Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese

Published: December 21, 2014 doi: 10.3791/52012

Abstract

Recente significante vooruitgang in het onderzoek naar stamcellen en bio-ingenieur technieken hebben grote vooruitgang geboekt in het gebruik van biomaterialen om zich te vernieuwen en te herstellen schade in eenvoudige weefsels in de orthopedische en parodontale velden. Pogingen om de structuren en functies van meer complexe driedimensionale (3D) organen zoals de longen regenereren weinig succesvol geweest omdat de biologische processen van orgaanregeneratie zijn niet goed onderzocht. Het wordt steeds duidelijker dat de angiogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten, speelt een belangrijke rol bij orgel regeneratie. Nieuw gevormde vasculatures leveren niet alleen zuurstof, nutriënten en verschillende celcomponenten die vereist zijn voor orgaanregeneratie maar ook leerzaam signalen aan de regenererende lokale weefsels. Daarom, om de longen bij een volwassene succes regenereren, moet de long-specifieke micro-omgevingen waarin angiogenese aandrijvingen herstel van lokaal longweefsel recapituleren. Hoewel conventional in vivo angiogenese assays, zoals subcutane implantatie van extracellulaire matrix (ECM) -rijk hydrogels (bijvoorbeeld, fibrine en collageen gels of Matrigel - ECM-eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen), worden op grote schaal gebruikt om het verkennen algemene mechanismen van angiogenese, long-specifieke angiogenese niet goed gekarakteriseerd omdat werkwijzen voor orthotope implantatie van biomaterialen in de longen niet goed vastgesteld. Het doel van dit protocol is om een ​​unieke methode te introduceren in fibrine gel implantaat op de long oppervlak van levende volwassen muis, waardoor de succesvolle recapitulatie van gastheer-long afgeleid angiogenese in de gel. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om de mechanismen die de long-specifieke micro-omgeving controleert angiogenese en alveolaire regeneratie in zowel normale en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Sinds geïmplanteerde biomaterialen vrijkomen en leveren fysieke en chemische signalen naar aangrenzende lung weefsels, kan implantatie van deze biomaterialen op zieke long potentieel normaliseren aangrenzende zieke weefsels, waardoor onderzoekers nieuwe therapeutische benaderingen van verschillende soorten longziekten ontwikkelen.

Introduction

De algemene doelstelling van dit protocol is een methode te introduceren aan fibrine gel implantaat op de long oppervlak van volwassen muizen, die het mogelijk maakt de onderzoekers om de moleculaire mechanismen van long vasculaire en alveolaire ontwikkeling karakteriseren, en om deze kennis benutten om biomimetic materialen die te ontwikkelen van recapituleren fysiologische long vasculaire en alveolaire vorming van diverse longziekten behandelen.

Meer dan 35 miljoen Amerikanen lijden aan chronische longziekten waaronder chronische obstructieve longziekte en pulmonaire fibrose. Deze patiënten hebben een langdurige chronische respiratoire symptomen zoals kortademigheid, pijn op de borst, zeurende hoest, en vermoeidheid, die hun dagelijks leven 1-3 aanzienlijk beperken. Ondanks een grote hoeveelheid inspanning om effectieve therapieën voor deze longziekten te ontwikkelen, momenteel is er geen genezing; Daarom, de kwaliteit van leven voor deze patiënten is slecht en de economische en menselijke kosten zijn high 4-7. Momenteel longtransplantatie is de enige manier om patiënten met eindstadium van chronische longziekten op te slaan. Vanwege het gebrek aan transplantatie donoren, hoge kosten, ernstige complicaties en lage overlevingspercentage 8-11, transplantatie geen optimale benadering. Recente snelle vooruitgang in de tissue engineering technieken heeft onderzoekers nodig om implanteerbare long bio-ingenieur door herbevolken gedecellulariseerde hele long met diverse soorten stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen 12,13. Echter, deze bioengineered longen functioneel in gastheerdieren slechts enkele uren na implantatie 12,14,15. Gebruik makend biomaterialen de complexe structuren en functies van de longen regenereren is ook tamelijk succesvol. Dit kan zijn omdat de belangrijkste biologische processen die volwassen longen regeneratie regeren zijn niet goed onderzocht. In de long, vorming van het vasculaire systeem is een van de vroegste en belangrijkste gebeurtenissen during ontwikkeling en regeneratie 16-21. Nieuw gevormde vasculatures in de long leveren niet alleen zuurstof, voedingsstoffen en diverse mobiele componenten die nodig zijn voor orgel vorming, maar ook leerzaam regulerende signalen naar omliggende cellen 22-25. Zo angiogenese speelt een belangrijke rol in de regeneratieve alveolarization bij volwassen longen 24,26,27. Bovendien gedereguleerde angiogenese bijdraagt ​​aan chronische longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD) 28, bronchopulmonaire dysplasie (BPD) 21-23 en longfibrose 29. Dus om efficiënter uit manipuleren longen of behandelen van chronische longziekten ontwikkelen is het noodzakelijk om het werkingsmechanisme van long-specifieke angiogenese begrijpen.

Elk orgaan geeft unieke mechanische en chemische eigenschappen, die kan verschillen tussen fysiologische en pathologische omstandigheden 30-33. Deze orgaanspecifieke microenvironmenten reguleren endotheelcellen gedrag en orkestreren vasculaire netwerkvorming in een orgaan-specifieke manier 24,34-36. Dus om efficiënter uit long regeneratie ontwikkelen, het mechanisme dat long-specifieke angiogenese te worden begrepen. Terwijl conventionele in vivo angiogenese assays zoals subcutane implantatie hydrogel zijn uitgebreid gebruikt voor angiogenese onderzoek 37-39, hebben deze methoden niet herhalen orgaanspecifieke angiogenese. Onlangs is een nieuwe werkwijze te Matrigel implanteren in een elastische schimmel op de muizenlong ontwikkeld en getoond bloedvaten en long epitheelcellen in de gels 22 succesvol werven. Deze unieke benadering kunnen de onderzoekers het mechanisme van long-specifieke angiogenese alsmede interactie tussen bloedvaten en niet-vasculaire longcellen verkennen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Sinds 1) Matrigel is niet geschikt voor klinische toepassing; 2) elastic mal gebruikt om de gel kunnen beïnvloeden interacties tussen hydrogels en gastheer longweefsel en 3) de elastische schimmel op de longen veroorzaakt potentieel verminderde longfunctie en pijn tijdens de ademhaling gegoten als een klinisch relevante benadering een 3D fibrine matrix die angiogene factoren (vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) / basische fibroblast groeifactor (bFGF)) is geïmplanteerd op de muizenlong zonder gieten de elastische matrijs, en met succes geïncorporeerd gastheer-long afgeleide angiogenese. Fibrinegel, polymeer fibrillen gegenereerd uit trombinegekliefde fibrinogeen, bekend te vangen diverse angiogene factoren zoals bFGF en VEGF angiogenese versnellen vivo 40,41. Door zijn regeneratieve vermogen en biologisch afbreekbaar 42 wordt fibrine gel veel gebruikt op het gebied van weefselmanipulatie.

Dit artikel introduceert een nieuwe en unieke benadering van fibrine gel implantaat op de long oppervlak van levende adult muis en toont aan dat gastheer-long afgeleide angiogenese wordt geïncorporeerd in de gel in vivo. Deze methode, die onderzoekers in staat stelt long-specifieke angiogenese, zal waarschijnlijk leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor verschillende typen longziekten en pogingen tot volwassen long succes regenereren aanzienlijke vooruitgang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NB: De in vivo dierlijke studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van Boston Children's Hospital (Protocol Nummers: 13-10-2526R, 14-02-2568R) goedgekeurd. Alle geneesmiddelen die gebruikt worden in dit protocol zijn van farmaceutische kwaliteit en deze geneesmiddelen worden bereid onder steriele omstandigheden.

1. fibrinegel Voorbereiding

  1. Bereid fibrine gel die VEGF en bFGF bevat.
    1. Ontdooi voorraadoplossingen van fibrinogeen en trombine die zijn opgeslagen bij -80 ° C tot kamertemperatuur (25 ° C).
    2. Voeg trombine (eindconcentratie: 2,5 U / ml), CaCl2 (eindconcentratie 45 mM), VEGF (eindconcentratie: 0-100 ng / ml) en bFGF (eindconcentratie: 0-100 ng / ml) aan de fibrinogeen oplossing (eindconcentratie: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium-oplossing 43-45) in een 1,5 ml buis.
    3. Meng voorzichtig door pipetteren.
    4. Zachtjes pipet 200 ul van het mengsel op een steriele plastic schaaltje in een drop-wise mode behulp p200 pipet.
    5. Incubeer de druppels bij 37 ° C gedurende 30-60 min tot ze stollen.
      OPMERKING: De gestolde gel kan in de afgesloten plastic schaaltje bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende verscheidene uren bewaard voor de implantatie (figuur 1a).
  2. Trim de fibrine gel in ongeveer 3 x 3 x 3 mm blokjes met behulp van kleine chirurgische schaar voor implantatie.

2. Muis Voorbereiding

  1. Verdoven volwassen muizen (8-12 weken) door intraperitoneale (IP) injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) en bevestigen dat de muis voldoende is verdoofd door knijpen teen van de muis.
    1. Gebruik vet zalf op de ogen van de muis tot droog tijdens het experiment te voorkomen.
  2. Shave fur over de linkerkant van de ribbenkast van de muis.
  3. Voeren endotracheale intubatie van de muis.
  4. Plaats de muis op de intubatie stand een hoek van 70 ° en houd muis plaats door het inhaken van de bovenste snijtanden over een kleine rubberen band aan de bovenkant van de voet.
  5. Zachtjes trekken de tong aan de ene kant het gebruik van botte tang.
  6. Visualiseren strottenhoofd met behulp van een vezeloptische illuminator zwanenhals microscoop.
  7. Plaats endotracheale elastische katheter (21 G) in de luchtpijp.
  8. Bevestigen dat de muis spontaan ademt in een vlotte manier (reguliere 100-150 ademhalingen / min, geen paradoxale of oppervlakkige ademhaling).
  9. Plaats de muis in buikligging onder de dissectie microscoop.
  10. Mechanisch de muis met behulp van een knaagdier ventilator ventileren (150 ademhalingen / min en 7 ml / kg ademvolume).
  11. Count ribben naar intercostale ruimte vinden tussen de 4 e en 5 e rib.
  12. Maak een steriel veld over het gebied by grondig afvegen met alcohol en povidonjood. Bedek het chirurgische veld voldoende met een steriele chirurgische doek.

3. Mouse Chirurgie

  1. Na lokale injectie van 0,25% bupivacaïne (200 pl) in de huid, maken een dwarse incisie (ongeveer 1 cm lang) via intercostale ruimte met Prepareerschaar.
  2. Na injectie van 0,25% bupivacaïne (200 pl) in de intercostale spieren, maak een spier incisie tussen de 4 e en 5 e rib met fijne, kleine schaar.
  3. Plaats een ontleden oprolmechanisme tussen de ribben aan de linker long volledig te visualiseren.
    1. Schraap een klein gebied (1 x 1 mm vierkant) van viscerale pleura van het midden van de linker long met fijne pincet.
    2. Pas lichte druk op het gebied met behulp van een steriel wattenstaafje tot bloeden en luchtlekken volledig worden gecontroleerd.
    3. Doe kleine hoeveelheid verse mengsel van fibrinogeen / trombine (fibrine lijm) (stap 1.1.2. 20 & #181; l) in het gebied met behulp van p200 pipet.
  4. Plaats voorzichtig een fibrinegel (stap 1.2) met behulp van kleine tang over het gebied (figuur 1b).
    1. Bevestigen dat de gel goed tijdens ademhalingsbewegingen van de long is gefixeerd op het gebied.
  5. Zorg ervoor dat er geen massale lucht lekken of bloeden uit de longen.
  6. Close insnijdingen (spier- en huidlagen) met absorbeerbare hechtdraad, die niet hoeft te worden verwijderd.
  7. Zuig de borstholte met behulp van 27 G naald en 1 ml spuit om pneumothorax te voorkomen.
  8. Beëindigen mechanische ventilatie.

4. Muis Recovery

  1. Zorg ervoor dat de muis is spontaan ademen op een vlotte manier (reguliere 100-150 ademhalingen / min, geen paradoxale of oppervlakkige ademhaling).
  2. IP Injecteer 1 ml voorverwarmde 0,9% NaCl om uitdroging te voorkomen.
  3. Laat de muis om te herstellen van de circulerende warm water pad.
  4. Verwijder de endotracheal buis na het bevestigen dat de muis heeft stabiele ademhaling.
  5. Injecteer Meloxicam (5 mg / kg, subcutaan (SC), gedurende 3 dagen postoperatieve analgetische.
  6. Controleer de bewegingen van de muis voorzichtig op minimaal 15 min intervallen totdat het borstbeen (kunnen rollen op de buik en rechtop blijven) en bewuste.
  7. Na herstel, terug de muis om een ​​nieuwe kooi geïsoleerd van muizen zonder operatie.
  8. Toezien op de chirurgische site voor tekenen van infectie (roodheid, zwelling, afscheiding), elementaire biologische functies dier (voedsel en water drinken, plassen, ontlasting, gewichtstoename), evenals de klinische tekenen van nood (pilo-erectie, verminderde motoriek) per dag na de chirurgische ingreep.

5. Het oogsten van de Lung

  1. 7 tot 30 dagen na implantatie, euthanaseren de muis met CO 2 via bron van samengeperst gas.
  2. Maak een incisie tussen het uiteinde van xyphoid proces en het borstbeennotch (mediane sternotomie) en oogsten hele long met de geïmplanteerde gel voor histologische en biochemische analyse hierdoor de luchtpijp en ontleden van alle verbindingen met het hart, longen en luchtpijp.
  3. Fix geïmplanteerde gel met long met 4% paraformaldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C, in te bedden in oktober verbinding, en neem seriële stap secties van 30 micrometer dik.
  4. Voeren histologische (hematoxyline en eosinekleuring) en immunohistochemische analyses (endotheel marker: CD31, epitheliale marker: aquaporin (AQP) 5 en surfactant eiwit (SP) -B) met behulp van confocale microscoop 22,37,40.
  5. Stel stapels optische secties (30 um dik) om driedimensionale beelden long endotheel- en epitheelcellen met 3D-beeld analyse software 37 vormen.
  6. Kwantificeren geprojecteerd gebieden van nieuw gevormde bloedvaten met behulp van software voor beeldanalyse 46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om te onderzoeken of gastheer-long afgeleide vasculaire vorming geïncorporeerd in de biomaterialen geïmplanteerd op de longen, fibrine gels aangevuld met belangrijke angiogene factoren VEGF en bFGF (0, 10 en 100 ng / ml elk) werden geïmplanteerd op het oppervlak van levende muis longen gerapporteerd met behulp van Matrigel 22. Fibrinegelen 47 dat deze angiogene groeifactoren bevatten werden vervaardigd zoals getoond in figuur 1a. Na thoracotomie werd een klein gebied van de linker long oppervlak afgeschraapt met behulp van een tang en de gefabriceerde fibrine gel werd ingeplant op de long van de volwassen muis met een kleine hoeveelheid fibrine lijm, die FDA goedgekeurd en wijd gebruikt als een effectief afdichtmiddel stoppen luchtlekken en vermindering van bloedingen bij longchirurgie 48,49 (figuur 1b). De meeste muizen herstelden zonder ernstige respiratoire symptomen (bv, pneumothorax, ademnood). Zeven dagen na implantatie werden de muizen gedood en de longen werden harvested. Geïmplanteerd fibrine gel werd in de gastheer long opgenomen 7 dagen na implantatie (figuur 1c). 3D reconstructie van confocale fluorescentie afbeeldingen blijkt dat gastheer afkomstig CD31-positieve endotheelcellen gevormde vasculaire netwerken in de gels 7 dagen na implantatie in een VEGF / bFGF dosis-afhankelijke wijze (Figuur 2a, c). Type I (AQP5 positief) en type II (SP-B positief) longepitheelcellen werden gerekruteerd langs nieuw gevormde bloedvaten in de gels die waren aangevuld met hogere concentraties van VEGF en bFGF (elk 100 ng / ml) (Figuur 2a) . H & E kleuring van histologische secties gebleken dat andere soorten gastheercellen ook gemigreerd naar de gel 7 dagen na implantatie (figuur 2b). Deze bevindingen suggereren dat gastheer-long afgeleide regeneratieve vasculaire netwerken succesvol geconstrueerd in de fibrine gels die worden aangevuld met angiogene factoren en geïmplanteerd op het oppervlak van volwassen mouse long.

Figuur 1
Figuur 1:. (A) fibrinegel voorbereid vóór implantatie (b) fibrinegel geïmplanteerd over de geschraapt viscerale pleura van de linker long (pijlpunten) (c) Geïmplanteerd fibrinegel (pijlpunten) opgenomen in de gastheer long 7 dagen na de implantatie.. Schaalbalken 1 mm.

Figuur 2
Figuur 2: (a) fluorescentiemicroscopiegrafieken tonen vorming van vasculaire netwerken (CD31 positief; groen) en aangeworven type I (AQP5-positief; magenta) of type II (SP-B positief; magenta) longepitheelcellen binnen het fibrinegel aangevuld met verschillende concentraties VEGF en bFGF (0, 10 en 100 ng / ml elk) 7 dagen na implantatie. Onderbroken lijnen geven de interface tussen geïmplanteerde fibrine gel en gastheer long. Schaalbalk:. 20 pm (b) Licht microfoto van H & E kleuring toont infiltratie van gastheercellen in de fibrinegel 7 dagen na de implantatie. Pijlen geven de interface tussen de gel en gastheer long. Schaal bar: 20 micrometer (c) Grafiek geprojecteerde gebieden van nieuw gevormde bloedvaten in de fibrine gels die worden aangevuld met verschillende concentraties VEGF en bFGF (0, 10 en 100 ng / ml elk) 7 dagen na implantatie..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel introduceert een nieuwe methode om biomaterialen implanteren op de long oppervlak van levende volwassen muis. Met dit systeem wordt gastheer long-afgeleide angiogenese succesvol geïncorporeerd in het materiaal. Dit systeem stelt onderzoekers overspraak staand tussen endotheelcellen, andere cellen (bijvoorbeeld epitheliale cellen, mesenchymale cellen, immuuncellen) en verschillende ECM componenten die nodig zijn voor lokale angiogenese 50-53 en alveolaire regeneratie 24,54. Hoewel conventionele in vivo subcutane hydrogel implantatie is uitgebreid gebruikt voor angiogenese onderzoek 37-39, hoeft deze methoden niet recapituleren orgaan-specifieke angiogenese. Dit systeem, waarbij hydrogel direct geïmplanteerd op het longoppervlak, zal onderzoekers in staat om de rol van de long-specifieke micromilieu in angiogenese en alveolaire regeneratie verkennen in volwassen muizen long. Deze gels kunnen worden vervaardigd uit verschillende ECM-rijke BIOMATErials (bijvoorbeeld collagenen, fibrinen) die kan worden aangevuld met diverse chemische factoren (bijvoorbeeld angiogene factoren, groeifactoren) 55,56, voorlopercellen en / of iPS cellen. Naast chemische factoren, mechanische krachten controle ook angiogenese 23,37. De stijfheid van fibrine gel veranderingen in fibrinogeen concentratie-afhankelijke wijze 57 en manipuleren van de fibrinogeen concentratie kan angiogenese beïnvloeden niet alleen door chemische signalen, maar ook door fysische signalen 58,59. Daarom kan fysicochemische eigenschappen van de fibrine gels moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd fysiologische orgaanspecifieke angiogenese herhalen in de toekomst. Wondgenezing na het afschrapen van de viscerale pleura produceert ook een endogene fibrinestolsel, waarin verschillende soorten gastheercellen omvat en bevordert het genezingsproces en weefselregeneratie. Deze natuurlijke stolsel kan interageren met de exogeen geïmplanteerde fibrinegel, en dus controle angiogenesis in de geïmplanteerde gel. Fluorescent gelabelde fibrinogeen kunnen onderzoekers in staat om onderscheid te maken tussen natuurlijke fibrinestolsel en geïmplanteerd fibrinegel en verken deze mechanismen. Hoewel dit een krachtige methode om angiogenese bij volwassen muizen longen toepassing karakteriseren de studie van longontwikkeling en plagen in neonatale muizen zou waarschijnlijk aanwezig technische uitdagingen.

Het uiteindelijke doel van deze studie is om de functionele bloedvaten in fibrine gels ingeplant op zieke longen te werven en om de matrix te gebruiken als een medisch hulpmiddel om functionele long structuren te herstellen. Mogelijke communicatie tussen gastheercellen en de vasculaire en celstructuren in de gels en de functionaliteit van deze structuren worden onderzocht in toekomstige experimenten. Sinds VEGF niveaus in de longen zijn verminderd bij patiënten met BPS 60 en emfyseem 61, kan het toevoegen van VEGF aan de matrix werving van de bloedvaten in de matrix impl verbeterenanted op deze zieke longen. Mechanische eigenschappen ook verschillen tussen gezonde en zieke longen 23,62. Expressie van matrix metalloproteïnasen en lysyl oxidase, die afbraak en verknoping van collagenen controle respectievelijk worden veranderd in verschillende longziekten zoals COPD en longfibrose 63-67. In zieke longen worden bepaalde lijnen van progenitors long- endotheel- en epitheelcellen verarmd 68. Aldus manipuleren deze factoren (angiogene factoren, ECM, ECM stijfheid) of implanteren fibrinegelen aangevuld met progenitorcellen 69 zal waarschijnlijk leiden tot de vorming van functionele bloedvaten binnen de matrix en herstel van longfunctie bij verschillende pathologische condities. Omdat chemische factoren kunnen worden aangevuld in de fibrinegelen lokale angiogenese moduleren, kan dit systeem ook worden gebruikt staand specifieke omgevingsfactoren die zieke longen bij chronische longziekten kan normaliseren. Kortom, dit artikel introduceert een methode om fibrine hydrogel implantaat op de long oppervlak van levende muis, die onderzoekers in staat stelt long-specifieke angiogenese karakteriseren in vivo. Wijziging van diverse factoren (bijv tijdsverloop, concentraties en combinaties van angiogene factoren, verschillende soorten hydrogels, fysicochemische eigenschappen van de hydrogels) in dit systeem, onthult de mechanismen van angiogenese en regeneratie in de longen. Zo zal dit systeem aanzienlijk wetenschappelijke kennis van de fundamentele vasculaire biologie, tissue engineering, evenals pulmonale geneeskunde te bevorderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de American Heart Association (AM), het Amerikaanse ministerie van Defensie (BC074986), en Boston Children's Hospital faculteit Career Development Fellowship (TM, AM). De auteurs danken Amanda Jiang en Elisabeth Jiang voor technische ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
21 G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Abcam AB40876 Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
  2. Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
  3. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
  4. Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
  5. Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
  6. De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
  7. Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
  8. Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
  9. Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
  10. Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
  11. Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
  12. Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
  13. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
  17. Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
  18. McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
  19. White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
  20. Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
  21. Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
  22. Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
  23. Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
  24. Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
  25. Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
  26. Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
  27. Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
  28. Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
  29. Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
  30. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  31. Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
  32. Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
  33. Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
  34. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
  35. Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
  36. Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
  37. Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
  38. Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
  39. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  40. Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
  41. Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
  42. Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
  43. Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
  44. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
  45. Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
  46. Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
  47. Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
  48. Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
  49. Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
  50. Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
  51. Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
  52. Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
  53. Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
  54. Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
  55. Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
  56. Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
  57. Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
  58. Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
  59. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
  60. Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
  61. Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
  62. Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
  63. Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
  64. Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
  65. Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
  66. Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
  67. Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
  68. Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
  69. Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).

Tags

Basis protocol long- angiogenese regeneratie fibrine gel implantatie micro-omgeving
Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mammoto, T., Mammoto, A.More

Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter