in cui i valori Ct sono rilevabili (ovvero Ct <35). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2 Caratterizzazione dei cardiomiociti di citometria a flusso e di elettrofisiologia. (A) i profili di dispersione luce del giorno 10 cardiomiociti hiPSC-derivati ​​in varie metodiche di fissazione e permeabilizzazione. 50.000 eventi sono stati raccolti e la popolazione gated (cioè residui esclusa) utilizzati per analisi statistiche è riportato in rosso. (B) Istogrammi di IRX4 il giorno 10 di differenziazione utilizzando tre differenti condizioni di fissazione / permeabilizzazione, illustrando le differenze di colorazione di efficienza tra i metodi. Riquadri mostrano differenze nella colorazione delle IRX4 su hiPSCs con ogni condizione. Questi dati spiegano perché metanolo / acetone è evitata per IRX4 a causa della bassa, ma rilevabile, colorazione su hiPSCs. (C) Istogrammi di TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a il giorno 10 di Differenti zione utilizzando condizioni di colorazione ottimizzate per le cellule positive per cento massimi specificati nella tabella 1. (D) Istogrammi di TNNT2 da esperimenti di titolazione di anticorpi, illustrando che 0,5 mg è l'importo minimo richiesto per la misurazione TNNT2 + cellule 99%, ma che 2 mg è il punto di saturazione necessaria per la quantificazione. Viene mostrato solo un unico controllo isotipico, ma esperimenti di titolazione sono calcolati sulla base di confronto tra ciascun anticorpo al suo corrispondente titolazione del controllo isotipico. (E) Quantificazione delle proteine ​​TNNT2 su cardiomiociti nei giorni 0-24 di differenziazione, rappresentato come la differenza di intensità di fluorescenza mediana tra anticorpo e il controllo isotipico per ogni punto di tempo. (F) potenziale d'azione registrata da un singolo spontaneamente contrarre cardiomiociti ventricolari-come il giorno 46 di differenziazione con la configurazione corrente pinza whole-cell della tecnica del patch clamp.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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Biologia Cellulare cellule staminali pluripotenti indotte umane citometria a flusso la differenziazione diretta cardiomiociti IRX4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso
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Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

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