Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High Efficiency Differensiering of Human Pluripotent stamceller til Cardiomyocytes og karakterisering med flowcytometri

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

Artikkelen beskriver den detaljerte metode for å effektivt skille humane pluripotente stamceller til kardiomyocytter ved selektivt å modulere Wnt veien, etterfulgt av strømningscytometri-analyse av referansemarkører for å vurdere homogenitet og identiteten av befolkningen.

Abstract

Det er et presserende behov for å utvikle metoder for å reparere det ødelagte hjerte, oppdage nye terapeutiske legemidler som ikke har toksiske effekter på hjertet, og bedre strategier for å nøyaktig modelhjertesykdom. Potensialet i å utnytte menneskeskapte pluripotent stamcelle (hiPSC) teknologi for å generere hjertemuskulatur "i en skål" for disse programmene fortsetter å generere høy entusiasme. I de senere årene har evnen til å effektivt generere cardiomyogenic celler fra menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) kraftig forbedret, og tilbyr oss nye muligheter til å modellere svært tidlige stadier av menneskelig hjerte utvikling ellers ikke er tilgjengelig. I motsetning til mange tidligere metoder, cardiomyocyte differensiering protokollen beskrevet her ikke krever celle aggregering eller tillegg av activin A eller BMP4 og robust genererer kulturer av celler som er svært positivt for hjerte troponin I og T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klasse homeodomain proteinIRX-4 (IRX4), myosin regulatoriske lett kjede 2, ventrikkel / hjertemuskulatur isoform (MLC2v) og myosin regulatoriske lett kjede 2, atrial isoform (MLC2a) etter dag 10 på tvers av alle humane embryonale stamceller (hESC) og hiPSC linjer testet til dato. Celler kan passaged og vedlikeholdes i mer enn 90 dager i kultur. Strategien er teknisk enkel å implementere og kostnadseffektiv. Karakterisering av kardiomyocytter avledet fra pluripotente celler ofte inneholder analyse av referansemarkører, både på mRNA og proteinnivå. For proteinanalyse, strømningscytometri er et kraftig analytisk verktøy for å bedømme kvaliteten av celler i kulturen, og å bestemme subpopulasjon homogenitet. Imidlertid kan teknisk variasjon i prøvepreparering i betydelig grad påvirke kvaliteten av flowcytometri data. Derfor bør standardisering av flekker protokoller lette sammenligninger mellom ulike differensieringsstrategier. Følgelig optimalisert fargingsprotokoller for analyse av IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, og TNNT2 ved strømningscytometri, er beskrevet.

Introduction

Generering av cardiomyocytes fra hPSCs, inkludert hESC og hiPSC, kan fungere som en in vitro modell av svært tidlige humane kardiale utviklingsprosesser, og gir innsikt i etapper ellers ikke er tilgjengelig for mekanistiske studier. Denne modellen system gir unike muligheter til å studere molekylære mekanismer som styrer hjerte avstamning engasjement og celle skjebne spesifikasjon. I de senere årene har evnen til å effektivt generere cardiomyogenic celler fra hPSCs kraftig forbedret 1-15. Men blant protokoller er det cellelinje variasjon med hensyn til effektivitet i å generere cardiomyogenic celler og tidspunktet når cellene uttrykker kammer-spesifikke markører (f.eks ventrikkel og atrier). Ideelt for fremtidige anvendelser av denne modellsystem, er mer homogene populasjoner av funksjonelt definerte celler ønsket. I motsetning til tidligere fremgangsmåter, den cardiomyocyte differensiering protokoll beskrevet her krever ikke cell aggregering eller tillegg av activin A eller Benmorfogenetiske protein 4 (BMP4) og robust genererer kulturer svært positivt for TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, og MLC2a etter dag 10 celler på tvers av alle hESC og hiPSC linjer testet til dags dato. Strategien er teknisk enkelt å implementere, spesielt i forhold til tredimensjonale kulturer, massekultur, eller embryoid kroppen baserte strategier 4-9, og ble nylig definert i en studie som beskriver et lite molekyl med selektiv toksisitet til hPSCs (Boheler et al. ) 65. Funksjoner i denne protokollen omfatter differensiering av hPSCs i monolayer kultur ved hjelp av et enkelt lag av en hESC kvalifisert matrise (Matrigel), fullt definerte medier ved hjelp av små molekyler for å modulere Wnt signal (lignende, men likevel forskjellig fra 1,2,7,13), og optimalisert flowcytometri flekker metoder for evaluering av differensiering effektivitet og celle identitet. Oppsummert fordelene ved denne protokollen i forhold til tidligere rapporter inkluderer sin kostnads ​​effectiveness, reproduserbarhet, og høy effektivitet for å generere cardiomyocytes mellom flere hPSC linjer, inkludert hESC og hiPSC linjer.

Strømningscytometri er en kraftig analytisk verktøy for å bedømme kvaliteten av celler i kulturen, og å bestemme subpopulasjon homogenitet, og med riktig eksperimentell design, kan gi kvantitative målinger. Som med alle antistoffbaserte strategier, nøyaktig tolkning av eksperimentelle resultater krever at elementene i analysen utforming inkludert antistoff konsentrasjon og fiksering og permeabilization forhold (når målretting intracellulære antigener) er nøye testet for hvert antistoff som sub-optimale forhold i vesentlig grad påvirker effektiviteten av antistoff binding, og derfor, tolkning av resultatene. Viktigere, hvis kvantitering er nødvendig, monoklonale antistoffer er viktig, som polyklonale antistoffer kan gjenkjenne multiple epitoper og er utsatt for batch-til-batch-variant. For tiden er en rekke antistoffer (polyclonal og monoklonale) og flekker protokoller har blitt beskrevet for vurdering av in vitro differensiering, noe som gjør det vanskelig å sammenligne effektiviteten av cardiomyogenesis blant protokoller 1,2,9,11. Derfor er monoklonale antistoffer som brukes når det er tilgjengelig for alle flowcytometri analyser. Fremover ventes det at standardisering av disse farge protokoller, spesielt med hensyn til kvantifisering, bør bedre tillate sammenligning mellom differensieringsstrategier.

Valget av markører, og deres tilsvarende antistoffer, som brukes for å vurdere renhet på in vitro cardiomyogenesis varierer mellom rapporter. TNNT2 har vært ansett som en indikator på celler forpliktet til cardiomyogenic skjebne og blir rutinemessig brukt til å vurdere effektiviteten av hjerte differensiering protokoller. Imidlertid er TNNT2 også uttrykt i skjelettmuskel under tidlig kylling og rotte utvikling 16,17, og det er til stede i human glatt muskulatur 18 in vitro. MLC2v og MLC2a blir rutinemessig brukt som surrogatmarkører for ventrikulære og atrial subtyper, henholdsvis. Imidlertid utfordringer med å stole på MLC2v og MLC2a å bestemme cardiomyocyte subtype i forbindelse med in vitro differensiering oppstår fra det faktum at disse genproduktene ikke kan være begrenset til et bestemt kammer gjennom hjerte utvikling av hjerte rør gjennom voksen. I gnager loopet hjertet, er MLC2a mRNA dominerende i atrial / tilsig kanalen området og MLC2v mRNA er dominerende i ventrikkel / utbetaling veis regioner. I den løkke hjertet, er co-uttrykk for MLC2a og MLC2v mRNA observert i tilsig kanalen, atrioventrikulær kanal, og utløpskanalen 19,20. Av tre dager etter fødselen, er MLC2v mRNA begrenset til ventrikkelen og med 10 dager etter fødselen, er MLC2a begrenset til atriene i nyfødtrottehjerte 19. Derfor tolkningav data om cardiomyogenesis effektivitet og subtype identitet må ikke bare vurdere tilstedeværelse og mengde referanse markør nivåer, men må vurdere utviklingsstadiet (e) som de tidspunkter for differensiering som analyseres korrespondere. Dette er spesielt viktig med tanke på at modning stadium av cardiomyogenic celler generert av in vitro differensiering av hPSCs ligner mest på de av embryo / fosterutvikling 21-25. Dermed avhengig av en markør romlige uttrykk i barsel hjerte kan ikke være hensiktsmessig for vurderingen av hPSC-avledet celler, i hvert fall i noen tilfeller.

I et forsøk på å legge til rette for utvikling av mer spesifikke kriterier for å definere cardiomyocyte identitet in vitro, er TNNI3 anses å være en verdifull markør for å vurdere cardiomyogenesis in vitro som det er begrenset til hjertemuskulatur hele embryogenesen i chick og sebrafisk 15,20og er fraværende i menneskelig fosterskjelettmuskulatur 26. Mens TNNI1 er tilstede i menneskelig fosterets hjerte, er TNNI3 den eneste TNNI isoform stede i normal voksen hjerte 27,28. Angå cardiomyocyte subtype identitet, IRX4 29-31 er en informativ markør av celler med en ventrikulær skjebne. På proteinnivå har IRX4 nylig blitt vist å være begrenset til ventrikkelen fra lineær hjerte rør gjennom neonatale stadier hos mus 32. Følgelig er optimalisert fargings protokoller for analyse av TNNI3 og IRX4 ved flowcytometri beskrevet. Så vidt vi vet, er dette den første beskrivelse av en fremgangsmåte for effektiv antistoff-baserte flekker og analyse av IRX4 nivåer i humane kardiomyocytter ved strømningscytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Løsning og Media Forberedelse

  1. hESC Kvalifisert Matrix Coating Stock Solution
    1. Sakte tine hESC kvalifisert matrise (5 ml) på isen ved 4 ° C over natten. Dispensere alikvotene i på forhånd nedkjølte, 1,5 ml steril mikrosentrifugerør og umiddelbart oppbevar ved -20 ° C.
      MERK: Volumet av delmengde vil variere basert på mye og vanligvis varierer 270-350 mL. Produsentens gir detaljer angående volumet av alikvoten er nødvendig for å oppnå en konsentrasjon på 1 x fortynning i 25 ml som beskrevet i trinn 2.1.
  2. hPSC Media lager Solutions
    1. Bruk av ultrarent vann som fortynningsmiddel, med mindre annet er angitt. Steriliser alle komponenter ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter. Lagre følgende som bulk løsninger ved 4 º C: sodium bicarbonate (75 mg / ml); sitronsyre (10 mM, pH = 3).
    2. Steriliser alle komponenter som bruker 0,2 mikrometer sprøyte filter og lagre hvert som alikvoter ved -20 º C: Rho kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 (10mM i DPBS, 100 ul alikvot); L-askorbinsyre 2-fosfat (64 mg / ml, 500 pl alikvot); natriumselenitt (70 mikrogram / ml, 100 ul alikvot); transferrin (50 mg / ml, 107 pl alikvot); fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2; 200 ng / mL i DPBS, 250 mL delmengde); transformerende vekstfaktor beta-1 (TGFβ1, 100 ng / mL i kald 10 mM sitronsyre, 10 pl alikvot).
  3. hPSC Media E8 Solution Sammensetning
    1. Forbered medier med alikvoter fremstilt i Trinn 1.2: DMEM / F12 (med L-Glutamin og HEPES, 500 ml), natriumbikarbonat (3,62 ml, slutt: 543 ug / ml), L-askorbinsyre 2-fosfat (500 ul; endelige : 64 ug / ml), natriumselenitt (100 pl, slutt: 140 ng / ml), transferrin (107 pl, slutt: 10,7 ug / ml), insulin (1 ml, slutt: 20 pg / ml), FGF2 (250 pl, slutt: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 pl, slutt: 2 ng / ml).
    2. Kombiner alle komponenter, filter sterilisere og oppbevar ved 4 º C i opptil 2 uker.
  4. hPSC Media E8 med ROCK Inhibitor
    1. Tilsett 15 mL ROCK inhibitor til 12 ml av E8 mediet fremstilt som ovenfor og bland godt. Påse at sluttkonsentrasjonen er 10 uM etter tilsetning av celler / medium i trinn 3.7.
  5. Stamløsninger av Wnt modulatorer
    1. Lagre følgende alikvoter ved -20 ° C. Chir 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM i DMSO, 15 pl prøve). IWR-1-(4-(1,3,3a, 4,7,7a-heksahydro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-kinolinyl-Benzamid; 10 mM i DMSO, 6 pl prøve).
  6. Differensiering Media
    1. Forbered differensiering media # 1 med RPMI 1640 (med L-glutamin) med 2% B27 minus insulin supplement.
    2. Forbered differensiering media # 2 med RPMI 1640 (med L-glutamin) med 2% B27 pluss insulin supplement og 2% FBS.
  7. Cell Wash Solution feller Cell Culture
    1. Bruk Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS), uten kalsium eller magnesium.
  8. Cell Wash Solution for flowcytometrisystemer
    1. Bruk fosfatbufret saltvann (PBS uten kalsium eller magnesium) med 1% FBS. Oppbevar ved 4 ° C.
  9. Cell vedlikeholdsløsninger for flowcytometrisystemer
    1. Bruk Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; uten kalsium eller magnesium) med 5% FBS. Oppbevar ved 4 ° C.
  10. Fiksering Løsninger for flowcytometrisystemer
    1. Bruk Cytofix buffer som fikseringsløsning for TNNI3 og IRX4 antistoffer.
    2. Bruk 4% paraformaldehyde i 1x PBS (lage fersk) som fikseringsløsning for TNNT2 og MLC2a antistoffer.
    3. Bruk 70% metanol / 30% aceton som fikserløsning for MLC2v antistoff.
    4. Lagre alle løsninger ved 4 ° C.
  11. Permeabilization Løsninger for flowcytometrisystemer
    1. Bruk Phosflow Perm Buffer III som permeabilization løsning feller TNNI3 og IRX4 antistoffer. Oppbevares ved romtemperatur (25 ° C).
    2. Bruk 0,2% Triton X-100 i 1 x PBS som permeabilization løsning for TNNT2, MLC2v, og MLC2a antistoffer. Oppbevar ved 4 ° C.
  12. Blokkering Solution
    1. Bruk 10% geit serum i 1x PBS. Lage fersk og oppbevar ved 4 º C inntil bruk.

2. Plate Coating

  1. Langsomt tine en aliquot av hESC kvalifisert matrise ved 4 ° C i 30 min, tilsett til 25 ml av kjølt DMEM / F12 og bland godt sterilisert i vevskultur hette umiddelbart før belegning 6-brønns plater.
  2. Tilsett 1 ml per brønn i en 6-brønns plate under sterilisert vevskultur hette (1 aliquot av hESC kvalifisert matrisen er tilstrekkelig til å belegge i fire 6-brønn plater).
  3. Tillat hESC kvalifisert matrise for å sette i 30 minutter ved romtemperatur under hetten. Aspirer overflødig hESC kvalifiserte matrise og tilsett 2 ml E8 media med ROCK inhibitor til hver brønn. Bruk platene umiddelbart, eller hvis desIRED, oppbevar ved 4 ° C umiddelbart etter plating i opptil 1 uke og romtemperatur i 30 min før bruk.

3. aging og vedlikehold av udifferensierte hPSCs i ett lag Kultur

  1. Oppretthold hPSCs i monolayer kultur i 6-brønners plater og utføre alle trinnene under et sterilt vev kultur hette.
  2. Bruk hPSC linjer som er godt etablert (> p20) og oppviser en homogen morfologi uten tilstedeværelse av celler med en neural, epithelial- eller fibroblast-lignende morfologi. Sørg celler spre robust, og i gjennomsnitt, passasje hver tredje dag ved 75% samløpet når sådd ved 0,75 x 10 6 per brønn.
  3. Passage hPSCs med dissosiasjon til celle-nivå minst 5x før start av differensiering for å sikre maksimal differensiering effektivitet. Til Passage hPSCs, aspirer E8 media og vaske cellene to ganger med 4 ml 1x DPBS (forvarmet til romtemperatur). Tilsett 1 ml av celle løsneling løsning (pre-oppvarmet til romtemperatur) til hver brønn og la brønnen uforstyrret i 3-7 min, inntil cellegrensene begynner å runde opp.
  4. Bruk en bomulls plugget glass pipette med pære å løsne cellene og overføre til en 15 ml konisk rør som inneholder 1 ml DMEM / F12 media (for å inaktivere cellen avløsning løsning).
  5. Fjern 10 pl alikvot av celleløsningen og blandes med 10 mL av trypanblått i et mikrosentrifugerør. Tell celler (f.eks automatisert eller manuell hemocytometer), mens resten av cellene er samlet ved sentrifugering ved 130 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Ved hjelp av denne protokollen, forventer 70-80% levedyktighet ved hjelp av en automatisert hemocytometer og fremover, base alle celle tall på totale celletall.
  6. Sug medier og cellepelleten suspenderes i DMEM / F12 til en sluttkonsentrasjon på 0,75 x 10 6 celler pr 500 ul.
  7. Tilsett 500 ul av cellesuspensjon til hver brønn i en 6-brønns plate hvor hver brønn contains 2 ml E8 media med ROCK hemmer, utarbeidet i trinn 2.3. Leaving plate på benkeplaten, forsiktig bevege seg i en front-til-rygg og side-til-side bevegelse for å jevnt spre celler over hele godt. Returnere celler til inkubator ved 5% CO 2, 37 ° C.
  8. Begynnelsen 24 timer etter passaging, erstatte media daglig med 2 ml / brønn E8 uten ROCK hemmer. Optimalisere seeding tetthet for å oppnå 100% samløpet før start av differensiering. Seed 0,75 x 10 6 celler / brønn i fire dager før start av differensiering, men optimalisere for hver cellelinje ved behov.

4. cardiomyocyte Induksjon av hPSCs ved selektiv modulering av Wnt Pathway

  1. Oppdater media (2 ml / brønn) daglig i løpet av dagene 0-7, og annenhver dag etter dag 8.
  2. På dag 0, begynner differensieringsprosessen ved å erstatte mediet med E8 differensiering media # 1. Tilsett 1,2 mL Chir (6 mM endelig) til hver brønn. Gjenta på dag 1.
  3. På dager 2-3, erstatte med fersk differenfor handling media # 1.
  4. På dag fire, erstatte med fersk differensiering media # 1. Tilsett 1 mL IWR-1 (5 mM endelig) til hver brønn. Gjenta på dag fem.
  5. På dag 6-7, erstatte med fersk differensiering media # 1.
  6. På dag 8, erstatte med fersk differensiering media # 2.
  7. Fortsett å erstatte med differensiering media # 2 annenhver dag for ønsket tid for kultur.
  8. Hvis ønskelig, passage kardiomyocytter ved hjelp av celle løsgjøring løsningen etter fremgangsmåten skissert i 3,3 til 3,6, men ved å benytte medier med differensiering media # 2. Under aging, distansere cardiomyocytes i små klynger av ~ 3-10 celler. Seed på ~ 6 x 10 5 celler per brønn ved hjelp hESC kvalifisert matrise belagt brønner og differensiering media # 2.

5. samling av celler flowcytometri

  1. Utfør alle gjenværende aspekter av trinn 5-9 på laboratoriebenken (dvs. ikke sterile).
  2. Aspirer vekstmedier og vaske cellene to ganger med 1x PBS.Tilsett 1 ml av celle løsgjøring løsning (pre-oppvarmet til romtemp) til hver brønn og la uforstyrret i 3-7 min, til cellegrensene begynner å runde opp. Bruk en bomulls plugget borsilikatglass disponibel 9 "pipette med pære å løsne cellene og overføre til en 15 ml konisk rør på is.
  3. Gjennom resten av protokollen, vedlikeholde cellene på is og utføre sentrifuger ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C.
  4. Samle cellene ved sentrifugering og aspirat løsning. Resuspender cellene i 10 ml cellevaskeløsning ved bruk av en 10 ml serologisk pipette ved gjentatt triturering å sikre celleklumper blir dispergert inn i enkeltceller. Tell cellene som i trinn 3.5, mens resten av cellene er samlet ved sentrifugering.
  5. Suspender cellene i cellevaskeløsning ta vare å helt disaggregert cellepellet og delmengde 1 x 10 6 celler per rund bunn rør. Samle cellene ved sentrifugering og aspirat løsning.

6. Fiksering ogPermeabilization av celler for Intracellulær Antigen Farging

  1. Tilsett 100 ul fikseringsløsning til cellepelleten. Legg løsning dråpevis med kontinuerlig forsiktig virvling og deretter satt på is i 15 min.
  2. Tilsett 3 ml cellevaskeløsning. Samle cellene ved sentrifugering og aspirat løsning.
  3. Tilsett 100 ul permeabilization løsning cellepelleten. Legg løsning dråpevis med kontinuerlig forsiktig virvling og deretter satt på is i 30 min. Bruk fiksering og permeabilization betingelser som beskrevet for hvert antistoff i tabell 1.
  4. Tilsett 3 ml cellevaskeløsning. Samle cellene ved sentrifugering og aspirat løsning. Gjenta for totalt to vasker etter permeabilization.
Primær antistoff (Clone) Immunogen / Epitope Anerkjent Istotype kontroll Mengde av primær antistoff per 1 x 10 6-celler i 100 ul Fikseringsløsning Permeabilization Solution Sekundært antistoff Mengde sekundært antistoff / 1 x 10 6 celler i 100 mL
For prosent positive målinger For Antigen kvantifisering
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (human) Mus IgG2b 1,0 mikrogram 3,0 mikrogram BD Cytofix BD Phosflow perm III Geit anti-mus IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Full lengde renset naturlig humant troponin T protein. Mus IgG1 1,0 mikrogram 2,0 mikrogram 4% PFAi 1% PBS 0,2% Triton X-100 i 1% PBS Geit anti-mus IgG1 - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Mus IgG2a 2,0 mikrogram 3,0 mikrogram 70% metanol / 30% aceton 0,2% Triton X-100 i 1% PBS Geit anti-mus IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) full lengde humant rekombinant protein av humant MYL7 produsert i E. coli Mus IgG1 0,5 mikrogram 3,0 mikrogram 4% PFA i 1% PBS 0,2% Triton X-100 i 1% PBS Geit anti-mus IgG1 - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		Kanin IgG 0,5 mikrogram 0,5 mikrogram BD Cytofix BD Phosflow perm III Geit anti-rabbit IgG-PE 600 ng

Tabell 1. antistoffkonsentrasjoner. Oppført er den primære antistoff, klone (hvis monoklonale), optimalisert konsentrasjoner og fiksering og permeabilization forhold for hver primær og sekundær antistoff brukes til flowcytometri analyser. Som antistoff arkiv konsentrasjoner kan variere mellom leverandører av samme klon, endelige konsentrasjoner av hvert antistoff per 1 x 10 6 celler i et fast analysevolum, fremfor fortynninger, er gitt. Den immunogen som brukes til å generere antistoffet eller epitopen gjenkjent av antistoff, som beskrevet av produsenten, er oppført, men ble ikke eksperimentelt verifisert here.

7. antistoffarging

  1. For hvert eksperiment, inkluderer en unstained kontroll per fiksering / permeabilization tilstand og den aktuelle isotype kontroll for hver primær antistoff brukes. Inkludere ikke-cardiomyocyte celletyper som negative kontroller (f.eks, pluripotente stamceller eller fibroblaster). Bruk isotype kontrollene ved samme konsentrasjon som tilsvarende primære antistoff (se tabell 1).
  2. Suspender cellene i 100 mL blokkering løsning ved hjelp av en P200 pipette til disaggregert celler. Sett prøvene på is i 25 minutter med forsiktig rocking.
  3. Uten å fjerne blokkering løsning, legger primær antistoff eller isotype kontroll per retningslinjene i Tabell 1. Inkuber 45 min på isen med milde rocking.
  4. Tilsett 3 ml cellevaskeløsning. Samle cellene ved sentrifugering og aspirat løsning. Gjenta til totalt to vaskinger etter primær antistoffmerking.
  5. Hvis en fluorofor-konjugert primære antistoff blir brukt, fortsett til 8.1. Når en ukonjugert primære antistoff (slik som for alle markører som er beskrevet her) som brukes, utføre merking med sekundært antistoff som er konjugert til en fluorofor som følger.
  6. Suspender cellene i 100 mL blokkering løsning ved hjelp av en P200 pipette til disaggregate celler.
  7. Legg sekundært antistoff per retningslinjene i Tabell 1. Inkuber 30 min på isen med milde rocking.
  8. Tilsett 3 ml cellevaskeløsning. Samle cellene ved sentrifugering og aspirat løsning. Gjenta til totalt to vaskinger etter sekundær antistoffmerking.

8. Utarbeidelse av celler for flowcytometrisystemer

  1. Suspender cellene i 400 mL celle vedlikehold løsning ved hjelp av en P1000 pipette til disaggregert celler.
  2. Forbered en celle sil cap på en rund bunn rør ved forvanning med 50 mL celle vedlikehold løsning. Sett røret på is. Bruk celle sil cap å hindre celleaggregater fra clogging strømningscytometeret.
  3. Overfør celleløsning til celle silen hetten og tillate cellesuspensjon til renne. Trykk bunnen av røret forsiktig på benken toppen etter behov, slik at cellene blir samlet inn i røret og satt tilbake på isen så raskt som mulig. Skyll silen med 250 mL celle vedlikehold sålution å sikre maksimal utvinning av celler.
  4. Vedlikeholde cellene på is og beskytte mot lys inntil analysert ved flowcytometri.

9. flowcytometrisystemer Analysis

Detaljerte oppkjøps innstillinger vil variere mellom instrumenter. Grunnleggende parametere for å vurdere for optimal datainnsamling er beskrevet nedenfor.

  1. For optimal drift stabilitet, sørge for at størrelsen av dysen 5-6x skrider diameteren av cellen som blir analysert.
    MERK: Dette kan variere mellom instrumenter, men er en viktig faktor både for analysatorer og velge riktig dyse størrelse for cellesortering. Den gjennomsnittlige diameter på dag 10 kardiomyocytter er 11 um (som strekker seg 8-14 mikrometer); således, en standard 150 mikrometer prøveinjeksjonsrøret på en analysator fungerer godt.
  2. Umiddelbart forut for dataanalyse, for å virvle hvert rør kort dispergere celleaggregatene.
  3. Optimalisere frem og side scatter spenning innstillinger for hver celletype basert påunstained kontroll for hver fiksering / permeabilization tilstand benyttet i forsøket slik at populasjoner av interesse er i skala og sentrert (figur 2A).
    1. Opprettholde disse innstillingene gjennom et enkelt eksperiment og være konsekvent fra eksperiment for å eksperimentere på samme instrument, som store endringer kan indikere potensielle problemer med strømningscytometeret eller prøveopparbeidelse.
  4. For hver fluorofor, analysere isotype kontroll og justere hensiktsmessig laser spenning for å bestemme den minimumsintensitet som kreves for å oppnå en fluorescens histogram som viser både venstre og høyre kant av topp. Opprettholde laser innstillinger for hver isotype kontroll når anskaffe data på tilsvarende antistoff-farget prøver.
    MERK: Signal drive ofte oppstår over tid på samme instrument. Det er kritisk for å justere laser innstillinger ved begynnelsen av hvert forsøk basert på den aktuelle isotype-kontroll.
  5. Samle minst10.000 hendelser. 50000 arrangement er foretrukket.
  6. For statistiske analyser, å gate live cellepopulasjon utelukke rusk (figur 2A). Bestemme prosent positive celler innenfor gated populasjonen basert på markeringen plassering som gjør at ≤2% bidraget fra isotype-kontroll, som vist i figur 2B, C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På dag 0, celler er 100% konfluent med kompakt morfologi og minimal celleavfall. På dagene 1-2, er det vanlig å observere betydelig celledød (40-50%), men festede celler vil beholde kompakt morfologi (figur 1A). I løpet av denne tiden, er media oransje og grumset. Pink media indikerer dreven celledød, og i dette tilfellet, bekreft med trypanblått og slutte hvis celledød overstiger 70%. Celler blir igjen i løpet av 3-4 dager og tetthet vil øke. I løpet av dagene 5-6, oppstår minimal celledød og tette patcher kan begynne å vises. Av dager 7-8, er en konfluent monoskikt oppnås med kompakt morfologi ispedd tette patcher. Celler begynner spontant kontrahering etter dag 8 og de første sammentrekningene vil ofte være synlige i den tette patcher. Ved dag 10, er mer robust sammentrekning observert og vil fortsette å spre seg i hele kulturen i påfølgende dager. Immunocytochemistry farging for α-actinin og TNNT2 showet sarcomere struktur(Figur 1A). Målt ved kvantitativ sanntid polymerase chain reaction (QRT-PCR), mRNA nivåer av referansemarkører mesoderm og cardiomyogenic engasjement visningstime profiler som forventet (figur 1B), med robust uttrykk for hjertemarkører Homeobox protein NKX-2.5 (NKX2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, og myosin-6 (MYH6). Svært lav til ikke-detekterbare nivåer av glatt muskulatur (Myosin tung kjetting 11, MYH11) og skjelettmuskel (myogenin, MYOG) markører er rutine. I samsvar med tidlig utvikling der uttrykket er observert i både hjerte-og skjelettmuskel før å være begrenset til skjelettmuskulatur i voksen 20,27,28, troponin isoformer TNNI1 og TNNI2 er robust oppdaget under dager 7-8.

Samsvar med andre rapporter, genererer dette in vitro differensieringsstrategi cardiomyocytes med karakteristikker av tidlig hjertestamfedre (avrundet morfologi, co-uttrykk for MLC2a, MLC2v) 19 30,32. I flowcytometri, vil de lyse scatter profiler variere mellom celletyper og endre betydelig mellom fiksering / permeabilization forhold (figur 2A). Under disse ulike celleforberedelsen forhold, flowcytometri analyse avslører isotype kontroller med enkle topper med et klart skille mellom isotype kontroll og antistoff (figur 2B). Pluripotente celler eller andre ikke-cardiomyocyte cellene er negative for markørene som brukes her.

Ved hjelp av denne differensiering og fargings protokollen, er det resulterende cellepopulasjon typisk 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v +, og 96% MLC2a + ved dag 10 av differensiering som målt ved strømningscytometri. 99% TNNT2 + celler er observert (figurene 2C, 2D), men som beskrevet ovenfor, er ikke unik TNNT2til kardiomyocytter i løpet av utvikling og dermed den påstand at cellene er 99% autentisk kardiomyocytter ved dag 10 er basert på TNNI3 protein. Det skal bemerkes at ved fortsatt dyrkning utover dag 10, vil proteinnivåer av strukturelle proteiner forblir høy selv om relative genekspresjon nivåer vil reduksjon i forhold til topp-uttrykk som overvåkes av QRT-PCR, i overensstemmelse med proteinstabilitet og omsetningshastigheter på 3,2 og 3,5 dager, henholdsvis for TNNI og TNNT 33. Et eksempel på denne observasjon er vist for TNNT2 (peak mRNA ekspresjon ved dag 11 (figur 1B), robuste proteinnivåer ved dag 20 + (figur 2E).

Figur 1
Figur 1. Samlet skjematisk av cardiomyocyte differensiering fra hPSCs og representative data. (A) Skjematisk av cardiomyocyte differentiatio n protokollen annotert med tilsvarende stadium av avstamning og / eller celle skjebne engasjement. Representative bilder fasekontrast av cellene ved store trinn i differensieringen prosessen. Scale bar = 10 mikrometer. Helt til høyre = immunocytochemistry bilde av α-actinin (grønn) kledde med TNNT2 (rød) og kjerner (blå). (B) QRT-PCR-analyse (for probe sett, se Materialer tabell) av 18 referanse mesoderm og hjertemarkører utvikling under de første 17 dager med differensiering. Alle data er et gjennomsnitt av tre biologiske replikater hver analysert i tre eksemplarer, hvor feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet, og er normalisert til aktin (ACTB). Meldings nivåer for alle tidspunkter står i forhold til den første dagen av differensiering der Ct verdier er påvisbar (dvs. Ct <35). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

t "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 2
Figur 2. Karakterisering av cardiomyocytes av flowcytometri og elektrofysiologi. (A) lysspredning profiler av dag 10 hiPSC-avledet cardiomyocytes under ulike fiksering og permeabilization forhold. 50.000 hendelser ble samlet inn og gated befolkningen (dvs. unntatt rusk) som brukes for statistiske analyser er vist i rødt. (B) Histograms av IRX4 på dag 10 av differensiering ved hjelp av tre forskjellige fiksering / permeabilization forhold, illustrerer forskjeller i farging effektivitet blant metodene. Innfellinger viser forskjeller i farging av IRX4 på hiPSCs bruker hver tilstand. Disse data illustrere hvorfor metanol / aceton unngås for IRX4 grunn av lav, men synlig, flekker på hiPSCs. (C) Histograms av TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a på dag 10 av differensiert asjon ved hjelp av optimaliserte fargings forhold for maksimal prosent positive celler er beskrevet i Tabell 1. (D) Histograms av TNNT2 fra antistoff titrering eksperimenter, illustrerer at 0,5 mikrogram er den minste beløpet som kreves for å måle 99% TNNT2 + celler, men at 2 mikrogram er metningspunktet kreves for kvantifisering. Bare en enkelt isotype-kontroll er vist, men titrering eksperimenter er beregnet basert på en sammenligning av hvert antistoff til dets korresponderende titrering av isotype-kontroll. (E) Kvantitering av TNNT2 protein på kardiomyocytter på dagene 0-24 av differensiering, representert som median fluorescensintensitet forskjell mellom antistoff og isotype-kontroll for hvert tidspunkt. (F) Handling potensialet registrert fra en enkelt spontant kontrahering ventrikulær lignende cardiomyocyte på dag 46 av differensiering ved bruk av hel-celle-strømtang konfigurasjonen av patch clamp teknikk.es / Ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

Cellular Biology menneskeskapte pluripotent stamcelle flowcytometri regissert differensiering cardiomyocyte IRX4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
High Efficiency Differensiering of Human Pluripotent stamceller til Cardiomyocytes og karakterisering med flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter