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Neuroscience

社会回避での定量化のための簡単​​なアッセイ Published: December 13, 2014 doi: 10.3791/52011

Introduction

この方法の目的は、容易に求愛と侵略から独立したキイロショウジョウバエにおける単純な社会的行動の新たな側面を定量化することである。

社会的相互作用は、社会の中の個人の適切な発達と健康に重要であるだけでなく、全体としての社会集団の機能性。これらの相互作用の複雑性の高い大規模なサンプルサイズおよび社会的行動の遺伝的及び神経塩基はまだよく理解されて動作の簡略化を可能にするシステムが必要となる。 キイロショウジョウバエの遺伝子を同定するために使用できる強力な遺伝モデルである社会的相互作用の神経基盤。実際、D.キイロは、複雑な社会的行動のレパートリーを持ち、社会のいくつかの直接測定は、すでに1-7行われている。しかしながら、これらの努力のほとんどは、aggresのような比較的複雑な社会的行動に焦点を当ててきたSIVEの相互作用3,6、求愛3,8-12のさまざまな側面、そしてどのように社会的な経験は、学習、または概日リズム13-17のような他の行動に影響を与えます。また、これらのアッセイの多くは、結果として生じるデータの存在量を分析するためにビデオトラッキングとコンピュータソフトウェアを使用して、ハエの群の複雑な相互作用のパターンを分析に依存する。このような分析は非常に貴重であり、そのようなグループ7のフライフライ相互作用の動的などの重要な新しい洞察をもたらす。一つの制限は、しかしながら、一般社会にこれらのアッセイの到達不能などの認識の基礎となるメカニズムの限られた知識である。つまり、一人の個人と他者によるその認識による信号の放射の基礎はまだよく理解されている18。

D.:これとは対照的に、個人が離れてストレスをハエによって放出された信号から移動するシンプルな行動、社会的な回避を呈するもハエメランストレス匂いやDSO 19 ogaster。ハイスループットアッセイでは、この動作は、他のハエ、または社会的回避19によって放射されるストレスシグナルの回避のように定量化することができる。ハエをT迷路装置に入れ、DSOを含むバイアルを回避する選択肢を与えられている。このアッセイを用いて、CO 2は、DSOの成分、および2 19を切開したCOに応答するのに必要な神経回路の一部であることが示された。

ここに提示され、社会的回避アッセイは、概念的に、複雑な振る舞い20を解剖するために、研究者の世代を有効にシーモア·ベンザーの研究室で開発されたシンプルな行動アッセイに似ています。社会的回避の分析は、社会的行動のより広範な研究を可能にする、T迷路アッセイを用いてコスト効率よく行うことができる。例えば、このアッセイを使用して、我々は最近実証自閉症の異なる遺伝的リスクは、社会的なB内の対照的な効果を有することehaviorアッセイ。自閉症の候補遺伝子についての変異体- 21,22 neurobeachin - (他の場所で23を参照)の両方の社会的空間に存在する欠陥および社会的な回避24。異常なドーパミン作動性シグナル伝達はまた、ヒト25,26における自閉症の病因に役割を果たすことが提案されている。 neurobeachinで得られた結果とは対照的に、社会的空間を直接VMAT 27のこれらのレベルと相関したが、社会的回避のパフォーマンスは、ドーパミン作動性細胞ショウジョウバエ胞性モノアミン輸送体(VMAT)の増加または減少したレベルによって影響されなかったことを見出した。 neurobeachinVMATで得られた対照的な結果は、反社会的行動の様々な形態を識別するため、異なる基礎となる神経回路網が他の応答を調節する可能性を強調する。

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Protocol

社内で作成1.機器および試薬(他のためのマテリアルのリストを参照してください)

  1. フライ作業を実行するために、ショウジョウバエ冷たい麻酔装置を準備します。
    1. 小さなプラスチックの箱(10.2センチ幅12.7センチ)、ピペットチップボックスの一般的に、トップカバー(3.8センチメートル深い10.2センチ幅12.7センチ)を覆うように多孔質ポリエチレンシートをカット。
    2. 砕いた氷の箱を埋める、多孔性ポリエチレンシートでカバーしています。
  2. T-迷路装置を準備します。以前に詳細28-31に記載された装置を適応させる。
  3. 32は説明したように、フライアスピレーターを準備します。
  4. ストレスなくテストバイアルの内外ハエを変位させる走光性応答装置を準備します。
    1. 29,33に記載されているように、向流装置を使用してください。

NOTE:28によって記載されるようにT字型迷路はまた、他の目的に使用することができる。

  1. HOMを確認してくださいogeneous照明条件は:白ベンチカバーで覆われたベンチに実験を行い、ホワイトボードの前に。
    注:これらの実験のために、使用されるフライ株はショウジョウバエた野生型をキイロ :カントン-S、オレゴン州とサマルカンドは、私たちの研究室のストックから34を飛ぶ。エルウッドハエはロングアイランド、ニューヨーク、米国で、ハンチントンのエルウッド周辺に秋2011年に収集した。

2.実験前にハエの準備

実験を行う前に1〜2日:

  1. 12時間の明/暗サイクルで25℃における標準コーンミール寒天 - 糖蜜 - 酵母媒体上のハエを維持します。
  2. 実験を行うことに1〜2日前に風邪麻酔下のレスポンダハエを収集
    1. 彼らは漏斗を用いて、50ミリリットルファルコンチューブに提起されている中でボトルからハエを転送します。
    2. に、氷のレベルの下のハエでファルコンチューブを置きます絶縁されたアイスバケット。
    3. 冷却するで-4℃、砕いた氷と冷たい麻酔装置を配置します。
    4. ハエは寒さ昏睡を入力するための5分待ちます。
    5. 冷たい麻酔装置の多孔質ポリエチレンシート上にハエを転送します。
    6. 冷たい麻酔装置上​​のレスポンダハエを収集します。 RTで、実体顕微鏡下で、女性のハエから3-7日歳の男性を分離し、40のグループでこれらのハエを維持する。
  3. 実験を行うことに1〜2日前にエミッタハエを収集します。
    1. 静かにカントン-S混在セックスはその数をコントロールし、口の吸引器を使用して、彼らのボトルから飛ぶ集める。
    2. 彼らはエミッタであるように、60〜100のグループでこれらのハエを維持します。
    3. データ点は、必要に応じて発光体のように多くのサンプルを準備します。
  4. 冷たい麻酔のいずれかの交絡影響を最小化するために、応答者およびエミッタの収集後の回復の少なくとも夜を許可する行動に、口アスピレーターコレクション。
  5. 少なくとも1日実験前に、新鮮な空気に置き換えられるように袋に入れて古くなったプラスチック製の香りの空気を可能にするために、テスト用バイアルの袋を開きます。

実験を行う前に、2時間。

  1. でも光で、実験が行われる室内の温度は約23-25​​℃であることを確認し、30%の上記の湿度。
  2. これらのハエが飢えていないことを確実にするために生鮮食品バイアルに応答者およびエミッタショウジョウバエを転送します。
  3. ショウジョウバエは、実験が実行される上のベンチに、2時間の環境に適応してみましょう。

3.ソーシャル回避実験を行うこと

  1. Zeitgeber時間ZT5とZT9間午後3〜4時間の範囲で、一日の同じ時刻に、それぞれの実験を行います。
  2. ドキドキパッド上でT-迷路を置き、およびtので、ネジクリップを締め彼はエレベーター安定している。
  3. 新鮮な試験バイアルにレスポンダハエを転送します。 T-迷路の上部に、レスポンダハエを含むこのバイアルをスナップ。
  4. T-迷路装置を傾斜し、ショウジョウバエがエレベーターに落ちるようにドキドキマットの上をタップします。
  5. ハエは、T-迷路の上部と下部の間にあるので、ダウンエレベーターの上部に移動しますが、選択点以上のエレベーターを維持するために注意を払う - 逃げるのハエを防ぐために。
  6. DSO(以前にハエによって占有されたDSOのないバイアルを生成するために、第5節を参照)のバイアルを取得します。
    1. 応答者のハエは、この新しい環境に適応しているが、試験バイアルにエミッタハエを配置。
    2. ミバエが逃げないように、バイアルを閉じるために綿の部分を置きます。
    3. 15秒間ボルテックスを5秒間ボルテックスからバイアルを取り外し、次のように機械的にミニ渦にこのバイアルを攪拌する。 55秒の合計3回繰り返します。
    4. レム食品バイアルに転送することによって - - エミッタOVE新鮮なバイアルから飛ぶとすぐにT-迷路装置の両側のいずれかにこのDSO満たされたバイアルを置く。
    5. それぞれの新しい目でDSO埋めバイアルの配置の側面を交互に。
  7. T-迷路の反対側に新鮮な試験バイアルを置きます。
  8. ショウジョウバエは、新鮮な試験バイアルとDSOで試験バイアルの間で選択することができるように、完全にダウンしてエレベーターを持参し、タイマーを開始。
  9. 特に断りのない限り、ハエは、1分間、新鮮なバイアルとDSOバイアルのいずれかを選択しましょう​​。
  10. 1分後、新鮮なバイアル、DSOバイアル、およびエレベーターの中で立ち往生ものでハエを分離するためにエレベーターを上に移動。
  11. 各バイアルにハエの数をカウントし、エレベーターで。
  12. 各遺伝子型/条件のためにこれを繰り返します。

4.ソーシャル回避データの分析

  1. 各ジュノのための各バイアルにミバエの数を数えYPE、およびスプレッドシートにデータを転送。
  2. 表計算プログラムを使用して、DSOのないバイアル中のハエの数からDSOバイアルにハエの数を減算し、その後、ハエの総数で割ることによって、各遺伝子型のための性能指数(PI)を計算する。
  3. 結果の分析のための統計解析ソフトを用いてPIは「手段の比較。
    1. 理想的には、各実験のための2-3内部反復、および3つの独立した繰り返しの準備、別のボトルで、異なる日に行わまたは30を横切る。
    2. データが正規分布に従うように、ガウス分布の統計的検定を使用してください。
    3. 1効果をテストするとき( すなわち 、密度- 図2)、コントロールにそれぞれの結果を比較するために、(列ごと)の多重比較のための試験後、または単純なt検定で、一方向ANOVAを使用しています。
    4. グループ実験が行われた場合、条件および性別(空のバイアルの両方をテストし、強調Dの未強調したハエ。ジェンダー影響- 図1)は 、双方向ANOVAを使用して。

5.以前はストレスのないハエによって占有バイアルの生成 - その代わりに3.5から3.6の実行

  1. コントロールとして、強調されていないハエが占有するバイアルを準備する走光性を使用してください。
  2. 試験バイアルにハエを転送し、反対の場所で新鮮な空のバイアルで、向流装置にはめ込みます。
  3. 15 W蛍光クール白色光の前で直接遠位バイアルで水平に装置を置き、そして黒の布でカバーしています。
  4. ハエが優しく新鮮なバイアルに移動しましょう​​。これには数分かかることがあります。ハエのほとんどは遠位バイアル中の光に向かって歩いていると、1分間のタイマーを起動します。
  5. 静かに、黒い布を削除する光の位置を切り替えて、黒い布で回復し、ハエが試験バイアルを残すことができます。
  6. その時、私3.2から3.5のように選択肢実験をnitiate。 3.6と3.7をスキップします。
  7. 他の側からの試験バイアルを空いたハエを分離するために、装置のスライダを移動します。
  8. 3.7のように、選択肢の実験のためにすぐにT-迷路に空いた試験バイアルを使用してください。

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Representative Results

ソーシャル回避アッセイは、他のハエによって放出されるストレスシグナル(DSO)を認識するキイロショウジョウバエの能力を定量化する堅牢な試験であるため、社会的相互作用の一つの側面を評価する。このアッセイは、一般に、2つの異なるオプションの選択にハエを提示するT字型迷路、として知られている種々の行動アッセイで使用される装置を用いて行われる-左または右19,28-31。この場合、ハエはDSOを避けるれる効率は、性能指数(PI)を計算し、比較することにより定​​量される。 100のPIは全てハエがDSOを避けたことを示すゼロのPIは、50-50配布またはまったく回避を示している。 -100のPIは全てハエがDSOバイアル中に入ったことを示すことになる。

ハエは、機械的に撹拌ハエによって放出されたDSO、および1新鮮(DSOフリー)バイアルを含むバイアルされています。代表的な結果は、ここに提示strengtを強調このアッセイの時間だけでなく、最良の結果を得るために必要ないくつかの公知の条件。

DSOの回避は、性別固有のものではありませんが、ハエがストレスさに依存します。レスポンダハエの性別は、DSOの彼らの回避( 図1)には影響しません。しかし、そのバイアルの回避を引き出すために試験バイアルを占領したのはハエには十分ではない、ハエが強調されていなければなりません-この場合は、機械的に( 図1)に攪拌。ハエが入って走光性を使用してストレスなくバイアルを終了した場合、何ハエが試験バイアルを占領していない、またはしていた場合、応答者は、以前に19に報告したようにプリファレンスを誘発しない。

図1は、既知の結果を再現しているが、それはまた、最適以下の条件で得られたデータの種類の一例である。唯一の2から5内部反復、および独立した臨床試験では、エラーバーは範囲を表す。しかし、重要なが異なるがある以前に19報告されているように、以前に、ストレスをハエと非ストレスハエまたは空が占有するバイアル間レンス。この文脈において、ハエはまだ回避の強いPIを表示する。これは、アッセイのロバスト性を強調している。さらに、2つの新鮮なバイアル間の選択のためのPIは、(雌(p <0.05)であること、およびプールされた性別のp <0.01のために、0とは異なる)は負である。これは、T字型迷路の片側の選好、またはサンプルサイズが小さいことに起因するバイアスを示している。この制限は、提示され、その後の実験で行われた試験バイアル、内部反復してT字型迷路上に配置されている側を交互に対抗できる。

DSOに応じて、セックスの効果の欠如にもかかわらず、対応者は、可能な交絡の影響を防ぐために、性別によって分離した。例えば、36シグナリング嗅覚に関与する遺伝子に影響を与えるものなどの性特異的効果を有する可能性の突然変異の場合には。以下representati結果は男性の応答、および混合性別エミッターに焦点VEの。

DSOの回避は、試験した応答者ハエの数とは無関係です。

以前の実験19は、ほとんどのハエが新鮮DSOフリーのバイアルを好んことを示す、40カントン-S高PIを示した社会的な回避を、テストに飛ぶの標準を使用してきた。レスポンダのPIのグループサイズの効果を試験するために、10〜80ハエの範囲は、 図2に示すように、アッセイした。二つの独立した試験やトライアルごとに3つの内部反復の最小を行った。コントロール(40レスポンダハエ)の性能指標に応答ハエの異なる数のそれぞれのPIを比較した場合、t検定は、統計的有意性を示さなかった。このように、応答者のハエの数はDSO回避のPIと変異が変異体は少数で利用可能であっても、テストすることができます回避に与える影響には影響しません。

ENT ">エミッタの高い数はDSOの高い回避にリードを飛ぶ。

エミッタハエの数はDSOとその回避に影響を与えている程度を判定するために、我々はまた、ストレスをハエの量の効果を試験した。過去の実験19、及びこのプロトコルでは、70カントン-Sハエの標準を使用している。私たちは現在、160のエミッタハエ( 図3)に10をテストした。 80以上のエミッタと回避の増加はないが回避のパフォーマンスは、エミッタの数に直接関連している。興味深いことに、かなりの回避がまだのみ10ハエを強調して検出した。再び、これは、一度にいくつかのハエの発光能力を試験することを可能にする。

遺伝的背景は、DSO回避性能に影響を与えます。

キイロショウジョウバエは遺伝学的研究のための強力なモデル生物である。したがって、アッセイdiscrするために使用することができるかどうかを決定することが重要であった異なる遺伝的背景をiminate。四つの異なる野生型の応答は、カントン-Sによって放射されたDSOのそれらの回避( 図4)に対して、(カントン-S、オレゴン-R、サマルカンドとエルウッド)を測定した。カントン-Sとエルウッドは、オレゴンとサマルカンドた(p <0.05)に比べて高いPIを持っている。これらの結果は、DSOの回避の基礎となる遺伝的要素があることを実証し、このアッセイは、この遺伝的影響の研究を実行する権限を持っていること。

選択時間の長さは、パフォーマンスに影響を与える。

図1、図2、図3及び4に示す代表的なデータのセットはまた、避けるバイアルを決定するために応答者に与えられた時間の長さの効果を示す。カントン-S応答は、それらの好適なバイアルを選択するために30〜45秒が与えられたとき、それらは典型的にはPIの周りの性能に到達= 55( 図2、それぞれPI男性= 57±2;および52±11)。 60秒が与えられたとき、図4(PI = 77±6.5)に見られるように、その性能は、高い。

図1
DSOの図1.回避は、性別固有のものではありませんが、ハエがストレスさに依存します。バーグラフは、バイアルに攪拌ハエ(DSO)が残したストレス臭の回避のPIの平均±範囲を表す。男性(赤)、および女性(オレンジ色)が一緒に(茶色)を試験した後、実験後に計数した。ハエは関係なく、性別(二元配置ANOVA)の、同様に行う。しかし、彼らは唯一、P <0.05、Tukeyの多重比較ポストを入力し、走光性によるバイアルを終了すると強調されていなかったハエハエが以前に強調しておいたでDSO充填バイアル(機械的に撹拌)、およびいないバイアル(回避テスト)、または新鮮なバイアルた(p <0.001、Tukeyの多重比較ポストテスト)。でさらに、そこに、新鮮なバイアル及び非ストレスハエ条件の間には統計的な差はなかったバイアスにもかかわらず、新鮮なバイアル実験 - N = 2-5(n = 3の新鮮な40混浴は45秒の選択時間で、各ハエで複製するバイアル、n = 2)の強調ハエバイアル非ストレスファイルバイアルはn = 5。

図2
DSOの図2.回避は、試験したハエの数とは無関係である。代表的なデータは、T-迷路におけるカントン-Sレ ​​スポンダハエの数はDSOの社会的な回避には影響を与えないことを示している。レスポンダハエは新鮮なバイアルとDSOを含むバイアルとの間で決定する30秒を与えられた(n =裁判あたり2-6内部の複製、1-2トライアル、条件ごとに5データポイントの最小値は、棒グラフは平均±SEM表す)

図3

図4
図4.選択時間とショウジョウバエの遺伝的背景は、DSOへの応答に影響を与える。カントン-Sとエルウッド遺伝子型はオレゴン州とサマよりDSOの強い回避を表示rkand(カントン-Sと比較してp <0.05 *、t検定)。レスポンダハエは1分を与えられた。新鮮なバイアルとDSOを含むバイアルとの間で決定する(N =裁判あたり4-5内部の反復、2つの独立した試験では、棒グラフは平均±SEM表す)

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Discussion

このプロトコルは、社会的な回避アッセイのための詳細な手順を説明します。カントン-Sのみが飛んでいるバイアルを避けることができます以前に機械的に強調されてきた、と応答者のその性別と数は、その社会的な回避性能には影響しません。しかし、応答者の遺伝的背景に大きな影響を有する。

以下では正常にこの実験を実施するためのいくつかの重要なステップです:1)常に実験前にハエの2時間を転送し、その環境を乱さないことを確認してください。 2)概日リズムと運​​動および活動レベルのことが可能で変動にリンク性能のばらつきを低減するために、理想的Zeitgeber時間ZT5(光の発症後の時間)ZT9の間、一日の同じ時間に常に実験を行う。実験を行うとき3)温度と湿度の条件を注意してください。 30パーセント以上の23-25​​℃で、湿度周辺の温度は最高です。 4)ではないからdを確認してくださいT-迷路装置isturbハエの判定時間の間に、 5)少なくとも24時間、それらを使用する前に、新鮮なバイアルを空気に確認してください。 6)実験中は常にT迷路の片側に嗜好を回避するために、T迷路装置における試験バイアルの位置を変更することが重要である。追加のテストはこれを確認するために行われる必要があるが、経験的にそれはDSOは5分未満で「ストレス」バイアルをエスケープしているようです。対照的に、ハエが強調された後、1時間までのDSOを放出することができると思われる。

プロトコルに考慮しなければならないいくつかの考慮事項があります。ハエの年齢および社会的な回避との相関関係は現在不明である。そのため、加齢に関連した行動の変化は、その年齢37の前に表示されないように、25℃でせいぜい2週齢のハエで実験を行うことをお勧めします。ハエ(混合男女を収容されたが)のような実験のために収集され交尾DSO発光がハエの交配状況の影響を受けてどのようにそれは不明である。 DSO回避の行動出力は性別によって影響されていないが、基本的な脳回路は、性的二型であってもよく、それは男性と女性のハエを混在させることはないことをお勧めします。最後に、エミッタハエの数の減少は、おそらく、放出された合計DSOの減少にリンク回避の減少につながる。しかし、十分なDSOは、堅牢で再現性の回避につながる、まだわずか10ハエに存在している。

60秒から30秒へレスポンダハエの判定時間の減少は、またカントン-SハエのためのPIの減少をもたらす。これは、カントン-Sよりも良好に飛ぶする条件または変異を区別するためのツールと​​して使用することができる。したがって、現在の状態で、社会的回避アッセイはDSO回避上の遺伝子と環境の効果を試験するために行動パラダイムとして使用することができる。テクニックをマスターした後、今後の手順は、撮影することができDSO回避と最適に動作するように社会的な回避検定を取得するために使用されなければならないエミッタハエの正確な数のための理想的な決定時間を組み込むために。

レスポンダが悪い歩行を持っている場合、テスト変異体に生じるであろう制限が発生する可能性があります。実験的にはそのような貧しい運動に対抗することがこれらの変異体のための長い選択肢時間を決定する。同様に、CO 2の検出を妨げる感覚欠損に飛ぶ- DSO ​​の主要な構成要素、またはDSOの他の未知のコンポーネントは、このアッセイで試験することができないだろう。

この応答の定量化を可能にする他のアッセイは現在ありません。それはCO 2が DSO 19の構成要素であることが示されたが、他の信号成分だけでなく、他の強調個人を避けるために行われる選択に関与する神経伝達物質は、まだ決定されていない。同様に、機構はflieを駆動するDSOを放出するのは知られていない。このアッセイは、現在、変異体、または環境治療の社会的および全体的な行動のプロフィールを決定するための追加的なベンチトップの診断アッセイとして使用することができる。例えば、当業者は、強調ハエの社会的回避する、 すなわち 、最も近い隣人23までの距離を社会空間の定量化を比較し、対比することができる。どちらの行動が他の個人の存在に対応し、かつ近接する、またはそれらを避けるために決定をする必要があります。これらは、脳回路と関係する神経伝達物質を分析するための非常にシンプルで強力な方法です。これらの行動パラダイムはまた、スクリーニングの目的に使用する大きな可能性を有している。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Porous Polyethylene, 12" x 12" Sheet Flystuff - Genesee 46-100 http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
Porous Plastic sheet for the cold anesthesia box
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
Sharpie pens
Adhesive Tape
Mini vortex Fisher 14-955-151  http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
For mechanical agitation of the flies - any vortex would work.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon test tube; round bottom; disposable; no closure, 14 ml; 17 x 100 mm Fisher 14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
These snap in place in the in-house made T-maze and counter-current apparatus (see text)
cotton balls to close the vials after the experiment.
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
white bench cover
pounding pad any mouse pad works.
large black cloth to cover the counter-current apparatus in phototaxis response.
cool-white light  Home Depot 1000516563 http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
any similar linear light with fluorescent light bulb cool-white at 13-15 W would work

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References

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神経科学、問題94、社会的行動、社会的な回避、
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Fernandez, R. W., Nurilov, M.,More

Fernandez, R. W., Nurilov, M., Feliciano, O., McDonald, I. S., Simon, A. F. Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (94), e52011, doi:10.3791/52011 (2014).

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