Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Implantation av fibringel på Mus Lung att studera Lung specifika angiogenes

Published: December 21, 2014 doi: 10.3791/52012
Automatic Translation
1, 1
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

Abstract

Nya betydande framsteg inom stamcellsforskning och bioteknik tekniker har gjort stora framsteg i att utnyttja biomaterial att regenerera och reparera skador i enkla vävnader i ortopediska och parodontala fält. Men försök att regenerera de strukturer och funktioner mer komplexa tredimensionella (3D) organ som lungor har inte varit mycket framgångsrik eftersom de biologiska processerna i organregenerering inte har väl utforskat. Det blir tydligt att angiogenes, bildandet av nya blodkärl, spelar nyckelroller i organregenerering. Nybildade vasculatures inte bara leverera syre, näringsämnen och olika cellkomponenter som krävs för organregenere men också ge instruktiva signaler till de regenererande lokala vävnader. Därför att framgångsrikt regenerera lungorna i en vuxen, är det nödvändigt att rekapitulera lungspecifika mikromiljöer där angiogenes enheter regenerering av lokala lungvävnader. Även conventional in vivo angiogenes analyser, såsom subkutan implantation av extracellulär matris (ECM) -rika hydrogeler (t.ex., fibrin eller kollagengeler eller Matrigel - ECM proteinblandning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller), är i stor utsträckning används för att utforska generella mekanismer för angiogenes, lungspecifika angiogenes har inte väl karakteriserade eftersom metoder för orthotopic implantation av biomaterial i lungan inte har väl etablerade. Målet med detta protokoll är att införa en unik metod för att implantera fibringel på lungytan levande vuxen mus, vilket möjliggör en framgångsrik rekapitulation av värd lung-derived angiogenes inne gelen. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att undersöka de mekanismer genom vilka lungan specifika mikromiljö kontrollerar angiogenes och alveolär förnyelse i både normala och patologiska tillstånd. Eftersom implanterade biomaterial release och leverera fysikaliska och kemiska signaler till intilliggande lUNG vävnader, kan implantation av dessa biomaterial på sjuka lungan potentiellt normalisera de intilliggande sjuka vävnader, som gör det möjligt för forskare att utveckla nya behandlingsmetoder för olika typer av lungsjukdomar.

Introduction

Det övergripande målet med detta protokoll är att införa en metod för att implantera fibringel på lungytan vuxen mus, vilket gör det möjligt för forskarna att karakterisera de molekylära mekanismerna för lung vaskulära och alveolär utveckling, och för att utnyttja denna kunskap för att utveckla biomimetiska material kapabla av rekapitulera fysiologisk lungkärl och alveolär formation för att behandla olika lungsjukdomar.

Mer än 35 miljoner amerikaner lider av kroniska lungsjukdomar, inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom och lungfibros. Dessa patienter har långvariga kroniska luftvägssymtom såsom andnöd, tryck över bröstet, tjat hosta och trötthet, som avsevärt inskränker deras dagliga liv 1-3. Trots en stor mängd arbete med att utveckla effektiva behandlingar för dessa lungsjukdomar, för närvarande finns det inget botemedel; Därför är dålig och ekonomiskt livskvaliteten för dessa patienter och mänskliga kostnaderna är high 4-7. För närvarande är lungtransplantation det enda sättet att rädda patienter med gravt kronisk lungsjukdomar. Men på grund av bristen på transplantationsdonatorer, höga kostnader, allvarliga komplikationer, och låg överlevnad 8-11, är transplantation inte ett optimalt förhållningssätt. Senaste snabba framsteg inom vävnadsingenjörsteknik har gjort det möjligt för forskare att bioengineer implanterbar lungan genom återinplantering decellulariserad hela lungan med olika typer av stamceller eller inducerade pluripotenta stam (iPS-celler) 12,13. Men dessa bioengineered lungor är funktionella i värddjur endast under flera timmar efter implantation 12,14,15. Använda biomaterial att regenerera de komplexa strukturer och funktioner hos lungor har också varit ganska misslyckat. Detta kan bero på att viktiga biologiska processer som styr vuxen lung förnyelse inte har väl utforskat. I lungan, är en av de tidigaste och viktigaste händelserna duri bildningen av kärlsystemetng utveckling och förnyelse 16-21. Nybildade vasculatures i lungan inte bara leverera syre, näringsämnen och olika cellkomponenter som krävs för organbildning, men också ge instruktiva regulatoriska signaler till omgivande celler 22-25. Således spelar angiogenes nyckelroller i regenerativ alveolarization hos vuxna lungor 24,26,27. Dessutom bidrar avreglerad angiogenes till kroniska lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) 28, bronkopulmonell dysplasi (BPD) 21-23, och lungfibros 29. Således, för att utveckla effektivare strategier för ingenjörs lungorna eller behandla kroniska lungsjukdomar, är det nödvändigt att förstå de grundläggande mekanismerna för lungspecifika angiogenes.

Varje orgel visar unika mekaniska och kemiska egenskaper, som kan skilja mellan fysiologiska och patologiska tillstånd 30-33. Dessa organspecifika microenvironment reglerar endotel beteenden och orkestrera vaskulär nätverksbildning i ett organ specifikt sätt 24,34-36. Således, för att utveckla effektivare strategier för lung regeneration, mekanismen bakom lungspecifika angiogenes måste förstås. Medan konventionella in vivo angiogenes analyser såsom subkutan hydrogel implantation har använts i stor utsträckning för angiogenes forskning 37-39, gör dessa metoder inte rekapitulera organspecifika angiogenes. Nyligen har en ny metod för att implantera Matrigel i en elastisk mögel på muslunga utvecklats och visat att framgångsrikt rekrytera blodkärl och lungepitelceller i gelerna 22. Denna unika metod gör det möjligt för forskare att undersöka mekanismen av lungspecifika angiogenes och samspel mellan blodkärl och icke-vaskulära lungceller i fysiologiska och patologiska tillstånd. Sedan 1) Matrigel är inte lämplig för klinisk tillämpning; 2) eLastic mögel används för att gjuta gelen kan påverka samspelet mellan hydrogeler och värdlungvävnad och 3) den elastiska mögel på lungan orsakar potentiellt nedsatt lungfunktion och smärta vid andning, som ett mer kliniskt relevant strategi, en 3D fibrin matris innehållande angiogena faktorer (vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) / basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF)) har implanterats på muslungan utan gjutning i den elastiska formen, och har framgångsrikt rekapituleras värd lunga härrörande angiogenes. Fibringelen, polymer fibriller genererade från trombin-kluvna fibrinogen, är känd för att fånga en mängd olika angiogena faktorer såsom bFGF och VEGF att påskynda angiogenes in vivo 40,41. På grund av dess regenerativ förmåga och bionedbrytbara natur 42, är fibringel ofta används inom området för vävnadsteknik.

Denna artikel införs ett nytt och unikt sätt att implantera fibringel på lungytan levande adult mus och visar att värd lung-derived angiogenes rekapituleras inuti geler in vivo. Denna metod, som gör det möjligt för forskare att studera lungspecifika angiogenes, sannolikt kommer att leda till utveckling av nya behandlingsmetoder för olika typer av lungsjukdomar och betydligt vidare ansträngningar för att framgångsrikt regenerera vuxen lunga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: in vivo djurstudie genomfördes i strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet har granskats och godkänts av Animal Care och användning kommittén i Boston Barnsjukhus (Protokoll Numbers: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Alla läkemedel som används i detta protokoll är farmaceutisk kvalitet och dessa läkemedel bereds under sterila förhållanden.

1. fibringel Framställning

  1. Förbered fibringel som innehåller VEGF och bFGF.
    1. Tina stamlösningar av fibrinogen och trombin som lagras vid -80 ° C till rumstemperatur (25 ° C).
    2. Lägg trombin (slutkoncentration: 2,5 U / ml), CaCl2 (slutlig koncentration: 45 mM), VEGF (slutkoncentration: 0-100 ng / ml) och bFGF (slutkoncentration: 0-100 ng / ml) till fibrinogen lösning (slutlig koncentration: 12,5 mg / ml i 0,9% sodium kloridlösning 43-45) i ett 1,5 ml rör.
    3. Blanda försiktigt genom att pipettera.
    4. Pipett försiktigt 200 pl av blandningen på en steril plastskål i ett droppvis mode använder p200 pipettspetsen.
    5. Inkubera droppar vid 37 ° C under 30-60 min tills de stelnar.
      OBS: Den stelnade gelén kan förvaras i det förslutna plastskål vid rumstemperatur (25 ° C) under flera timmar före implantering (Figur 1a).
  2. Trimma fibringelen i ca 3 x 3 x 3 mm kuber med små kirurgiska saxar före implantation.

2. Mus Framställning

  1. Bedöva vuxen mus (8-12 veckor) efter intraperitoneal (IP) injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) och kontrollera att musen är tillräckligt sövd genom att nypa tån på musen.
    1. Använd veterinär salva på ögonen på musen för att förhindra torrhet under experimentet.
  2. Rakning fur över vänster sida av bröstkorgen på musen.
  3. Utför endotrakeal intubation av musen.
  4. Placera musen på intubering stå vinklade vid 70 ° och håll musen på plats genom att haka dess övre framtänderna över en liten gummiband som ligger högst upp på stativet.
  5. Dra försiktigt tungan åt sidan med trubbiga pincett.
  6. Visualisera struphuvudet med hjälp av en fiberoptisk svanhals mikroskop belysningen.
  7. Infoga endotrakeal elastisk kateter (21 G) in i luftstrupen.
  8. Kontrollera att musen är spontant andas på ett smidigt sätt (vanlig 100-150 andetag / min, ingen paradoxala eller ytlig andning).
  9. Placera musen i liggande ställning under dissektion mikroskop.
  10. Mekaniskt ventilera musen med en gnagare ventilator (150 andetag / min och 7 ml / kg tidalvolym).
  11. Räkna revben att lokalisera interkostalrummet mellan 4: e och 5: e revbenet.
  12. Skapa ett sterilt område över området by noggrant torka ner med alkohol och povidon-jod. Täck operationsområdet adekvat med en steril operationsduk.

3. Mus Kirurgi

  1. Efter lokal injektion av 0,25% bupivakain (200 l) i huden, gör en tvärgående snitt i huden (ca 1 cm längd) över interkostalrummet använder dissekera sax.
  2. Efter injektion av 0,25% bupivakain (200 l) i interkostal muskler, gör en muskel snitt mellan 4: e och 5: e revbenet med fina små saxar.
  3. Sätt i en dissekera upprullningsdon mellan revbenen att helt visualisera den vänstra lungan.
    1. Skrapa ett litet område (1 x 1 mm) av visceral lungsäcken i mitten av vänstra lungan med fin pincett.
    2. Tryck lätt på området med hjälp av en steril bomullspinne tills blödning och luftläckage är helt kontrollerad.
    3. Sätt mindre mängd ny blandning av fibrinogen / trombin (fibrinlim) (steg 1.1.2. 20 & #181; l) över området med hjälp av p200 pipettspetsen.
  4. Placera försiktigt en fibringel (steg 1.2) med hjälp av små pincett över området (Figur 1b).
    1. Bekräfta att gelén är väl fixerad på området under respiratoriska rörelser av lungan.
  5. Se till att det varken finns massiva luftläckage eller blödning från lungan.
  6. Stäng snitt (muskel och hudlagren) med absorber sutur, som inte behöver tas bort.
  7. Sug brösthålan använder 27 G nål och 1 ml spruta för att förhindra pneumothorax.
  8. Avsluta mekanisk ventilation.

4. Mus Återhämtning

  1. Kontrollera att musen är spontant andas på ett smidigt sätt (vanlig 100-150 andetag / min, ingen paradoxala eller ytlig andning).
  2. IP injicera 1 ml förvärmda 0,9% NaCl för att förhindra uttorkning.
  3. Låt musen för att återhämta sig på cirkulerande varmvatten pad.
  4. Avlägsna endotracheal röret efter att ha bekräftat att musen har en stabil andning.
  5. Spruta Meloxikam (5 mg / kg, subkutan injektion (SC), i 3 dagar som postoperativ smärtstillande.
  6. Övervaka förflyttningar av musen försiktigt vid minst 15 minuters intervall tills det är sternala (kan rulla över på sin mage och förblir upprätt) och medveten.
  7. Efter återhämtning, tillbaka musen till en ny bur isolerats från möss utan kirurgi.
  8. Övervaka operationsområdet för tecken på infektion (rodnad, svullnad, urladdning), djurets grundläggande biologiska funktioner (mat och vatten intag, urinering, avföring, viktökning) samt kliniska tecken på stress (piloerektion, minskad rörelseförmåga) dagligen efter kirurgiskt ingrepp.

5. Skörd av Lung

  1. 7-30 dagar efter implantation, euthanize musen med CO 2 via källa med komprimerad gas.
  2. Gör ett snitt mellan spetsen på xyphoid processen och sternalanotch (median sternotomi) och skörd hela lungan med implanterade gelen för histologisk och biokemisk analys genom att skära av luftstrupe och dissekera alla anslutningar till hjärta, lungor och luftstrupe.
  3. Fix implanterade gel med lunga med 4% paraformaldehydlösning över natten vid 4 ºC, bädda i OCT förening, och ta serie steg sektioner av 30 um tjocklek.
  4. Utför histologiska (hematoxylin och eosin färgning) och immunhistokemiska analyser (endotel markör: CD31, epitelial markör: aquaporin (AQP) 5 och surfaktantprotein (SP) -B) använder konfokalmikroskop 22,37,40.
  5. Samman staplar av optiska sektioner (30 ^ m tjock) för att bilda tre-dimensionella bilder av lung endotel- och epitelceller använder 3D mjukvara för bildanalys 37.
  6. Kvantifiera projicerade områdena nybildade blodkärl som använder bildanalys programvara 46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att undersöka huruvida värd lunga härrörande kärlbildning rekapituleras innanför biomaterialen implanteras på lungan, fibringeler kompletterat med större angiogen faktorer VEGF och bFGF (0, 10 och 100 ng / ml vardera) implanterades på ytan av levande muslungor som rapporteras med Matrigel 22. Fibringeler 47 som innehåller dessa angiogena tillväxtfaktorer tillverkades såsom visas i fig 1a. Efter torakotomi, var ett litet område av den vänstra lungan ytan skrapas med pincett och fabricerade fibringelen implanterades på lungan av den vuxna musen med hjälp av en liten mängd fibrinlim, som är godkända av FDA och i stor utsträckning som ett effektivt tätningsmedel för att stoppa luftläckage och minska blödning i lungkirurgi 48,49 (Figur 1b). De flesta möss återhämtade sig utan allvarliga andningssymtom (t.ex. pneumothorax, andnöd). Sju dagar efter implantationen, möss avlivades och lungor var harvested. Implanterad fibringel införlivades i värd lungan 7 dagar efter implantation (fig 1c). 3D-rekonstruktion av konfokal fluorescensbilder har visat att värdhärledda CD31-positiva endotelceller bildade vaskulära nätverk inuti gelerna 7 dagar efter implantering i en VEGF / bFGF dosberoende sätt (figur 2a, c). Typ I (AQP5 positiv) och typ II (SP-B positiva) lungepitelceller rekryterades också längs nybildade blodkärl inuti geler som kompletterades med högre koncentrationer av VEGF och bFGF (vardera 100 ng / ml) (Figur 2a) . H & E-färgning av histologiska snitt avslöjade att andra typer av värdceller migrerade också in i gelén 7 dagar efter implantation (fig 2b). Dessa resultat tyder på att värdlung-härledda regenerativa vaskulära nätverk framgångsrikt konstruerat inuti fibringeler som kompletteras med angiogena faktorer och implanterade på ytan av vuxen mouSE lunga.

Figur 1
Figur 1:. (A) fibringel förberett före implantation (b) fibringel implanteras över skrapade visceral lungsäcken i vänster lunga (pilspetsar) (c) implanterad fibringel (pilspetsar) införlivas i värd lungan 7 dagar efter implantation.. Skala barer 1 mm.

Figur 2
Figur 2: (a) Fluorescence mikrografier som visar bildningen av vaskulära nätverk (CD31 positiv; grön) och rekryterade typ I (AQP5-positiv; magenta) eller typ II (SP-B positiv; magenta) lungepitelceller inuti fibringelen kompletterat med olika koncentrationer av VEGF och bFGF (0, 10 och 100 ng / ml vardera) 7 dagar efter implantering. Streckade linjer visar gränssnittet mellan implanterade fibringel och värd lunga. Skala bar:. 20 pm (b) Ljus mikroskop av H & E färgning visar infiltration av värdceller i fibringelen 7 dagar efter implantation. Pilar indikerar gränssnittet mellan gelén och värd lunga. Skala bar: 20 pm (c) Diagram som visar projicerade områden nybildade blodkärl i fibringeler som kompletteras med olika koncentrationer av VEGF och bFGF (0, 10 och 100 ng / ml vardera) 7 dagar efter implantation..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna artikel introducerar en ny metod för att implantera biomaterial på lungytan levande vuxen mus. Med detta system är värd lung-derived angiogenes framgångsrikt rekapituleras inuti materialet. Detta system gör det möjligt för forskare att utforska överhörning mellan endotelceller, andra celler (t.ex., epitelceller, mesenkymala celler, immunceller) och olika ECM-komponenter som krävs för lokal angiogenes 50-53 och alveolär regenere 24,54. Även konventionella in vivo subkutan hydrogel implantation har använts i stor utsträckning för angiogenes forskning 37-39, gör dessa metoder inte rekapitulera organspecifika angiogenes. Detta system, där hydrogel implanteras direkt på lungytan, gör det möjligt för forskare att utforska roller lungan specifika mikromiljö i angiogenes och alveolär förnyelse i vuxen mus lunga. Dessa geler kan tillverkas från olika ECM-rika BIOMATErial (t.ex. kollagener, fibriner) som kan kompletteras med olika kemiska faktorer (t.ex. angiogena faktorer, tillväxtfaktorer) 55,56, progenitorceller och / eller iPS-celler. Förutom kemiska faktorer, mekaniska krafter styr också angiogenes 23,37. Styvheten av fibrin gel förändringar i ett fibrinogen koncentrationsberoende sätt 57 och manipulera fibrinogenkoncentration kan påverka angiogenes inte bara genom kemiska signaler utan även genom fysiska signaler 58,59. Därför kan fysiokemiska egenskaper hos fibringeler måste optimeras noggrant för att rekapitulera fysiologisk organspecifik angiogenes i framtiden. Sårläkning efter skrapningen den viscerala lungsäcken producerar också en endogen fibrinkoagel, vilket inkluderar olika typer av värdceller och främjar läkningsprocessen och vävnadsregenerering. Denna naturliga koagel kan interagera med exogent implanterade fibringelen, och därmed styra angiouppkomst i den implanterade gelén. Fluorescerande fibrinogen kan ge forskarna möjlighet att skilja mellan naturliga fibrinkoagel och implanteras fibringel och utforska dessa mekanismer. Även om detta är en kraftfull metod för att karaktärisera angiogenes i vuxna muslungor, tillämpning på studiet av lungutveckling och sjukdomar hos neonatala möss skulle sannolikt nuvarande tekniska utmaningar.

Det yttersta målet med denna studie är att rekrytera funktionella blodkärl i fibringeler implanterade på sjuka lungor och att använda matrisen som en medicinteknisk produkt för att återställa funktionella lungstrukturer. Möjliga kommunikation mellan värdceller och kärl och alveolära strukturer inne gelerna samt funktionaliteten hos dessa strukturer bör undersökas i framtida experiment. Eftersom VEGF-nivåer i lungorna minskar hos patienter med BPD 60 och emfysem 61, kan lägga VEGF till matrisen förbättra rekryteringen av blodkärl i matris implanted på dessa sjuka lungor. Mekaniska egenskaper skiljer sig också mellan friska och sjuka lungor 23,62. Till exempel, uttryck av matrismetalloproteinaser och lysyloxidas, som styr nedbrytning och tvärbindning av kollagen respektive förändras i olika lungsjukdomar inklusive KOL och lungfibros 63-67. I sjuka lungor, är vissa linjer av stamceller för lung endotel och epitelceller utarmat 68. Således, manipulera dessa faktorer (angiogena faktorer, ECM, ECM stelhet) eller implantering fibringeler kompletterat med progenitorceller 69 kommer sannolikt att leda till bildandet av funktionella blodkärl inuti matrisen och återhämtning av lungfunktionen hos olika patologiska tillstånd. Eftersom kemiska faktorer kan kompletteras inuti fibringeler att modulera lokal angiogenes, kan detta system även användas utforska särskilda miljö ledtrådar som kan normalisera sjuka lungor i kroniska lungsjukdomar. Sammanfattningsvis artikeln införs en metod för att implantera fibrin hydrogel på lungytan levande mus, vilket gör det möjligt för forskarna att karakterisera lungspecifika angiogenes in vivo. Modifiering av olika faktorer (t.ex., tidsförloppet, koncentrationer och kombinationer av angiogena faktorer, olika typer av hydrogeler, fysikalisk-kemiska egenskaper av hydrogeler) i detta system, kommer att avslöja mekanismerna för angiogenes och regenerering i lungan. Således kommer detta system avsevärt påskynda vetenskaplig kunskap om grundläggande vaskulär biologi, vävnadsteknik, samt lungmedicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), och Boston Barnsjukhus fakultetskarriärutvecklingsFellowShip (TM, AM). Författarna tackar Amanda Jiang och Elisabeth Jiang för tekniskt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
21 G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Abcam AB40876 Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
  2. Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
  3. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
  4. Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
  5. Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
  6. De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
  7. Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
  8. Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
  9. Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
  10. Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
  11. Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
  12. Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
  13. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
  17. Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
  18. McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
  19. White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
  20. Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
  21. Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
  22. Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
  23. Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
  24. Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
  25. Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
  26. Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
  27. Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
  28. Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
  29. Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
  30. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  31. Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
  32. Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
  33. Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
  34. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
  35. Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
  36. Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
  37. Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
  38. Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
  39. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  40. Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
  41. Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
  42. Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
  43. Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
  44. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
  45. Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
  46. Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
  47. Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
  48. Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
  49. Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
  50. Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
  51. Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
  52. Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
  53. Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
  54. Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
  55. Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
  56. Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
  57. Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
  58. Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
  59. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
  60. Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
  61. Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
  62. Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
  63. Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
  64. Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
  65. Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
  66. Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
  67. Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
  68. Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
  69. Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).

Tags

Grundläggande protokoll lunga angiogenes regeneration fibrin gel implantation mikromiljö
Implantation av fibringel på Mus Lung att studera Lung specifika angiogenes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mammoto, T., Mammoto, A.… More

Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter