Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ligetil Assay til kvantificering af Social undgåelse i Published: December 13, 2014 doi: 10.3791/52011
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

Introduction

Målet med denne fremgangsmåde er let at kvantificere en ny aspekt af simpel social adfærd i Drosophila melanogaster, uafhængig af frieri og aggression.

Sociale interaktioner er afgørende for en korrekt udvikling og sundhed for personer i et samfund, samt funktionaliteten af ​​en social gruppe som helhed. Den høje kompleksitet af disse interaktioner nødvendiggør store stikprøvestørrelser og et system, der giver mulighed for en forenkling af den adfærd, som de genetiske og neurale grundlag for social adfærd stadig dårligt forstået. Drosophila melanogaster er en kraftfuld genetisk model, der kan bruges til at identificere genetiske og neurale grundlag for sociale interaktioner. Faktisk D. melanogaster har et repertoire af komplekse sociale adfærd og nogle direkte målinger af socialisering er allerede blevet gjort 1-7. Men de fleste af disse bestræbelser har været fokuseret på relativt komplekse sociale adfærd, såsom aggressivetende interaktioner 3,6, forskellige aspekter af frieri 3,8-12, og hvordan social oplevelse påvirker andre adfærd, såsom læring, eller døgnrytme 13-17. Desuden er mange af disse assays er afhængige af at analysere komplekse interaktion mønstre af grupper af fluer ved hjælp af video tracking og computer software til at analysere den resulterende overflod af data. Sådanne analyser er uvurderlig, og føre til vigtige nye indsigter som dynamikken i fly-flyve interaktioner i grupper 7. En begrænsning er dog den manglende adgang til disse assays til samfundet som helhed, og den begrænsede viden om de mekanismer, der ligger til grund for anerkendelsen af ​​andre. Med andre ord er grundlaget for emission af et signal ved en individuel og anerkendelse af en anden stadig dårligt forstået 18.

Derimod fluer udviser også en simpel adfærd, social undgåelse, hvor enkeltpersoner bevæge sig væk fra et signal, der udsendes af stressede fluer: D. Melanogaster Stress lugtstof eller DSO 19. I et high-throughput assay, kan denne adfærd kvantificeres som undgåelse af en stress-signal, der udsendes af andre fluer eller social undgåelse 19. Fluer anbringes i en T-labyrint-apparatet og givet valg at undgå et hætteglas indeholdende DSO. Anvendelse af dette assay blev CO 2 vist sig at være en komponent af DSO, og en del af neurale kredsløb er nødvendige for at svare til CO 2 blev dissekeret 19.

Den sociale undgåelse analysen præsenteres her ligner begrebsmæssigt til de simple adfærdsmæssige analyser udviklet i Seymour Benzer laboratorium, der gjorde det muligt for generationer af forskere til at dissekere komplekse adfærd 20. Analyse af social unddragelse kan gennemføres på en omkostningseffektiv måde ved hjælp af T-labyrint assay, der giver mulighed for mere udbredt undersøgelse af social adfærd. For eksempel ved hjælp af denne analyse, vi for nylig vist, at forskellige genetiske risici for autisme har kontrasterende virkninger i social Behavior assays. Mutanter for en kandidat gen for autisme - neurobeachin 21,22 - nuværende mangler både i sociale rum (beskrevet andetsteds 23) og social undgåelse 24. Unormal dopaminerge signalering foreslås også at spille en rolle i ætiologien af autisme hos mennesker 25,26. I modsætning til de resultater, der er opnået med neurobeachin, fandt vi, at social undgåelse præstation var påvirket af øget eller nedsat niveau af Drosophila vesikulær monoamintransporterfunktion (VMAT) i dopaminerge celler, selv om det sociale rum var direkte korreleret til disse niveauer af VMAT 27. De kontrasterende resultater opnået med neurobeachin og VMAT understreger muligheden for at identificere forskellige former for asocial adfærd, og dermed de forskellige underliggende neurale kredsløbssystemer modulerer svaret til andre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udstyr og reagenser Oprettet In-house (se listen over materiale for andre)

  1. Forbered en Drosophila kold anæstesi apparater til at udføre flyve arbejde.
    1. Skær en porøs polyethylen ark til at dække en lille plastkasse (12,7 cm lang, 10,2 cm bred), typisk topdækslet af pipettespidser boks (12,7 cm lang, 10,2 cm bred, 3,8 cm dyb).
    2. Fyld kasse med knust is, dække med det porøse polyethylenark.
  2. Forbered en T-labyrint apparat; tilpasse tidligere beskrevet i detaljer 28-31 apparat.
  3. Forbered en flue sug som beskrevet 32.
  4. Forbered en phototaxis svar apparat til at fortrænge fluer ind og ud af test hætteglas uden stress:
    1. Brug en modstrøm apparat, som beskrevet af 29,33.

BEMÆRK: T-labyrint kan også anvendes til andre formål, som beskrevet af 28.

  1. Sikre homogeneous lysforhold: udføre eksperimentet på en bænk dækket med en hvid bænk dække, og foran en hvid bord.
    BEMÆRK: Til disse eksperimenter fluen stammer blev anvendt, var bananflue vilde-typer: Canton-S, Oregon og Samarkand flyver fra vores laboratorie lagre 34; Elwood fluer blev indsamlet i efteråret 2011 i den Elwood nabolaget i Huntington, på Long Island, New York, USA.

2. Forberedelse af Fluer før forsøget

1-2 dage før du udfører forsøget:

  1. Vedligehold fluer på standard cornmeal-agar-melasse-gær medium ved 25 ° C på en 12 timers lys / mørke cyklus.
  2. Saml responder fluer under kolde anæstesi 1-2 dage før udførelse af eksperimentet
    1. Overfør fluerne fra flaskerne, hvor de er blevet rejst i 50 ml Falcon-rør ved hjælp af en tragt.
    2. Placer falk rør med fluerne i is-niveau, i enisoleret isspand.
    3. Placer kolde anæstesi apparater med knust is ved -4 ° C til nedkøling.
    4. Vent 5 min for fluerne at indtaste en chill koma.
    5. Overfør fluer på porøse polyethylenark af den kolde anæstesi apparatet.
    6. Saml responder fluer på den kolde anæstesi apparatet. Ved stuetemperatur under et stereomikroskop, adskille 3-7 dage gammel mand fra kvindelige fluer og opretholde disse fluer i grupper af 40.
  3. Saml emitter fluer 1-2 dage før udførelse af eksperimentet.
    1. Forsigtigt indsamle Canton-S blandet sex flyver fra deres flasker, ved hjælp af en mund sug, kontrol for deres nummer.
    2. Bevar disse fluer i gruppen af ​​60-100, da de vil være de udledere.
    3. Forbered så mange prøver af udledere som datapunkter behov.
  4. Vent mindst en nat af restitution efter indsamlingen af ​​respondenter og udledere, at minimere enhver confounding effekt af den kolde anæstesiog mund aspirator samling på adfærd.
  5. Åbn posen af ​​test hætteglas, for at muliggøre uaktuelle plast ildelugtende luft i posen at blive erstattet af frisk luft, mindst 1 dag før forsøget.

2 timer, før du udfører forsøget:

  1. Sørg for, at temperaturen i det rum, hvor eksperimentet udføres er omkring 23-25 ​​° C, med endnu lys og fugtighed over 30%.
  2. Overfør responders og udledere bananfluer i friske fødevarer hætteglas at sikre, at disse fluer ikke udsultes.
  3. Lad bananfluer tilpasse sig miljøet i 2 timer, på bænken, hvor forsøget udføres.

3. Udførelse af Social Avoidance Experiment

  1. Udfør hvert forsøg på samme tidspunkt af dagen, i et område på 3-4 timer om eftermiddagen mellem zeitgeber tid ZT5 og ZT9.
  2. Placer T-labyrint på omkuld pad, og stram skruen klippet så than elevator er stabil.
  3. Overfør responder fluer i en frisk prøve hætteglas. Snap dette hætteglas indeholdende respondercellerne fluer på den øverste del af T-labyrint.
  4. Slant T-labyrint-apparatet, og tryk det på dunkende måtten, så bananfluer falde i elevatoren.
  5. Flyt den øverste del af elevatoren ned, så fluer er mellem øverste og nederste del af T-labyrint, men være opmærksom på at holde elevatoren over valget - for at forhindre fluer undslippe.
  6. Opnå hætteglas med DSO (se afsnit 5 for at generere DSO-fri hætteglas, der tidligere var besat af fluer).
    1. Mens responder fluer tilpasse sig disse nye forhold, placere emitter fluer i en test hætteglas.
    2. Læg et stykke bomuld til at lukke hætteglasset så bananfluer ikke undslippe.
    3. Mekanisk agitere denne hætteglasset på en mini-vortex som følger: vortex i 15 sekunder, fjerne hætteglasset fra vortex i 5 sek. Gentag 3 gange for i alt 55 sek.
    4. Remove emitter fluer ud af den friske hætteglas - ved at overføre i en fødevare hætteglas - og hurtigt placere denne DSO fyldt hætteglas til en af ​​de to sider af T-labyrint-apparatet.
    5. Suppleant siden af ​​placering for DSO fyldt hætteglasset i hver ny kørsel.
  7. Placer en frisk prøve hætteglas på den anden side af T-labyrint.
  8. Bring elevatoren helt ned, så de bananfluer kan vælge mellem friske test hætteglasset og testen hætteglas med DSO, og starte timeren.
  9. Lad fluerne vælge mellem friske hætteglas og DSO hætteglasset, for 1 min, medmindre andet er angivet.
  10. Efter 1 min, bevæge elevatoren op til adskille fluer i den friske hætteglas, DSO hætteglas, og de fast i elevatoren.
  11. Tæl antallet af fluer i hvert hætteglas, og i elevatoren.
  12. Gentag dette for hver genotype / tilstand.

4. Analyse af sociale undgåelse data

  1. Tæl antallet af bananfluer i hvert hætteglas for hver Genotype, og overføre data til et regneark.
  2. Brug et regnearksprogram, beregne Performance Index (PI) for hver genotype ved at trække antallet af fluer i DSO hætteglasset fra antallet af fluer i DSO-fri hætteglas og derefter dividere med det samlede antal fluer.
  3. Sammenlign PIS ": anvendelse af statistisk analyse software til analyse af resultaterne.
    1. Ideelt, forberede 2-3 interne gentagelser for hvert forsøg, og 3 uafhængige gentagelser, udført på forskellige dage, med forskellige flasker eller krydser 30.
    2. Brug normalfordelingsmetoden statistiske test, da data følger en normalfordeling.
    3. Ved test af en virkning (dvs. densitet - figur 2) at anvende en én-vejs ANOVA med post-test for multipel sammenligning (søjle for søjle), eller en simpel t-test til at sammenligne hvert resultat med en kontrol.
    4. Når gruppens eksperimenter udføres, teste begge betingelser og køn (tomme hætteglas, understregede end un-stressede fluer; og køn virkning - figur 1), ved hjælp af en tovejs ANOVA.

5. Generer Hætteglas tidligere lå tryksvage Fluer - Udfør stedet for 3,5-3,6

  1. Brug phototaxis at fremstille hætteglas besat af fluer, der ikke er blevet stressede, som en kontrol.
  2. Overfør fluerne i en test hætteglas, og klik den ind i det modstrømsapparat, med friske tomme hætteglas i den modsatte position.
  3. Læg apparatet vandret med den distale hætteglas direkte foran en 15 W fluorescerende kølig-hvidt lys, og dække med et sort klæde.
  4. Lad fluerne forsigtigt bevæger sig i den friske hætteglas. Dette kan tage flere minutter. Når de fleste af fluerne går mod lyset i den distale hætteglas, starte timeren i 1 min.
  5. Fjern forsigtigt det sorte klæde, skifte placeringen af ​​lys, komme med den sorte klæde, og lad fluerne til at forlade testen hætteglasset.
  6. På det tidspunkt, jegnitiate valget eksperiment som i punkt 3.2 til 3,5. Spring 3.6 og 3.7.
  7. Flyt skyderen af ​​apparatet, for at adskille fluer, der forlades prøvevialen fra den anden side.
  8. Brug det forlades test hætteglasset i den T-labyrint med det samme for valg eksperiment, som i 3.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den sociale unddragelse analysen er en robust test kvantificerer evne Drosophila melanogaster at anerkende en stress-signal (DSO), der udsendes af andre fluer, og dermed vurdere et aspekt af sociale interaktioner. Analysen udføres ved hjælp af et apparat, der almindeligvis anvendes i forskellige adfærd assays kendt som en T-labyrint, der præsentere fluer med et valg mellem to forskellige muligheder - til venstre eller højre 19,28-31. I dette tilfælde er effektiviteten ved hvilken fluer undgå DSO kvantificeres ved at beregne og sammenligne deres ydeevne Index (PI). En PI på nul indikerer en 50-50 fordeling eller ingen unddragelse, mens en PI på 100 angiver, at alle fluerne undgået DSO. Og en PI på -100 indikerer, at alle fluerne gik inde i DSO hætteglasset.

Fluerne er præsenteret med et hætteglas indeholdende DSO udsendes af mekanisk omrørte fluer, og en frisk (DSO-fri) hætteglas. Repræsentative resultater præsenteres her understrege strength af dette assay, samt nogle kendte forhold er nødvendige for at opnå de bedste resultater.

Undgåelse af DSO er ikke sex specifik men afhænger af fluer bliver stresset. Den køn responder fluer har ingen indflydelse på deres undgåelse af DSO (figur 1). , Det er imidlertid ikke tilstrækkeligt for fluer har besat prøvevialen at fremkalde en undgåelse af, at hætteglasset skal fluer er blevet fremhævet - i dette tilfælde omrøres mekanisk (figur 1). Hvis der ikke fluer havde besat testen hætteglasset, eller hvis fluerne har indtastet og afsluttet hætteglasset uden stress ved hjælp phototaxis, de respondenter fremkalde ingen præference som tidligere rapporteret 19.

Selvom figur 1 gengiver kendte resultater, er det også et eksempel på den form for data med sub-optimale betingelser. Med kun 2 til 5 interne gentagelser, og ingen uafhængige forsøg repræsenterer fejlsøjlerne området. Men der er en væsentlig forskelligelen mellem hætteglas tidligere besat af stressede fluer og ikke-stressede fluer eller tom, som tidligere rapporteret 19. I den forbindelse fluerne stadig vise en stærk PI af unddragelse. Dette understreger robustheden af ​​analysen. Desuden PI for valget mellem to friske hætteglas er negativ (forskellig fra 0, for hunner p <0,05, og samles sex p <0,01). Dette indikerer en præference for den ene side af T-labyrint, eller en bias på grund af en lille stikprøve. Denne begrænsning kan modvirkes ved at skifte den side, hvor testen hætteglasset er placeret på T-labyrint i de interne gentagelser, som gøres i de efterfølgende eksperimenter præsenteret.

Trods den manglende sex effekt i svar på DSO, respondenter adskilt af køn til at forhindre mulige forstyrrende virkninger. For eksempel i tilfælde af mutationer, der kan have sex-specifikke virkninger, såsom dem, der påvirker gener involveret i olfaktoriske signalering 36. Følgende representati ve resultater fokus på mandlige respondenter, og blandede sex udledere.

Undgåelse af DSO er uafhængig af antallet af responder testede fluer.

Tidligere forsøg 19 har brugt en standard på 40 Canton-S fluer i at teste sociale unddragelse, som viste en høj PI, hvilket indikerer, at de fleste fluer foretrak den friske DSO-fri hætteglas. For at teste virkningen af gruppens størrelse på PI af respondenter blev en række på 10-80 fluer analyseret, som det ses i figur 2. Et minimum af to uafhængige forsøg og tre interne gentagelser pr forsøg blev udført. En t-test viste ingen statistisk signifikans, når man sammenligner PI i hver af de forskellige antal responderende fluer til indekset for kontrollen (fyrre responder fluer) performance. Således er antallet af responderende fluer har ingen effekt på PI af DSO unddragelse og virkningen at mutationer har på undgåelse kan testes selvom mutanter findes i mindre mængder.

ent "> Højere antal udledere flyver fører til højere undgåelse af DSO.

For at bestemme, i hvilket omfang antallet af emitter fluer påvirket DSO og undgåelse, testede vi også virkningen af ​​mængden af ​​stressede fluer. I tidligere forsøg 19 og denne protokol, har brugt en standard på 70 Canton-S fluer. Vi har nu testet 10-160 emitter fluer (Figur 3). Udførelsen af ​​unddragelse er direkte relateret til antallet af udledere, selv om der ikke er nogen stigning i unddragelse med mere end 80 udledere. Interessant nok blev en betydelig undgåelse stadig detekteret med kun 10 understregede fluer. Igen vil dette give teste emission kapaciteter par fluer ad gangen.

Genetisk baggrund påvirker DSO undgåelse ydeevne.

Drosophila melanogaster er en stærk model organisme for genetiske studier. Således var det vigtigt at bestemme, om assayet kan anvendes til at discriminate forskellige genetiske baggrunde. Svaret fra fire forskellige vilde typer blev målt (Canton-S, Oregon-R, Samarkand og Elwood) med hensyn til deres undgåelse af DSO udsendes af Canton-S (figur 4). Canton-S og Elwood har en højere PI i forhold til Oregon og Samarkand (p <0,05). Disse resultater viser, at der er en genetisk komponent ligger til grund for undgåelse af DSO, og at denne analyse har beføjelse til at udføre en undersøgelse af denne genetiske indflydelse.

Længden af ​​valg tid påvirke ydeevnen.

Sættet af repræsentative data vist i figur 1, 2, 3 og 4 illustrerer også virkningen af tid givet til responders at afgøre, hvilke hætteglas de undgå. Når Canton-S-respondenter får 30 til 45 sek til at vælge deres foretrukne hætteglas, de typisk nå forestillinger omkring PI = 55 (figur 2, henholdsvis PI mænd= 57 ± 2; og 52 ± 11). Når de får 60 sek, deres præstationer er højere, som det ses i figur 4 (PI = 77 ± 6,5).

Figur 1
Figur 1. Undgåelse af DSO er ikke sex specifik men afhænger af fluer bliver understreget. Bar grafer repræsenterer den gennemsnitlige ± området PI af undgåelse af et hætteglas stress lugt efterladt af ophidsede fluer (DSO). Hanner (i rødt) og kvinder (orange) blev testet sammen (brun) og derefter talt efter forsøget. Fluerne udført på samme måde, uanset deres køn (to-vejs ANOVA). Men de kun undgået en DSO fyldt hætteglas, hvor fluer havde været tidligere understreget (mekanisk ophidset), og ikke et hætteglas, hvor fluer ikke var blevet understreget (ind og ud af hætteglasset ved phototaxis, p <0,05, Tukeys multipel sammenligning post- test) eller frisk hætteglas (p <0,001, Tukey multiple sammenligning post-test). IDesuden var der ingen statistiske forskelle mellem friske hætteglas og ikke-stressede fluer betingelser, på trods af en forspænding frisk hætteglas eksperiment - n = 2-5 replikater med 40 blandet køn flyver hver med 45 sek valg tid (n = 3 for frisk hætteglas, n = 2 for hætteglas med ikke-stress-filer, n = 5 for hætteglas med stressede fluer).

Figur 2
Figur 2. Undgåelse af DSO er uafhængig af antallet af testede fluer. Repræsentant data viser, at antallet af Canton-S responderende fluer i T-labyrinten har ingen effekt på social undgåelse af DSO. Responder fluer fik 30 sek at vælge mellem en frisk hætteglas og et hætteglas indeholdende DSO (n = 2-6 interne replikater pr forsøg, 1-2 forsøg, minimum 5 datapunkter pr tilstand, udgør søjlediagrammer gennemsnittet ± SEM)

Figur 3

Figur 4
Figur 4. Valg tid og genetiske baggrund af bananfluer påvirke respons på DSO. Canton-S og Elwood genotyper vise en stærkere undgåelse af DSO end Oregon og Samarkand (p <0,05 * t-test sammenligne Canton-S). Responder fluer fik 1 min. at vælge mellem en frisk hætteglas og et hætteglas indeholdende DSO (n = 4-5 interne replikater pr forsøg, 2 uafhængige forsøg, repræsenterer søjlediagrammer gennemsnittet ± SEM)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en detaljeret procedure for den sociale undgåelse analysen. Canton-S vil kun undgå et hætteglas, hvor fluer har tidligere været mekanisk stresset, og at køn og antal respondenter påvirker ikke, at social undgåelse ydeevne. Men genetiske baggrund af respondenter har en stor indflydelse.

Følgende er flere kritiske trin til at udføre dette eksperiment med succes: 1) altid overføre fluer 2 timer før forsøget, og sørg for ikke at forstyrre deres miljø; 2) udfører eksperimentet altid på samme tidspunkt af dagen, ideelt mellem zeitgeber tid ZT5 (timer efter indtræden af ​​lys) og ZT9 at reducere variationen i tilknytning til døgnrytme og dermed mulig variation i bevægelseskomponenter og aktivitetsniveau; 3) Bemærk de temperatur- og fugtighedsforhold, når du udfører eksperimentet; en temperatur på omkring 23-25 ​​° C og en luftfugtighed på over 30% er bedst; 4) Sørg for ikke at disturb T-labyrint apparat under fluer afgørelse tid; 5) Sørg for at lufte ud de friske hætteglas mindst 24 timer, før du bruger dem; og 6) under forsøget, er det vigtigt at altid ændre placeringen af ​​prøvevialen i T-labyrint-apparatet for at undgå præference til den ene side af det T-labyrint. Selvom yderligere tests skal gøres for at bekræfte dette, empirisk ser det ud til, at DSO undslipper "stress" hætteglasset i mindre end 5 min. I modsætning hertil forekommer det, at fluer er i stand til at udsende DSO op til 1 time efter at være blevet stresset.

Der er flere overvejelser, der skal tages i betragtning i protokollen. Sammenhængen mellem alder fluen og sociale unddragelse er i øjeblikket ukendt. Det anbefales derfor, at udføre forsøget med ikke mere end to uger gamle fluer ved 25 ° C, som adfærdsændringer i forbindelse med aldring ikke synes før denne alder 37. Parrede fluer (opstaldet blandede køn) indsamles til eksperimentet somDet er ukendt, hvordan DSO emission påvirkes af parring status fluerne. Selv om den adfærdsmæssige produktion af DSO undgåelse ikke påvirkes af køn, kan den underliggende hjerne kredsløb være seksuelt dimorfe, og det er tilrådeligt ikke at blande mandlige og kvindelige fluer. Endelig, en reduktion i antallet af emitter flyver fører til et fald i unddragelse, sandsynligvis knyttet til et fald i total DSO udledt. Men nok DSO er stadig til stede med kun 10 fluer, hvilket fører til et robust og reproducerbar unddragelse.

Reduktion af afgørelse tidspunktet for responder fluer fra 60 sek til 30 sek, resulterer også i en reduktion af PI for Canton-S fluer. Dette kan bruges som et redskab til at diskriminere for betingelser eller mutationer, hvor flyver klarer sig bedre end Canton-S. Således i sin nuværende tilstand, den sociale undgåelse analysen kan bruges som en adfærdsmæssig paradigme for at teste effekten af ​​gener og miljø på DSO unddragelse. Efter mastering teknikken, kan tages fremtidige skridtat indarbejde den ideelle beslutning tid for DSO unddragelse og det nøjagtige antal emitter fluer, der skal bruges til at få den sociale undgåelse assay til at fungere optimalt.

En begrænsning, der ville opstå i afprøvning mutanter kan forekomme, hvis respondenter har dårlig bevægelse. Eksperimentelt bestemme en længere valg tid for disse mutanter kan imødegå sådanne dårlig bevægelse. Ligeledes flyver med sensoriske mangler, som ville forhindre detektering af CO 2 - en vigtig del af DSO eller anden ukendt del af DSO ville ikke være i stand til at blive testet i dette assay.

Der er i øjeblikket ingen anden assay tillader kvantificering af dette svar. Selv om det blev vist, at CO 2 er en bestanddel af DSO 19 andre komponenter af signalet samt neurotransmittere involveret i valg at undgå andre stressede individer er endnu ikke blevet bestemt. Ligeledes den mekanisme, der driver flies til at udsende DSO er ikke kendt. Denne analyse kan i øjeblikket bruges som en ekstra bænk top diagnostisk assay til bestemmelse af sociale og generelle adfærdsmæssige profil af en mutant eller miljø behandling. For eksempel kan man sammenligne og kontrastere kvantificering af sociale rum, dvs afstanden til den nærmeste nabo 23, til den sociale undgåelse af stressede fluer. Begge adfærd kræver reagerer på tilstedeværelsen af ​​andre personer, og gøre beslutningen om at komme tæt på eller for at undgå dem. Disse er meget enkle, men effektive måder at dissekere hjernen kredsløb og neurotransmittere involveret. Disse adfærdsmæssige paradigmer har også et enormt potentiale til at blive anvendt til screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Porous Polyethylene, 12" x 12" Sheet Flystuff - Genesee 46-100 http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
Porous Plastic sheet for the cold anesthesia box
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
Sharpie pens
Adhesive Tape
Mini vortex Fisher 14-955-151  http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
For mechanical agitation of the flies - any vortex would work.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon test tube; round bottom; disposable; no closure, 14 ml; 17 x 100 mm Fisher 14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
These snap in place in the in-house made T-maze and counter-current apparatus (see text)
cotton balls to close the vials after the experiment.
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
white bench cover
pounding pad any mouse pad works.
large black cloth to cover the counter-current apparatus in phototaxis response.
cool-white light  Home Depot 1000516563 http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
any similar linear light with fluorescent light bulb cool-white at 13-15 W would work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. TrackFly: virtual reality for a behavioral system analysis in free-flying fruit flies. J Neurosci Methods. 171, 110-117 (2008).
  2. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 24, 1096 (2009).
  3. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
  4. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
  5. Simon, J. C., Dickinson, M. H. A new chamber for studying the behavior of Drosophila. PLoS One. 5, 8793 (2010).
  6. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. Inaugural Article: A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness. in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5657-5663 (2008).
  7. Schneider, J., Dickinson, M. H., Levine, J. D. Social structures depend on innate determinants and chemosensory processing in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2, 17174-17179 (2012).
  8. Miyamoto, T., Amrein, H. Suppression of male courtship by a Drosophila pheromone receptor. Nat Neurosci. 11, 874-876 (2008).
  9. Villella, A., Hall, J. C., Jeffrey, C. H. Chapter 3 Neurogenetics of Courtship and Mating in Drosophila. Advances in Genetics. 62, 67-184 (2008).
  10. Ejima, A., Griffith, L. C. Courtship Initiation Is Stimulated by Acoustic Signals in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 3, 3246 (2008).
  11. Mery, F., et al. Public Versus Personal Information for Mate Copying in an Invertebrate. Current Biology. 19, 730-734 (2009).
  12. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
  13. Billeter, J. -C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
  14. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr Biol. 18, 1373-1383 (2008).
  15. Kent, C., Azanchi, R., Smith, B., Formosa, A., Levine, J. D. Social context influences chemical communication in D. melanogaster males. Curr Biol. 18, 1384-1389 (2008).
  16. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
  17. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking Experience Affects Sleep Need in Drosophila. Science. 313, 1775-1781 (2006).
  18. Billeter, J. -C., Levine, J. D. Who is he and what is he to you? Recognition in Drosophila melanogaster. Curr. Opin. Neurobiol. 23, 17-23 (2013).
  19. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  20. Bonini, N. A Tribute to Seymour Benzer 1921-2007. 180, 1265-1273 (2008).
  21. Castermans, D., et al. The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a patient with idiopathic autism. Journal of Medical Genetics. 40, 352-356 (2003).
  22. Medrihan, L., et al. Neurobeachin, a protein implicated in membrane protein traffic and autism, is required for the formation and functioning of central synapses. J Physiol. 587, 5095-5106 (2009).
  23. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
  24. Venkatesh, T., et al. Cold Spring Harbor Meeting: From Molecules to Circuit Behavior. , Cold Spring Harbor Laboratories. Cold Spring Harbor, NY. (2013).
  25. Hamilton, P. J., et al. De novo mutation in the dopamine transporter gene associates dopamine dysfunction with autism spectrum disorder. Mol Psychiatry. 18, 1315-1323 (2013).
  26. Gadow, K. D., et al. Association of dopamine gene variants, emotion dysregulation and ADHD in autism spectrum disorder. Research in Developmental Disabilities. 35, 1658-1665 (2014).
  27. Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, , (2014).
  28. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J Vis Exp. , 2504 (2011).
  29. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A Practical Approach. Roberts, D. B. 1, IRL. New York, NY. 265-317 (1998).
  30. Tully, T., Quinn, W. G. Classical-conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol [A]. 157, 263-277 (1985).
  31. Krashes, M. J., Waddell, S. Drosophila Aversive Olfactory Conditioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (2011).
  32. Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology, A Laboratory Manual. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. 475-481 (2010).
  33. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
  34. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
  35. Vaux, D. L. Research methods: Know when your numbers are significant. Nature. 492, 180-181 (2012).
  36. Stowers, L., Logan, D. W. Sexual dimorphism in olfactory signaling. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 770-775 (2010).
  37. Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster with age. Mechanisms of Ageing and Development. , 127-647 (2006).

Tags

Neuroscience social adfærd social undgåelse, Stress lugtstof - DSO T-labyrint apparat neurogenetics
Ligetil Assay til kvantificering af Social undgåelse i<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, R. W., Nurilov, M.,… More

Fernandez, R. W., Nurilov, M., Feliciano, O., McDonald, I. S., Simon, A. F. Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (94), e52011, doi:10.3791/52011 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter