Abstract
Kök hücre araştırma ve biyomühendislik tekniklerinden son önemli gelişmeler yeniden ve ortopedik ve periodontal alanlarda basit dokularda hasarı onarmak için biomateryaller kullanan büyük ilerleme kaydettik. Organ yenilenmesi biyolojik süreçleri iyi araştırılmış değil çünkü Ancak, yapılar ve akciğer gibi daha karmaşık üç boyutlu (3D) organların işlevlerini yeniden çalışır çok başarılı olmamıştır. Angiogenesisin, yeni kan damarlarının oluşumu, organ yenilenmesi kilit rol oynadığı açık hale gelmektedir. Yeni vaskülatürlerden oksijen, besinler ve organ yenilenmesi için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri sunmak değil, aynı zamanda rejenere dokularda lokal bir öğretici sinyallerini sağlamaz olarak, oluşturulmuş. Bu nedenle, başarılı bir yetişkinde akciğerlere yeniden oluşturmak, lokal, akciğer dokularının sürücüler rejenerasyonu angiogenesis olan akciğer özgü mikroçevrelerde özetlemek için gereklidir. Co rağmennventional, in vivo bu hidrojeller (örneğin, fibrin ve kollajen jelleri veya Matrigel - Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan ECM proteini karışımı) bakımından zengin hücre dışı matrisin (ECM), deri altından implante anjiyojenez tahlilleri, yoğun keşfetmek için kullanılır akciğer biyomateryaller ortotopik implantasyonu için yöntemler iyi tespit edilmemiştir çünkü anjiyojenez genel mekanizma, akciğer spesifik anjiyojenez iyi karakterize edilmemiştir. Bu protokolün amacı jel içinde ev sahibi akciğer kaynaklı anjiyogenez başarılı recapitulation sağlayan, yaşam yetişkin fare akciğer yüzeyinde fibrin jel implant benzersiz bir yöntem tanıtmaktır. Bu yaklaşım, akciğer özgü mikroçevresinin, normal ve patolojik durumlarda hem anjiyogenez ve alveol yenilenmesini kontrol eden mekanizmalar keşfetmek için araştırmacılar sağlar. Implante biyomalzemeler sunulduğundan beri komşu l fiziksel ve kimyasal sinyalleri tedarik veung dokular, hastalıklı akciğer bu biyomalzeme implantasyonu potansiyel akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için araştırmacılar sağlayan, komşu hastalıklı dokuları normale olabilir.
Introduction
Bu protokolün genel amacı araştırmacılar, akciğer vasküler ve alveol gelişme moleküler mekanizmaları karakterize sağlar erişkin fare, akciğer yüzeyinde fibrin jel implant için bir yöntem tanıtmak ve yetenekli biyomimetik malzemelerin geliştirilmesi için bu bilgiyi kaldıraç için çeşitli akciğer hastalıkları tedavi etmek için fizyolojik akciğer vasküler ve alveol oluşumunu yansıtan bir.
35 milyondan fazla Amerikalı kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve pulmoner fibrozis gibi kronik akciğer hastalıkları muzdarip. Bu hastalar önemli ölçüde günlük yaşam 1-3 bozan tür nefes darlığı, göğüste sıkışma hissi, öksürük nagging ve yorgunluk gibi uzun ömürlü kronik solunum semptomları var. Bu akciğer hastalıkları için etkili tedaviler geliştirmek için çaba büyük bir miktarda rağmen, şu anda tedavisi yoktur; Bu nedenle, bu hastalarda yaşam kalitesi zayıf ve ekonomik ve insani maliyeti merhaba vardırgh 4-7. Şu anda, akciğer transplantasyonu son dönem kronik akciğer hastalığı olan hastaları kurtarmak için tek yoldur. Ancak, nakli donör, yüksek maliyet, ciddi komplikasyonlar ve düşük sağkalım oranı 8-11 sıkıntısı, transplantasyon optimal yaklaşım değildir. Doku mühendisliği teknikleri son hızla ilerleme progenitör hücreleri veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden 12,13 çeşitli tipleri ile decellularized bütün akciğeri repopulating tarafından implante akciğer biyomühendis araştırmacıların sağladı. Bununla birlikte, bu bulasıcı akciğerler sadece implantasyon 12,14,15 sonra birkaç saat süre ile bir ev sahibi, hayvanlarda işlevsel. Akciğerlerin karmaşık yapıları ve işlevleri yenilenmesine biomateryaller kullanmak da oldukça başarısız olmuştur. Erişkin akciğer rejenerasyon yöneten kilit biyolojik süreçler iyi araştırılmış değil çünkü bu olabilir. Akciğerde vasküler sistemin oluşumu erken ve en önemli olaylarından biri olan During geliştirme ve yenilenme 16-21. Yeni, sadece oksijen, besin ve organ oluşumu için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri teslim değil, aynı zamanda çevredeki hücrelere 22-25 öğretici düzenleyici sinyallerini sağlamaz akciğerde vaskülatürlerden kurdu. Böylece, anjiyogenez yetişkin akciğerlerde 24,26,27 rejeneratif alveolarization kilit roller oynar. Buna ek olarak, düzensiz anjiyogenez, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), 28, bronkopulmoner displazi (SKB), 21-23, ve pulmoner fibroz 29 gibi kronik akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Böylece, akciğerleri mühendislik veya kronik akciğer hastalıklarının tedavisi için daha etkili stratejiler geliştirmek, akciğer özel anjiyogenez temel mekanizmalarını anlamak için gereklidir.
Her organ fizyolojik ve patolojik durumlarda 30-33 arasında farklılık benzersiz mekanik ve kimyasal özelliklere gösterir. Bu organa özgü microenvironrından endotel hücre davranışlarını düzenleyen ve bir organ-spesifik şekilde 24,34-36 vasküler ağı oluşumu sonucu alacak. Böylece, akciğer rejenerasyonu için daha etkin stratejilerin geliştirilmesi için, akciğer özgü angiogenesisi altında yatan mekanizmanın anlaşılması gerekir. Subkutan hidrojel implantasyonu gibi in vivo geleneksel anjiyojenez tahlilleri anjiyogenez araştırma 37-39 için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu yöntemler, organa özgü anjiyojenezi özetlemek yoktur. Son zamanlarda, fare akciğer elastik kalıp içinde Matrigel implant için yeni bir yöntem geliştirilmiştir ve başarılı bir jel 22, kan damarları ve akciğer epitelyal hücreleri iyileştirme gösterilmiştir. Bu eşsiz bir yaklaşım araştırmacılar fizyolojik ve patolojik durumlarda, kan damarları ve vasküler olmayan akciğer hücreleri arasında akciğer özgü anjiyojenezin mekanizması olarak etkileşimleri keşfetmek için izin verir. 1) Matrigel klinik uygulama için uygun olmadığı; 2) EBir klinik olarak daha uygun bir yaklaşım olarak, hidrojeller ve ev sahibi akciğer dokusunda ve 3) akciğer elastik kalıp potansiyel solunum sırasında akciğer fonksiyonu ve ağrı gibi yakınmalara yol açar arasındaki etkileşimi etkileyebilir jel döküm için kullanılan Lastic kalıp, bir 3D fibrin matriks anjiogenik faktörleri içeren (vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) / temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)) elastik kalıp döküm olmaksızın fare akciğer implante edilmiş ve başarılı bir şekilde ana akciğer türetilmiş angiogenesisi değinmeyecek olmuştur. Fibrin jel, trombinle ayrılmış fibrinojenden oluşan polimer fibriller yakalamak için in vivo 40,41 anjiyojenezi hızlandırmak için örneğin bFGF ve VEGF gibi anjiyojenik faktörlerin bir çeşitliliği bilinmektedir. Çünkü onun rejeneratif yeteneği ve biyobozunur doğa 42, fibrin jel yaygın doku mühendisliği alanında kullanılır.
Bu makalede yaşayan Adul akciğer yüzeyinde fibrin jel implant bir roman ve benzersiz bir yaklaşım tanıttıt, fare ve ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men in vivo jellerin içinde özetlenen olduğunu göstermektedir. Akciğer özel anjiyogenez çalışma araştırmacılar sağlayan bu yöntem, büyük olasılıkla akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımlarının gelişmesine yol ve anlamlı başarıyla yetişkin akciğeri yeniden çabalarını ilerleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: in vivo hayvan çalışması Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. protokol gözden ve Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol Numaraları: 13-10-2526R, 14-02-2568R) tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm ilaçlar, farmasötik dereceli olan ve bu ilaçlar, steril koşullar altında hazırlanır.
1. fibrin jel çözeltisi,
- VEGF ve bFGF içeren fibrin jel hazırlayın.
- Oda sıcaklığına kadar -80 ° C (25 ° C) saklanır fibrinojen ve trombin çözülme stok çözeltileri.
- Fıbrinojene: (0-100 ng / ml nihai konsantrasyon), CaCl2 (nihai konsantrasyon: 45 mM), VEGF (nihai konsantrasyon 0-100 ng / ml) ve bFGF: trombin (2.5 U / ml nihai konsantrasyon) ilave çözeltisi (nihai konsantrasyon:% 0.9 sodiu içinde 12.5 mg / mlm 1,5 ml tüp klorür solüsyonu 43-45).
- Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın.
- Yavaşça P200 pipet kullanarak damla damla steril bir plastik tabak üzerine karışımın 200 ul pipetle.
- Katılaşma kadar, 30-60 dakika boyunca, 37 ° C'de damla inkübe edin.
Not: katılaşmış jel implantasyon (Şekil 1a) önce bir kaç saat için oda sıcaklığında (25 ° C) 'de kapalı bir plastik tabak içinde tutulabilir.
- Implantasyon öncesi küçük cerrahi makas kullanarak yaklaşık 3 x 3 x 3 mm küpler halinde fibrin jel Trim.
2. Fare Hazırlama
- Intraperitoneal ketamin ile (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) (IP) enjeksiyon yetişkin fare (8-12 hafta) uyutmak ve fare yeterince fare burnunu sıkıştırarak anestezi onaylayın.
- Deney sırasında kuruluğunu önlemek için fare gözleri veteriner merhem kullanın.
- Tıraş fufare göğüs kafesinin sol tarafında üzerinde r.
- Fare endotrakeal entübasyon gerçekleştirin.
- Entübasyon fare 70 ° açılı standı ve standın üst kısmında bulunan küçük bir lastik bant üzerinde üst kesicilerin çengel yerinde fareyi tutun yerleştirin.
- Yavaşça künt forseps kullanarak bir tarafa dilini geri çekin.
- Bir fiber-optik mikroskop boynu ışığı yardımı ile gırtlak gözünüzde canlandırın.
- Trakea içine endotrakeal elastik kateter (21 G) yerleştirin.
- Fare kendiliğinden (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) sorunsuz bir biçimde nefes olduğunu doğrulayın.
- Diseksiyon mikroskobu altında yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin.
- Mekanik bir kemirgen vantilatör kullanarak fare havalandırın (150 solunum / dk ve 7 ml / kg tidal hacmi).
- 4. ve 5. kaburga arasındaki interkostal boşluk bulmak için kaburga sayın.
- Alan b üzerinde steril bir alan oluşturuny iyice alkol ve Povidon-İyot ile silerek. Steril cerrahi örtü ile yeterince cerrahi alan örtün.
3. Fare Cerrahisi
- Deri içinde% 0.25 bupivakain (200 ul), lokal enjeksiyonundan sonra, kesme makasları kullanılarak interkostal aralığa boyunca enine cilt insizyonu (yaklaşık 1 cm uzunluğu) sunuyor.
- Interkostal kas içine% 0.25 bupivakain (200 ul) enjeksiyonundan sonra, ince, küçük makas kullanarak 4. ve 5. kaburga arasında bir kas kesi yapmak.
- Tam sol akciğer görselleştirmek için kaburga arasında bir diseksiyon retraktör yerleştirin.
- Ince forseps kullanılarak sol akciğer merkezinin viseral plevra küçük bir alanda (1 x 1 mm kare) Pençe.
- Kanama ve hava kaçakları tamamen kontrol kadar steril bir pamuklu çubukla kullanarak alanda hafif basınç uygulayın.
- Fibrinojen / trombin (fibrin yapıştırıcı) taze karışımı (adım 1.1.2. 20 & # az miktarda koyun181; P200 pipet kullanarak alana l).
- Yavaşça alanı (Şekil 1b) üzerinde küçük forseps kullanarak bir fibrin jel (adım 1.2) yerleştirin.
- Jel de akciğer solunum hareketleri sırasında bölgede sabit olduğunu doğrulayın.
- Ne masif hava sızıntı veya akciğer kanaması olduğundan emin olun.
- Bulunmamaktadır absorbe edilebilir sütür ile yakın insizyon (kas ve deri tabakaları) bertaraf edilmesi.
- Pnömotoraks önlemek için 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak göğüs boşluğu aspire.
- Mekanik ventilasyon sonlandırın.
4. Fare Kurtarma
- Fare kendiliğinden düzgün bir şekilde (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) nefes emin olun.
- IP 1 ml enjekte dehidratasyonu önlemek için NaCl% 0.9 önceden ısıtılmış.
- Fare dolaşan sıcak su yastığı üzerinde kurtarmak için izin verin.
- Endotrache kaldırFare istikrarlı nefes olduğunu onayladıktan sonra al tüpü.
- Ameliyat sonrası ağrı kesici olarak 3 gün boyunca, meloksikam (5 mg / kg, deri altına enjeksiyon (SC) enjekte edilir.
- O (kendi mide üzerine rulo mümkün ve dik kalması) sternum ve bilinçli kadar dikkatlice 15 dakika aralıklarla en az fare hareketlerini izlemek.
- İyileştikten sonra, ameliyat olmadan farelerden izole bir yeni kafes fare dönün.
- Günlük aşağıdaki enfeksiyon belirtileri (kızarıklık, şişme, akıntı), hayvanın temel biyolojik fonksiyonları (gıda ve su alımı, idrar, dışkılama, vücut ağırlığı artışı) yanı sıra klinik belirtileri sıkıntı cerrahi sitesini (piloerection, azaltılmış hareket) Monitör cerrahi prosedür.
5. Hasat Akciğer
- 7-30 gün implantasyondan sonra, sıkıştırılmış gazın kaynağı ile CO2 kullanılarak fare euthanize.
- Xiphoid sürecin ucu ve Sternum arasında bir kesi yapmakçentik (medyan sternotomi) ve trakea kesme ve kalp, akciğerler, trakea tüm bağlantıları keserek histolojik ve biyokimyasal analiz için implante jel ile hasat tüm akciğer.
- Gecede Ekim bileşik embed 4 ºC,% 4 paraformaldehit çözeltisi ile akciğer ile implante jel Fix ve 30 mikron kalınlığında seri adımı bölümlerini almak.
- Histolojik (hematoksilen ve eozin boyama) ve immünohistokimyasal analizler gerçekleştirin (endotel işaretleyici: CD31, epitel işaretleyici: aquaporin (AQP) 5 ve surfaktan protein (SP) -B) konfokal mikroskop 22,37,40 kullanarak.
- 3D görüntü analiz yazılımı kullanarak 37 akciğer endotel üç boyutlu görüntüler ve epitel hücreleri oluşturmak için optik bölümler (kalın 30 mikron) yığınlarını derleyin.
- Görüntü analiz yazılımı 46 kullanılarak yeni oluşan kan damarlarının öngörülen alanları gösteren alanlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ana akciğer türevi damar oluşumu, akciğer implante biyomalzeme içinde özetlenen olup olmadığını incelemek için, fibrin jel büyük anjiyojenik faktörler VEGF ve bFGF ile desteklenmiş (0, 10 ve 100 ng / ml her biri) gibi canlı fare akciğer yüzeyine yerleştirildi Matrigel 22 kullanılarak bildirdi. Şekil 1a gösterildiği gibi bu anjiyojenik büyüme faktörleri içerir fibrin jeller 47 imal edildi. Torakotomi sonra, sol akciğer yüzeyinde küçük bir alanda forseps kullanılarak kazınmış ve fabrikasyon fibrin jel FDA onaylı ve yaygın durdurmak için etkili bir dolgu olarak kullanılan fibrin yapıştırıcı küçük bir miktar kullanılarak yetişkin fare akciğer, implante edilmiş hava kaçağı ve akciğer cerrahisi 48,49 (Şekil 1b) kanama azaltmak. Çoğu fareler ciddi solunum semptomları (örn, pnömotoraks, solunum sıkıntısı olmadan) iyileşti. Yedi gün implantasyondan sonra, fareler öldürüldü ve akciğerler Harve edildisted. Takılan fibrin jel 7 gün implantasyon (Şekil 1c) sonra ev sahibi akciğer içine dahil oldu. Konfokal floresan görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon VEGF / bFGF doza bağımlı bir şekilde 7 gün implantasyon sonrası jeller içinde damar ağları oluştuğunu konak kaynaklı CD31-pozitif endotel hücreleri göstermiştir (Şekil 2a, c). Tip I (AQP5 pozitif) ve tip II (SP-B, pozitif), akciğer epiteli hücreleri, VEGF ve bFGF (her biri 100 ng / ml) (Şekil 2a) daha yüksek konsantrasyonları ile takviye edilmiştir jellerin içinde yeni oluşan kan damarları boyunca alındı . Histolojik kesitlerin H & E boyama konakçı hücrelerin, diğer türleri de implantasyon (Şekil 2b) sonra jel, 7 gün doğru göç ettiklerini ortaya çıkarmıştır. Bu bulgular konak akciğer kaynaklı rejeneratif damar ağları başarıyla anjiyogenik faktörler ile desteklenmiş ve yetişkin kalıplar yüzeyinde implante edilir fibrin jel içinde inşa edilmiştir düşündürmektedirse akciğer.
Şekil 1:. Sol akciğerde (ok başları) kazınmalıdır visseral plevra üzerinde implante implantasyon öncesi hazırlanan (a) Fibrin jel (b) Fibrin jel (c) İmplant fibrin jel (ok başları) 7 gün implantasyon sonrası ev sahibi akciğer dahil.. Ölçek çubukları 1 mm arasındadır.
Şekil 2 (a), vasküler ağların oluşumu gösteren floresan mikrograflan (CD31 pozitif, yeşil) ve işe tip I (AQP5 pozitif; kırmızı) ve tip II (SP-B pozitif; kırmızı) fibrin jel içinde akciğer epitel hücreleri ile desteklenmiş VEGF ve bFGF çeşitli konsantrasyonlarda (7 gün implantasyon sonrası / ml her biri) ng, 0, 10 ve 100. Kesikli çizgiler implante fibrin jel ve ana akciğer arasındaki arayüzü göstermektedir. Ölçek çizgisi:. 20 um (b) 7 gün implantasyondan sonra fibrin jel konak hücrelerin infiltrasyonunu gösteren H & E ile boyama ışık mikrografı. Oklar jel ve ev sahibi akciğer arasındaki arayüzü gösterir. Ölçek çizgisi: 20 um VEGF ve bFGF çeşitli konsantrasyonları ile takviye edilmiş olan fibrin jel yeni oluşmuş kan damarlarının öngörülen alanlarını gösteren (c) Grafik 7 gün implantasyondan sonra (0, 10, 100 her ng / ml)..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, erişkin fare yaşayan akciğer yüzeyinde biyomalzemeleri implant için yeni bir yöntem tanıttı. Bu sistem ile, ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men başarılı bir malzeme içinde değinmeyecek. Bu sistem, araştırmacılar, endotel hücreleri arasındaki karışma keşfetmek sağlar, diğer hücrelerin (örneğin, epitelyal hücreler, mezenkimal hücreler, bağışıklık hücreleri) yerel anjiyojenez 50-53 ve alveolar rejenerasyon 24,54 için gerekli olan ve ECM bileşenleri. Geleneksel in vivo olarak deri altından hidrojel implantasyon anjiyogenez araştırma 37-39 için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu yöntemler, organa özgü anjiyojenezi özetlemek yoktur. Hidrojel akciğer yüzeyinde doğrudan implante olduğu bu sistem, erişkin fare akciğer anjiyogenez ve alveol rejenerasyon akciğer özel mikroçevresinin rollerini araştırmak için araştırmacılar sağlayacaktır. Bu jeller, çeşitli ECM zengin biomate imal edilebilirÇeşitli kimyasal faktörler (örneğin, anjiyojenik faktörler, büyüme faktörleri), 55,56, progenitör hücrelerin ve / veya iPS hücreleri ile desteklenebilir cisimler (örneğin kollajen, fibrins). Kimyasal faktörlerin yanı sıra, mekanik kuvvetlerin anjiyogenezi 23,37 kontrol eder. bir fibrinojen konsantrasyona bağımlı bir şekilde 57 ve kimyasal sinyallere ile değil aynı zamanda fiziksel ipuçları 58,59 üzerinden sadece anjiyojenezi etkileyebilir fibrinojen manipüle fibrin jel değişikliklerin sertliği. Bu nedenle, fibrin jel fiziko-kimyasal özellikleri ileride fizyolojik organa özgü angiogenesisi özetlemek için dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekebilir. Viseral plevra kazıma sonrası yara iyileşmesi, aynı zamanda, konakçı hücrelerin farklı türlerini kapsar ve iyileşme sürecini ve doku rejenerasyonunu teşvik ettiğini endojen bir fibrin pıhtısı üretir. Bu doğal pıhtı anjiyo kontrol dolayısıyla Eksojen implante fibrin jel ile etkileşim ve olabilirimplante jel oluşumu. Floresan etiketli fibrinojen doğal fibrin pıhtı ve implante fibrin jel ayırt ve bu mekanizmaları keşfetmek için araştırmacıların sağlayabilir. Bu yenidoğan farelerde büyük ihtimalle mevcut teknik zorluklar akciğer gelişimi ve hastalıkların çalışmaya erişkin fare akciğerlerinde anjiogenezisi, uygulamayı karakterize için güçlü bir yöntem olmakla birlikte.
Bu çalışmanın nihai amacı hastalıklı akciğerler üzerinde implante fibrin jel içine fonksiyonel kan damarları işe ve fonksiyonel akciğer yapıları restore etmek bir tıbbi cihaz olarak matris kullanmaktır. Olası jeller içindeki konak hücreleri ve vasküler ve alveol yapılar arasındaki iletişimin yanı sıra bu yapıların işlevsellik gelecek deneylerde araştırılmalıdır. Akciğerlerde VEGF düzeyleri BPD 60 ve amfizem 61 olan hastalarda azalmış olduğundan, matris VEGF ekleyerek matris Impl içine kan damarlarının işe artırabilirBu hastalıklı akciğerler üzerinde anted. Mekanik özellikleri de sağlıklı ve hastalıklı akciğerler 23,62 arasında farklılık gösterir. Örneğin, bozulma ve kolajenlerin çapraz bağlanmasını kontrol matris metalloproteinaz ve lisil oksidaz, ekspresyonu sırasıyla, KOAH, pulmoner fibroz 63-67 dahil çeşitli akciğer hastalıklarının değiştiği saptanmıştır. Hastalıklı akciğerler akciğer endotel ve epitel hücreleri için atalarıdır belirli soylar 68 tükenmiş. Bu nedenle, progenitör hücreleri ile desteklenmiş fibrin jeller, bu faktörler (anjiyojenik faktörler, ECM ECM sertliği) işleme ya da implante 69 olasılıkla matris ve çeşitli patolojik durumların akciğer fonksiyonun geri içinde fonksiyonel damarların oluşumuna yol açar. Kimyasal faktörler yerel angiogenesisi modüle etmek için fibrin jel içinde ilave edilebilir, bu sistem, aynı zamanda, kronik akciğer hastalıkları hastalıklı akciğerleri etkilemektedir belirli çevresel işaretler keşfetmek kullanılabilir. Özetle, bu makale in vivo akciğer özel anjiyogenez karakterize etmek için araştırmacılar sağlayan yaşayan fare, akciğer yüzeyinde fibrin hidrojel implant için bir yöntem sunar. Çeşitli faktörlerin modifikasyonu (örneğin, zaman süreci, konsantrasyonlar ve anjiyojenik faktörlerin kombinasyonları, hidrojeller çeşitli hidrojeller fiziko-kimyasal özellikleri), bu sistemde, akciğerde damar ve yenilenme mekanizmaları açıklayacak. Böylece, bu sistem önemli ölçüde temel vasküler biyoloji, doku mühendisliği bilimsel bilgi, yanı sıra akciğer tıp ilerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AM), ABD Savunma Bakanlığı (BC074986), Boston Çocuk Hastanesi Fakültesi Kariyer Geliştirme Bursu (TM, AM) fonları tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, teknik yardım için Amanda Jiang ve Elisabeth Jiang teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen from human placenta | Sigma | F4883 | For fabrication of fibrin gel |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | For fabrication of fibrin gel |
| Recombinant mouse VEGF 164 | R&D | 493-MV | For supplementation to fibrin gel |
| Recombinant mouse bFGF | R&D | 3139-FB | For supplementation to fibrin gel |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific INC | RIS 100 | For intubation |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-565-35 | For intubation |
| 21 G Elastic catheter | B.Braun | 4251652-02 | For intubation |
| MiniVent Ventilator | Harvard Apparatus | CGS-8009 | For ventilation |
| Stemi DV4 Steromicroscope | Fisher Scientific | 12-070-515 | For surgey |
| Absobable suture | Ethicon | PDP304 | Surgical suture |
| Antibody against CD31 | BD Biosciences | 553370 | Immunohistochemistry |
| Antibody against AQP5 | Abcam | AB78486 | Immunohistochemistry |
| Antibody against SP-B | Abcam | AB40876 | Immunohistochemistry |
References
- Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
- Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
- Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
- Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
- De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
- Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
- Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
- Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
- Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
- Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
- Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
- Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
- McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
- White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
- Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
- Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
- Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
- Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
- Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
- Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
- Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
- Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
- Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
- Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
- Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
- Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
- Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
- Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
- Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
- Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
- Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
- Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
- Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
- Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
- Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
- Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
- Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
- Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
- Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
- Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
- Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
- Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
- Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
- Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
- Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
- Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
- Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
- Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
- Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
- Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
- Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
- Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
- Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
- Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
- Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
- Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
- Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
- Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
- Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).
