Summary
Hjernen er et unikt sted med kvaliteter, der ikke er godt repræsenteret ved in vitro eller ektopiske analyser. Ortotopisk musemodeller med reproducerbare beliggenhed og vækstkarakteristika pålideligt kan oprettes med intrakranielle injektioner ved hjælp af en stereotaktisk fiksering instrument og et lavt tryk sprøjte pumpe.
Abstract
Ortotopisk tumor modeller er i øjeblikket den bedste måde at studere karakteristika en tumortype, med og uden indgriben i forbindelse med et levende dyr - især på steder med unikke fysiologiske og arkitektoniske kvaliteter, såsom hjernen In vitro og ectopiske modeller ikke kan. redegøre for funktioner såsom vaskulatur, blod-hjerne-barrieren, stofskifte, drug delivery og toksicitet, og et væld af andre relevante faktorer. Orthotopisk modeller har deres begrænsninger også, men med ordentlig teknik tumorceller af interesse kan nøjagtigt indpodet væv, der mest nøje efterligner forholdene i den menneskelige hjerne. Ved at anvende metoder, der leverer præcist afmålte mængder til præcist definerede steder på en konsekvent hastighed og tryk, musemodeller af humane hjernetumorer med forudsigelige vækstrater kan reproducerbart skabt og er egnet til pålidelig analyse af forskellige interventioner. Protokollen beskrevet her fokuserer på technical detaljer designe og forberede en intrakraniel injektion, der udfører operationen, og at sikre en vellykket og reproducerbar tumorvækst og giver udgangspunkter for en række forhold, der kan tilpasses til en række forskellige hjerne tumor-modeller.
Introduction
In vitro studier af hjernens tumorceller er uvurderlige for dissekering molekylære mekanismer, der skaber vækst, overlevelse, migration og invasion af kræftceller; dyrkede celle eksperimenter kan definere signalveje, foreslår potentielle terapeutiske mål, og karakterisere cellulære respons på lægemiddelbehandling. Men in vitro-systemer er alt for forenklet at forudsige organismal reaktion til lægemidler; de mangler de fysiologiske reaktioner, immunrespons, celle mikromiljø og samlet heterogenitet af levende dyr-systemer. Gensplejsede modeller kan være uvurderlige, når de er tilgængelige, men der findes molekylære forskelle mellem arter og murine celler ikke rekapitulere begivenheder i menneskelige processer, hvilket resulterer i betydelige uoverensstemmelser, når man sammenligner dyremodeller til kliniske observationer 1. Mus xenograftmodeller involverer subkutan (SQ) injektion af humane hjerne tumor cellelinier under huden på flanken er nemme at udføreog måle; de kan bruges til at behandle virkningerne af gen-modifikation and Drug Administration / levering, metabolisme og toksicitet. Væsentlige ulemper begrænser imidlertid anvendeligheden af SQ-modeller. Mikromiljø ikke rekapitulere det af en naturligt forekommende hjernesvulst: samspillet mellem forskellige celletyper og væv; den lokale vaskulatur, og talrige andre faktorer unikke for hjernen ikke kan gentages. For mere præcist at reproducere den unikke miljø i et naturligt forekommende hjernetumor og afprøve virkningerne af farmaceutiske indgreb bør en mus orthotopisk model anvendes. Desuden kan ortotopisk teknikker anvendes som en del af, hvor humane primære ikke-kræft celler (differentieret eller stamfader) en genetisk manipuleret tilgang er genetisk modificeret, og injiceres i den relevante stedet for en mus, med eller uden menneskelig stroma celler, hvilket resulterer i tumorigenese svarende til den, der ses hos mennesker 1.
Denne artikel beskriveren metode til præcist og reproducerbart skabe hjernesvulster hos mus. Ved hjælp af denne teknik, kan brugeren nøjagtigt indsprøjte en lille portion af suspenderede celler i en bestemt placering af frontoparietale parieto-temporale region af muse hjernebarken. Dødelighed Mouse er ekstremt lavt; i vores hænder, har ingen mus døde af kirurgiske komplikationer efter 185 procedurer. Karakteristik af den resulterende tumor kan sammenlignes med typiske humane kliniske tumorer; for eksempel: hurtige vækst, graden af nekrose, omfanget af invasion, heterogenitet celletype, tilstedeværelse af mitotiske celler, markører for proliferation og apoptose mv cellelinjer eller disaggregerede humant væv eller tumor prøver kan så blive vurderet på grundlag af deres evne at simulere faktiske kliniske præsentation. Pharmaceuticals, valgt baseret på deres præstation i cellekultur, kan afprøves i forbindelse med et velfungerende stofskifte, kredsløbssygdomme, og blod-hjerne-barrieren, som de eksisterer i et dyr belastet witha tumor, alt sammen i et relevant arkitektonisk sammenhæng. Desuden kan cellerne valgt til injektion være genetisk modificeret til at undersøge effekten af specifikke knockdowns, sletninger, knock-ins, mutationer, etc. på tumorvækst og overlevelse.
En række publikationer dokumenterer tumorer undersøgelser under anvendelse af en række intrakranielle teknikker. Yamada et al. Gjorde en detaljeret undersøgelse af injektion af farvestof og U87-celler og fandt, at minimere volumen og injektion sats produceret den bedste tumor 2. . Brooks et al fundet overlegen reproducerbarhed og effektivitet ved hjælp af en mikroprocessorstyret injektor snarere end en manuel metode til at levere virale vektorer; deres konklusioner vedrørende optimale indsprøjtning parametre gælder for celle levering 3. Shankavaram et al. Viste, glioblastoma multiforme (GBM) cellelinier injiceret orthotopisk (ved hjælp af en manuel metode) i hjernen gentaget genekspressionsprofilen af clinical tumorer tættere end enten in vitro eller SQ xenografterne støtte brugen af intrakranielle modeller for prækliniske studier 4. Giannini et al. Injicerede celler fra humane kirurgiske prøver, der var blevet opretholdt i flankerne af nøgne mus ved seriepassage i hjernen på yderligere mus, og viste, at denne fremgangsmåde konserveret patientens tumor genændringer i modellen 5. Lignende resultater blev rapporteret af Yi et al 6. Ved hjælp af en stereotaktisk opsætning, defineres omhyggeligt injektionsstedet, og en langsom og støt injektion hastighed, de har opnået reproducerbare hjernetumorer med ensartede vækstrater og høj (100%) transplantation sats. Validiteten af denne teknik er derfor blevet veletableret; en litteratursøgning tyder på, at anvendelser af denne teknik er omfattende. Carty et al. Anvendes intrakranielle injektioner med succes levere virale vektorer, der udtrykker terapeutiske gener i den frontale cortex transgenic model for Alzheimers sygdom 7. Thaci et al. Beskrevet anvendelsen af intrakranielle injektioner til at levere terapeutiske onkolytisk adenovirus i en neural stamcelle baserede luftfartsselskab i nøgne mus, der allerede bærer orthotopisk injicerede GBM tumorer 8. Det er klart, intrakranielle injektioner er en alsidig og effektivt værktøj til præklinisk forskning. Tidligere publikationer i Journal of visualiserede Eksperimenter beskriver grundlæggende tilgange 9-11, men vi tager begrebet intrakraniel tumor indsprøjtning og ortotopisk modellering til en højere grad af præcision ved hjælp af let-til-mester-teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne procedurer blev gennemgået og godkendt af vores institutionelle dyrepleje og brug udvalg.
1. Planlæg Experiment
- Vælg celler, der skal injiceres. Celler fra en række kilder er kandidater til injektion: vedhængende cellekultur linjer, genetisk modificerede kloner, neurosfæreceller celler, primære kulturer eller opdelte tumorer. Den type model ønskes, vil definere den mest hensigtsmæssige injektionsstedet.
- Bestem celle nummer til injektion. Antallet af celler, der kræves til at danne tumorer varierer med cellelinie og skal bestemmes empirisk; tumorvæksthastighed stærkt afhængig af celletype, celleantal og vævskultur passage nummer. Cell tal fra 1 x oktober 4-2 x 10 5 eller mere pr injektion har produceret tumorer af varierende vækstrater.
- Begræns mængden til injektion. Cellerne bør suspenderes i den mindste mængde af serum frie medier eller phosphatbufrede saline (PBS), der giver mulighed for jævn, let passage gennem en 26 G nål. Jo mindre volumen, der faktisk leveres til hjernen, mere præcise og defineret den resulterende tumor; optimale resultater opnås ved at indsprøjte volumen spænder fra 3. til 6. pi. Plan at udarbejde en endelig samlet volumen på mindst 50 pi suspenderede celler, uanset antallet af injektioner planlagt at tillade nøjagtig måling, blanding og prøveudtagning.
- Vælg passende mus for modellen. Murine modeller af humane tumorer anvender typisk unge immunsvækkede mus for at undgå immunmedieret afstødning. Det er ikke nødvendigt for det arbejde, der finder sted i et biologisk sikkerhedsskab, hvis der træffes passende forholdsregler, herunder dekontaminering, desinfektion og sterilisering af materialer og udstyr. Den her viste arbejde er blevet gjort i athymiske nøgne mus, mandlige og kvindelige, mellem 6 og 12 ugers alderen. Mus, der vejer mindre end 20 g kan være vanskeligt at placere på somtereotaxic ramme og kan være mere modtagelige for hypotermi.
2. Saml Udstyr
- Anskaf og rense en mus stereotaktisk ramme, justering konsol og mus gas anæstesi hoved indehaveren, mikrosprøjte pumpe, varmepude, anæstesi maskine, fiberoptiske arbejdslampe, og variabel hastighed boremaskine. Rens og rense alt udstyr.
- Programmere injektion parametre (herunder injektion volumen, flow, rente enheder sprøjte type) og andre variabler, der er nødvendige for driften af sprøjtepumpen. Optimer indstillingerne for hver enkelt model.
BEMÆRK: I disse injektioner indstillingerne var 3.000 nl prøver med en hastighed på 400 nl / min (rate enheder "M") ved hjælp af en 25 ul sprøjte (Device Type "E") i den ikke-grupperede ("N") tilstand. - Rengør en præcision mikrosprøjte med 26 G kanyle med flere skylninger sterilt deioniseret vand (DIH 2 O) og 70% ethanol (EtOH), laver en endelig riNSE med DIH 2 O. Nogle, men ikke alle modeller er designet til at blive autoklaveret. Sørg for, at stemplet bevægelsen er jævn og fri.
- Opnå anæstesi levering udstyr. Isofluran er det foretrukne bedøvelsesmiddel, som det er let at regulere graden og varigheden af anæstesi. Sørg for, at stereotaktisk enhed er udstyret med en vedhæftet fil med musen anæstesi gas og at den nødvendige slanger og konnektorer er på plads for at levere gasblandingen fra anæstesiapparatet til musen.
- Autoklave kirurgiske værktøjer, herunder fin spids saks, to pincet / hemostats (med tænder) for suturering, mellemstore saks, mellemlang og fin spids pincet, og mindst to 1 mm dental borekroner. Hold instrumenter ren under proceduren med 70% EtOH, desinfektionsmiddel, eller en perle sterilisator.
- Opnå isofluran, analgetisk, oftalmisk salve / smøremiddel, antibiotisk salve, saltvand, 30% hydrogenperoxid (H 2 O 2), antiseptisk og knoglevoks (om ønsket) fra enveterinær eller medicinsk forsyning. Forbered steril DIH 2 O og 70% EtOH. Engangsartikler såsom gaze puder, sterile forbindinger, suturer, ethanol vatpinde, bomuld tippes podninger, sterile kirurgiske handsker, kirurgiske knive og mere er inddelt i listen materialer. Et fint tip permanent markør til mærkning kraniet skal dekontamineres og dedikeret til kirurgisk brug.
3. Forbered Celler til injektion
- I forsøgene er vist her, skal du vælge en udødeliggjort human GBM cellelinje. Bestem antallet af celler (2 x 10 5), og mængden af suspension, der skal injiceres (3 ul) empirisk; detaljer kan variere med celletypen. Brug et rumfang på mindst 50 pi at lette nøjagtig måling, blanding og injektion.
- Trypsinisér celler og resuspender i medierne eller PBS. Udfør følgende trin lige før celleinjektion:
- Fjern mediet fra cellerne ved aspiration og skyl med 10 ml PBS per 100 mm plade; fjerne PBS.
- Add 1 ml trypsin til hver 100 mm plade og inkuber ved stuetemperatur lige længe nok til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
- Stop trypsinaktivitet med 5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum (FBS) pr 100 mm plade.
- Udpelleter cellerne ved centrifugering ved 450 xg og resuspender i ~ 5 ml serum DMEM (SF-DMEM) pr 100 mm plade.
- Tæl levedygtige celler under anvendelse af et hæmacytometer eller en automatiseret celletæller.
- Juster levende celledensitet til 2 x 10 5 celler / 3 pi (eller som bestemmes ved forsøg) ved pelletering af cellerne og resuspendering i SF-DMEM.
- Hold celler kølet på is eller en chill pakke (ikke tillader celler at fryse). Bland forsigtigt ved finger svirpe.
4. Bedøver og Forbered Mus til Kirurgi
- Narkosen hjælp ~ 5% isofluran (ilt flow ~ 2 L / min) eller som anvist af dyrlæge. Induktion bør tage 2 til 3 minutter. Bevar musen på en passende dybdeaf anæstesi med ~ 3% isofluran.
- Tjek anæstesidybden ved tå knibe, justere isofluran hvis indiceret og fortsætte med at overvåge vejrtrækning og tå knivspids reaktion under hele proceduren. Dæk mus med gaze puder til varme og overvåge musen regelmæssigt under hele proceduren, hvilket kan tage 45 min til 1 time, afhængig af hastigheden af injektionen.
- Placer musen i stereotaktisk ramme ved forsigtigt at skubbe ganen bar over tungen og ind i munden. Hook de forreste fortænder i tanden hul. Brug øre barer at stabilisere hovedet, med øre til øjets overflade så tæt vandret som muligt. Tving ikke barer i øregangen. Det er afgørende at placere hovedet sikkert: check fra side til side og op-og-ned bevægelse forsigtigt med fingerspidserne. Brug justerbare kontrol af stereotaktisk enhed for at optimere pasform.
- Smør øjnene med oftalmisk salve. Rens huden mellem ører og øjne to gange med skiftende anvendelser af en povidon-iodine antiseptisk og 70% EtOH.
- Injicere valgt smertestillende subkutant (SQ) ind flanke (eller som anvist).
5. Udfør Injektion
- Bestem injektionsstedet. Injektionsstedet kan variere med størrelsen og stamme af mus og typen af cellen. Celler injiceret for tæt på hjertekamrene kan føre til kranio-spinale spredning af sygdommen. Celler injiceres for overfladisk kan vokse ud gennem nålen spor.
BEMÆRK: I eksperimenterne vist her blev målet defineret som den forreste del af hjernebarken et site 2,5 mm lateralt (til højre), 1,5 mm anterior og 3,5 mm ventralt med hensyn til bregma blev valgt (figur 1), der producerer en midthjernen tumor i mus der spænder fra 20 til 30 gram. - Lav et lille snit (~ 8 mm lang) under anvendelse af steril teknik gennem huden af hovedet for at blotlægge bregma og injektionsstedet. En diagonalt snit fra et punkt mellem midterlinjen akse og højre øje mod højre øre (
- Træk huden og brug en steril vatpind til at tørre overfladen af kraniet. Dup knoglen med en anden vatpind fugtet med H 2 O 2 for at visualisere bregma. H 2 O 2 vil producere ilt bobler, efterlader tynde linjer af hvidt skum langs koronale og sagittale suturer, der skærer hinanden på bregma.
- Lås en tom sprøjte med nål på mikropumpe og manøvrere spidsen af nålen direkte over bregma; sæt koordinater på tilpasning konsollen til 0,0 mm sideværts, 0.0 mm anterior / posterior, og 0.0 mm ventrale / ryg.
- Flyt nålen til 2,5 mm lateralt (højre) og 1,5 mm forreste med hensyn til bregma (eller ønskede placering) ved hjælp af betjeningsknapperne på stereotaktisk enhed. Løft sprøjten let og markere den nøjagtige placering på skallen med en dedikeret filtpen. Hvis den ydre overflade af kraniet er ikke på et niveau plan med bregma (i.e., den dorsale / ventrale koordinere ikke længere læser nul), skal du nulstille den ventrale / ryg læsning til 0,0 for at sikre, at dybden af injektionen ikke forskydes.
- Bore et lille hul i kraniet med en håndholdt boremaskine udstyret med en steril dental spids på et passende sted markeret med pennen i trin 5.5. Hold boret i en vinkel til kraniet og meget blidt røre spidsen til knoglen. Gentag efter behov. Boring næsten men ikke helt igennem knoglen, efterladende kanylen rent faktisk trænge dette lag af kraniet, resulterer i den reneste injektion.
- Fjern knogle støv med en vatpind fugtet i PBS eller saltvand. Retur sprøjten til pumpen og sænke nålen lige ned til borehullet for at bekræfte placeringen. Hvis borehullet ikke er centreret med nålen, skal du bruge boret for at forstørre åbningen.
- Bland forsigtigt cellesuspensionen og trække cellerne ind i sprøjten ved hjælp af pumpestyreenheden. Undgå bobler og klumper og tørre nålen witt en spritserviet til at fjerne kontaminerende celler på den ydre overflade. Hvis sprøjten / nålen er tilstoppet eller frosset, fjerne og hurtigt rent med sterilt vand og 70% EtOH.
- Sænk nålen til niveauet af kraniet overflade (0.0 mm ventral / dorsal). Derefter langsomt (i løbet af ca 1 min) sænke nålen at trænge igennem den fulde tykkelse af kraniet og trænger ind i hjernen til en dybde på 4 mm ventrall. Træk kanylen langsomt til 3,5 mm ventrale. Hvis musen hoved holdes sikkert i stereotaktisk enhed, bør der være næsten ingen bevægelse af kraniet.
- Bekræft, at de korrekte parametre er indgået pumpens styreenhed (afsnit 2.2), og tryk på "RUN / STOP" (eller som anvist af produktets manual) til autoinject celler. Overvåg musen og juster isofluran hvis indiceret. Se sprøjten og sikrer, at stemplet bevæger sig i cylinderen. Frosne eller tilstoppet bevægelse kan resultere i en bøjet / brudt stemplet.
- Vent 1 til 2 min med nålen i Bregn, derefter meget langsomt (over 3 til 4 min) tilbagekalde nål fra væv. Samlet tid at fjerne nålen efter injektionen er færdig er 5 min. Brug en vatpind til at skamplet området omkring borehullet; efterlade kanterne af huden åben for at tillade benet at tørre.
- Fjern sprøjten fra pumpen og hurtigt skylle 3x med sterilt H 2 O, 3x med 70% EtOH, og 3x med sterilt H 2 O (eller som anvist af maker). Tør nål med EtOH og afsat.
- Anvend steril knoglevoks (svarende til 1 eller 2 pi) til borehullet og bruge træ ende af en steril vatpind til tamp voks på og ind i knoglen. Hvis overfladen er tørret tilstrækkeligt, skal det fast.
- Spred steril afdækning over musen og omkringliggende arbejdsområde og suturere indsnit; tre sting skulle være tilstrækkeligt. Alternativt kan kirurgisk klæbemiddel anvendes. Påfør et aktuelt antibiotikum.
- Reducer isofluran til 0% og fjerne musen fra stereotaktisk enhed, der er careful at beskytte tænderne. Check ører, mund og tunge.
- Overvåg musen nøje efter injektionen. Placer musen på en varmepude i 5 til 10 min; derefter overføre til bur (på varmepude) og observere indtil mus vågner og er ambulant. Lad ikke mus uden opsyn, indtil det har genvundet nok bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbence. Må ikke returnere musen til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. Overveje brugen af ekstra smertestillende, hvis tegn på smerte er bemærket.
6. Afslut og Monitor Recovery & tumorudviklingen
- Rengør alle instrumenter og udstyr, der benytter 70% EtOH, en perle sterilisator eller desinfektionsmiddel mellem mus.
- Overvåg injicerede mus i to dage efter indgrebet tegn på smerte, infektion eller andre komplikationer. Injicer analgetikum i 24 og 48 timer (eller som angivet) efter proceduren. Fjern suturer på 7 til 10 dage, hvis det er nødvendigt.
- Vurdere musene for kliniske tegn på sygdom, paralysis, nedsat aktivitet, vægttab, kramper eller generel sygdom.
- Overvåg tumor udvikling af den relevante metode [magnetisk resonans (MRI) in vivo Imaging Systems (IVIS) etc.].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kan oprettes Pålidelige intrakranielle xenotransplantater med denne beskrevne teknik. Identifikation af kritiske strukturer med musen kraniet (figur 1) vil give mulighed for anerkendelse af bregma og guide investigator til en præcis og reproducerbar placering injektion. I disse studier er U251 parentale linje, U251-celler transficeret med luciferase (U251-Luc) eller U87 udødeliggjorte humane GBM vævskulturceller blev suspenderet i 4 til 6 pi SF-DMEM og injiceret 2,5 mm lateralt (til højre), 1,5 mm anterior og 3,5 mm ventralt med hensyn til bregma (figur 2).
De resulterende tumorer kan visualiseres og analyseres ved magnetisk resonans (MR, figur 3), in vivo-luminescerende imaging (IVIS, figur 4), eller rutinemæssige makroskopisk patologi teknikker (H & E-farvning, figur 5). Særlig forsigtighed skal træffes og optimering udført for at bestemme appropriate celler og placeringen af injektion for at repræsentere timing, vækstrate og tumormodel ønskes.
Figur 1. kranium anatomi. De anatomiske træk med musen hoved og kraniet er vist. Bregma, som er på midterlinjen akse mellem øjne og ører i skæringspunktet mellem den koronale og sagittal suturer, anvendes til reproducerbart lokalisere injektion koordinater.
Figur 2. Incision og injektion kort. De funktioner, der anvendes til at bestemme hudindskæring og præcist lokalisere injektionsstedet er illustreret. En diagonal snit er lavet til at give adgang til både bregma og injektionsstedet. Anvendelse af 30% H2O 2til overfladen af kraniet med til at visualisere kraniet suturer. Placer en sprøjte med kanyle på mikropumpe og manøvrere nålespidsen direkte over bregma. Sæt koordinater på tilpasning konsollen til nul; alle kraniet målinger derefter reproducerbart lavet med hensyn til forissen.
Figur 3. Repræsentative intrakranielle xenotransplantattumorer: MRI-billeder MRI T2 vægtede billeder af en tumor er afledt fra (a) 2 x 10 5 U87-celler sammenlignet med en tumor stammer fra (B) 2 x 10 5 U251 celler.. (C) Tumor beregnet ud fra MRI-billeder af tre individuelle mus injiceret med U251 celler afbildet over tid volumener viser en reproducerbar vindue tumor udvikling og vækst, der er konsistent i alle forsøg.
Figur 4. Repræsentative xenotransplantattumorer: IVIS billeder. IVIS billede af U251-luciferase transducerede GBM celler injiceret intrakranialt i nøgne mus (A). Musen til venstre lykkedes injiceret som beskrevet med U251-Luc celler og viser en meget stærk focalized signal (fotoner / s) i den ønskede placering. Musen til højre viser et mislykket resultat af forkert placering injektion. H & E undersøgelse af rygsøjlen afslørede tumorcellevækst i rygsøjlen som følge af injektion for tæt på midterlinjen med ventrikulær udbredelse. (B) Tumor størrelse estimeres fra luciferaseaktivitet (fotoner / sekund) i hjernen område af interesse, afbildet over tid. Den blå linie svarer til mus med en vellykket intrakranial injektion, mens den røde linje svarer til musen med tumorcelle forskydning til rygsøjlen.
Figur 5. H & E i Intrakranielle xenotransplantattumorer. Hele hjerner blev indsamlet fra mus skrive offer og fikseret i formalin, monteret i paraffin, snittet og farvet med H & E. Tumor (A) blev afledt fra U87 GBM celler og illustrerer et område med tæt tumorvækst (venstre øverste hjørne) og tilstødende normale hjernevæv med mikroskopisk invasion af maligne celler (nederste højre hjørne). Tumor (B) blev taget fra en del af midten af en tumor er afledt af U251 GBM celler. Afsnittet meget nøje gengiver den bizarre histopatologi med flerkernede maligne celler set i typisk menneskelig GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ortotopisk musemodeller af human kræft i hjernen kan være et udmærket redskab til at vurdere effektiviteten af kliniske behandlinger, men pleje skal tages for at optimere placeringen af celler i hjernevæv. Undersøgelser har vist, at for store alikvote mængder, suboptimal injektionsteknik og forhastede injektionsrater kan føre til utætheder og fremkomsten af tumorceller i uønskede steder (ventrikler, rygmarv, extradural regioner, mv.) Og høj variation i tumor størrelse 2 (personlige observationer ). En analyse af mikroprocessor-drevet levering af ikke-cellulære prøver fandt, at brugen af en mikropumpe produceret mere focalized levering, mindre prøve reflux og mindre variabilitet end manuelle metoder til injektion, der tilfalder den glatte, ensartede levering og konsekvente pres 3. Selv om det kan være svært at kondensere den nødvendige antal celler i et volumen på kun 2 eller 4 pi, anvendelse af en stereotaktisk instrument og tilpasning konsol ækvuipped med en programmerbar mikro-pumpe kan give reproducerbare og pålidelige tumorer med lignende vækstrater. En xenotransplantatmodellen kan aldrig virkelig duplikere mikromiljø, initiering og udvikling af en naturligt forekommende tumor, især med immun mangelfulde værter, men et godt designet og implementeret ortotopisk model er det bedste alternativ, og er langt overlegen i forhold til en ektopisk model.
Den største fordel ved denne protokol er etableringen af påviselige tumorer inden for en ensartet tidsramme. Timingen af svulst udseende er afhængig af celletype og antallet af injicerede celler, men er temmelig forudsigelig, og de fleste tumorer er etableret inden for et snævert tidsvindue i forhold til varigheden af tumorvækst (dvs. tiden indtil endepunkt). Dette gør det muligt for forskeren at identificere tidspunkter for dataindsamling (f.eks MRI eller IVIS) eller intervention (såsom medicinsk behandling). Tumorvæksthastigheder varierer med celletype, antal celler injiceres og frabout mus til mus (meget som de gør i menneskelige patienter), men er i overensstemmelse fra eksperiment til eksperiment.
Mens dette protokol anvender en teknik, der kan kræve mere instrumentering og tid end færre eksakte manuelle metoder til injektion og må ikke være for store undersøgelser målestok, teknikker til intrakranielle injektioner, der tillader gennemløb af et stort antal dyr (såsom den beskrevet af Iwami et al. 12) per definition indebærer hurtig, højtryk injektion og involverer ofte håndholdt instrumentering og manuel måling, som er genstand for usikker og usikkerhed. Disse faktorer kan være forbundet med lækage og off-target levering 2,3. Den præcision, reproducerbarhed og lav dødelighed af denne procedure vil gøre det muligt for undersøgeren at designe behandling eksperimenter med færre mus for at opnå statistisk signifikante resultater - en nettobesparelse.
Et trin er afgørende forsucces tumorimplantation: den nøjagtige placering af injektionen. Celler injiceret for tæt på hjertekamrene kan føre til CSF spredning af sygdomme i det ventrikulære system eller i ekstrakraniale regioner. Celler injiceres for overfladisk kan vokse ud gennem nålen spor. Forudbestemte koordinater er af ringe værdi, hvis nåleplacering er sjusket. Tag dig tid til at placere musens hoved sikkert i stereotaktisk enhed. Brug stereotaktisk justeringsmuligheder og øre barer at passe udstyret til musen, og sikrer, at lederen stabilt er placeret, og vil ikke rock eller twist under proceduren. Ændringer eller variation, hvis injektionsstedet kan påvirke tumor karakteristika, herunder tumor tage, vækst, invasiv potentiale og adgang til drug delivery og iltforsyning.
Andre parametre, der har en dybtgående indvirkning på den resulterende tumor omfatter injektionsrate, celle antal og volumen; alle skal bestemmes empirisk. Minimer mængden til number af celler, der kræves for tumorvækst; bruge den langsomste injektionshastighed praktisk. Celle nummer og antal passager har også store konsekvenser for tumor take og vækstrate. Det specialiserede udstyr, der anvendes her tilbyder overlegen kontrol, men begreberne minimal volumen, præcis målretning, minimal og konsekvent injektion sats, og langsom nål tilbagetrækning kan anvendes til en lang række teknikker (herunder manuel injektion) og en række forskellige instrumenter.
Denne procedure er åben for en bred vifte af ændringer: injektionsstedet kan tilpasses til at rekapitulere bestemte typer af tumorer. Adhærente vævskulturceller, genetisk modificerede kloner neurosfærer, disaggregerede musetumorer, eller humane væv fragmenter kan indpodet en musehjerne. Denne teknik kan endda tilpasses til ikke-cellulære undersøgelser, herunder viral genoverførsel 3. Når en fremgangsmåde til pålideligt producerende tumorer af de ønskede karakteristika er etableret, eksperimenter sammenligne effekticacy af behandlinger, medicinsk behandling og kombinationer, og andre muligheder, såsom genoverførsel kan udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dr. Keating er finansieret af DOD tilskud CA100335 og er en St. Baldrick Fond Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
