Summary
De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.
Abstract
Orthotopische tumor modellen zijn op dit moment de beste manier om de studie van de eigenschappen van een type tumor, met en zonder interventie, in de context van een levend dier - vooral op locaties met unieke fysiologische en architectonische kwaliteiten, zoals de hersenen In vitro en buitenbaarmoederlijke modellen niet kunnen. goed voor functies zoals het vaatstelsel, bloed-hersenbarrière, het metabolisme, drug delivery en toxiciteit, en een tal van andere relevante factoren. Orthotopische modellen hebben hun beperkingen ook, maar met de juiste techniek tumorcellen plaats nauwkeurig worden geënt in weefsel dat het meest bootst omstandigheden in het menselijk brein. Door het gebruik van methoden die precies afgemeten hoeveelheden te leveren aan nauwkeurig gedefinieerde locaties in een gelijkmatige en druk, muismodellen van menselijke hersentumoren met voorspelbare groei kan reproduceerbaar worden gemaakt en zijn geschikt voor een betrouwbare analyse van de verschillende interventies. De hier beschreven protocol is gericht op de technische de details van het ontwerpen van en de voorbereiding op een intracraniële injectie, het uitvoeren van de operatie, en het waarborgen van een succesvolle en reproduceerbare tumorgroei en biedt aanknopingspunten voor een verscheidenheid van aandoeningen die kunnen worden aangepast voor een waaier van verschillende hersentumor modellen.
Introduction
In vitro studies van hersentumor cellen onschatbare waarde voor het ontleden van de moleculaire mechanismen die groei, overleving, migratie en invasie van kankercellen; gekweekte cel experimenten kunnen definiëren signaalwegen, wijzen op een mogelijke therapeutische doelwitten en karakteriseren cellulaire respons op de behandeling met geneesmiddelen. Maar in vitro systemen zijn veel te simplistisch om organismal reactie op geneesmiddelen te voorspellen; ze missen de fysiologische reacties, immuunreacties, cel micro-omgeving, en de algehele heterogeniteit van levende dier-systemen. Genetisch gemanipuleerde modellen kunnen van onschatbare waarde, wanneer deze beschikbaar zijn, maar moleculaire verschillen tussen soorten en muizen cellen kunnen gebeurtenissen in de menselijke processen niet recapituleren, wat resulteert in aanzienlijke verschillen bij het vergelijken van diermodellen om de klinische waarnemingen 1. Muis xenograft modellen met subcutane (SQ) injectie van menselijke hersenen tumorcellijnen onder de huid van de flank zijn eenvoudig uit te voerenen meten; ze kunnen worden gebruikt om de effecten van genetische modificatie en toediening / aflevering, metabolisme en toxiciteit pakken. Belangrijke nadelen beperken echter de bruikbaarheid van SQ modellen. De micro niet recapituleren die van een natuurlijk voorkomende hersentumor: de interacties van verschillende celtypes en weefsels; de plaatselijke vaatstelsel, en vele andere factoren uniek aan de hersenen kan niet worden gerepliceerd. Om nauwkeuriger reproduceren unieke milieu van een natuurlijk voorkomend hersentumor en test de effecten van farmaceutische interventie, zou een muis orthotopic model worden gebruikt. Verder kan orthotope technieken worden gebruikt als onderdeel van een genetisch gemanipuleerde benadering waarin humane primaire niet-kankercellen (gedifferentieerde of progenitor) genetisch gemodificeerd en geïnjecteerd in de desbetreffende plaats van een muis, met of zonder menselijke stroma cellen, resulterend in tumorigenese vergelijkbaar met dat bij de mens 1.
Dit artikel beschrijfteen methodologie om hersentumoren nauwkeurig en reproduceerbaar te creëren in muizen. Met deze techniek kan de gebruiker nauwkeurig injecteren van een kleine hoeveelheid van gesuspendeerde cellen in een opgegeven locatie van de fronto-parieto-temporale gebied van de muis hersenschors. Mouse mortaliteit is zeer laag; in onze handen, zijn er geen muizen stierven van chirurgische complicaties na 185 procedures. Kenmerken van het resulterende tumor te vergelijken met die van typische klinische tumoren; bijvoorbeeld: snelheid van groei, graad van necrose, invasiediepte, heterogeniteit van celtype aanwezigheid van mitotische cellen merkers van proliferatie en apoptose, etc. Cellijnen of gescheiden menselijk weefsel of tumor samples dan geëvalueerd worden op basis van hun vermogen simuleren feitelijke klinische presentatie. Pharmaceuticals, geselecteerd op basis van hun prestaties in celkweek, kunnen worden getest in de context van een functionerende stofwisseling, bloedsomloop en bloed-hersenbarrière zoals die per dier belast witha tumor, alle in een relevante architecturale context. Bovendien kan de gekozen injectie cellen genetisch gemodificeerd worden om het effect van specifieke knockdowns, deleties onderzoeken knock-ins, mutaties, etc. tumorgroei en overleving.
Een aantal publicaties documenteren tumoren studies met verschillende intracraniale technieken. Yamada et al. Heeft een gedetailleerde studie van de injectie van kleurstof en U87 cellen en vond dat volume en injectiesnelheid minimaliseren produceerde de beste tumor 2. . Brooks et al gevonden superieure reproduceerbaarheid en efficiëntie met behulp van een microprocessor gestuurde injector in plaats van een handmatige methode om virale vectoren te leveren; hun conclusies ten aanzien van optimale injectie parameters zijn van toepassing op mobiele aflevering 3. Shankavaram et al. Aangetoond dat glioblastoma multiforme (GBM) cellijnen geïnjecteerd orthotopically (met een handmatige methode) in de hersenen recapituleerde het genexpressieprofiel van het clinical tumoren beter dan ofwel in vitro of SQ xenotransplantaten, die het gebruik van intracraniale modellen voor preklinische studies 4. Giannini et al. Geïnjecteerde cellen uit humane biopten die in de flanken van naakt muizen hadden geleden door seriële passages in de hersenen van aanvullende muizen en aangetoond dat deze benadering bewaarde patiënt tumor gen veranderingen in het model 5. Vergelijkbare resultaten werden gerapporteerd door Yi c.s. 6. Met behulp van een stereotaxisch setup en nauwkeurig gedefinieerde injectieplaats, en een langzame en gestage injectie snelheid, verkregen zij reproduceerbaar hersentumoren met consistente groei en een hoog (100%) aanslaan tarief. De geldigheid van deze techniek is dan ook goed ingeburgerd; een literatuuronderzoek blijkt dat de toepassingen van deze techniek zijn uitgebreid. Carty et al. Gebruikt intracraniële injecties om virale vectoren die therapeutische genen met succes te leveren in de frontale cortex van transgenic model van de ziekte van Alzheimer 7. Thaci et al. De toepassing beschreven van intracraniale injecties therapeutische oncolytische adenovirus leveren een neurale stamcel gebaseerde drager in naakt muizen reeds uitvoert orthotopically ingespoten GBM tumoren 8. Duidelijk, intracraniële injecties zijn een veelzijdige en effectieve tool voor preklinisch onderzoek. Eerdere publicaties in The Journal of Gevisualiseerd Experimenten beschrijven fundamentele benaderingen 9-11, maar we nemen het concept van intracraniële tumor injectie en orthotopic modelleren naar een hoger niveau van precisie met behulp van eenvoudig te master-technologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden beoordeeld en door onze institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie goedgekeurd.
1 Plan de Experiment
- Selecteer cellen te injecteren. Cellen uit verschillende bronnen zijn kandidaten voor injectie: hechtende celkweek lijnen genetisch gemodificeerde klonen neurosfeercellen primaire kweken, of gescheiden tumoren. Het type model gewenst zal de meest geschikte injectieplaats definiëren.
- Bepaal het aantal cellen voor injectie. Het aantal cellen dat nodig is om tumoren te vormen afhankelijk cellijn en moet empirisch worden bepaald; tumor groei sterk afhankelijk van celtype celaantal en weefselkweek passage nummer. Celaantallen variërend van 1 x 04-2 oktober x 10 5 of meer per injectie zijn tumoren van verschillende groei geproduceerd.
- Beperk het volume voor injectie. De cellen moeten in het kleinste volume van serumvrij medium of fosfaat gebufferde s geschorstaline (PBS) die zorgt voor een soepele, gemakkelijke doorgang door een 26 G naald. Hoe kleiner het volume daadwerkelijk in de hersenen afgegeven, hoe preciezer omschreven en de resulterende tumor; optimale resultaten worden verkregen door het injecteren van volumes variërend van 3 tot 6 pl. Plan een totaal eindvolume van ten minste 50 ui gesuspendeerde cellen te bereiden, ongeacht het aantal injecties voorzien teneinde nauwkeurige meting mengen en bemonstering mogelijk.
- Kies de juiste muizen voor het model. Murine modellen van menselijke tumoren gebruiken meestal jonge immuun-gecompromitteerde muizen immuungemedieerde transplantaatafstoting te voorkomen. Het is niet nodig om het werk te laten plaatsvinden in een biologisch veiligheidskabinet indien de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen, met inbegrip van ontsmetting, desinfectie en sterilisatie van materialen en apparatuur. Het hier getoonde werk is gedaan in athymische naakt muizen, man en vrouw, tussen de 6 en 12 weken leeftijd. Muizen die minder dan 20 g wegen kan moeilijk te positioneren op alstereotaxic frame en kunnen meer vatbaar voor onderkoeling.
2 Monteer de apparatuur
- Verkrijgen en te ontsmetten een muis stereotaxisch frame, uitlijning console, en de muis gas anesthesie hoofd houder, injectiespuit pomp, warmte-pad, anesthesie machine, glasvezel werklamp, en variabele snelheid roterende boor. Reinigen en ontsmetten van alle apparatuur.
- Programmeer de injectie parameters (inclusief injectievolume, stroomsnelheid, snelheid, type spuit) en andere variabelen die voor de werking van de injectiepomp. Optimaliseer instellingen voor elke specifieke model.
OPMERKING: In deze injecties waren de instellingen 3.000 nl monsters met een snelheid van 400 nl / min (tarief eenheden "M") met behulp van een 25 ul injectiespuit (Device Type "E") in de niet-gegroepeerde ("N") modus. - Reinig een precisie micro met 26 G naald met meerdere keren wordt gespoeld steriel gedemineraliseerd water (Dih 2 O) en 70% ethanol (EtOH), het doen van een laatste rinse met Dih 2 O. Sommige, maar niet alle modellen zijn ontworpen om te worden geautoclaveerd. Zorg ervoor dat de zuiger beweging is glad en vrij.
- Verkrijgen anesthesie levering apparatuur. Isofluraan de voorkeur verdoving is gemakkelijk om de diepte en duur van de anesthesie regelen. Zorg ervoor dat de stereotactische apparaat is uitgerust met een muis anesthesie gas gehechtheid en dat de benodigde slangen en aansluitingen zijn getroffen om het gasmengsel te leveren uit de narcose machine naar de muis.
- Autoclaaf chirurgische instrumenten, met inbegrip van fijne punt schaar, twee tangen / hemostats (met tanden) voor het hechten, middelgrote schaar, middellange en puntig pincet, en ten minste twee 1 mm tandheelkundige boren. Houd instrumenten schoon tijdens de procedure met 70% EtOH, ontsmettingsmiddel, of een kraal sterilisator.
- Verkrijgen isofluraan, pijnstillende, oogzalf / smeermiddel, antibiotische zalf, zoutoplossing, 30% waterstofperoxide (H 2 O 2), antiseptisch en botwas (indien gewenst) eenveterinaire of medische voorziening. Bereid steriele Dih 2 O en 70% EtOH. Disposables zoals gaasjes, steriele dressings, hechtingen, ethanol wattenstaafjes, wattenstaafje wattenstaafjes, steriele chirurgische handschoenen, chirurgische mesjes en meer worden gespecificeerd in de lijst met materialen. Een fijne punt permanente marker voor het markeren van de schedel moet worden ontsmet en toegewijd voor chirurgisch gebruik.
3 Bereid Cellen voor Injectie
- In de hier getoonde experimenten, selecteer een onsterfelijk mens GBM cellijn. Bepaal het aantal cellen (2 x 10 5) en het volume suspensie te spuiten (3 ui) empirisch; informatie kan variëren met het type cel. Gebruik een volume van ten minste 50 pl nauwkeurige meting, mengen en injectie vergemakkelijken.
- Trypsinize cellen en resuspendeer in media of PBS. Voer de volgende stappen vlak voor celinjectie:
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen door aspiratie en spoelen met 10 ml PBS per 100 mm plaat; verwijderen PBS.
- Advertentied 1 ml trypsine elke 100 mm plaat en incubeer bij kamertemperatuur net lang genoeg om een enkele celsuspensie werd verkregen.
- Stop trypsinewerking met 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) per 100 mm plaat.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 450 xg en resuspendeer in ~ 5 ml serumvrij DMEM (DMEM-SF) per 100 mm plaat.
- Telling levensvatbare cellen met behulp van een hemacytometer of een geautomatiseerde celteller.
- Stel de levende celdichtheid 2 x 10 5 cellen / 3 ui (of proefondervindelijk bepaald) door pelletiseren de cellen en hersuspenderen in SF-DMEM.
- Houd cellen gekoeld op ijs of een chill pack (niet mogelijk cellen te bevriezen). Meng voorzichtig met de vinger te vegen.
4 Verdoven en Bereid Muis voor Heelkunde
- Induceren anesthesie met behulp van ~ 5% isofluraan (zuurstoftoevoer ~ 2 L / min) of zoals voorgeschreven door de dierenarts. Inductie moet nemen 2 tot 3 minuten. Handhaaf de muis op een adequate dieptevan anesthesie met ~ 3% isofluraan.
- Controleer de diepte van de anesthesie door teen knijpen, stel isofluraan indien geïndiceerd en doorgaan met ademhalen en teen knijpen respons tijdens de gehele procedure te volgen. Bedek muis met gaasjes voor de warmte en de monitor muis regelmatig gedurende de procedure, die 45 min kan duren tot 1 uur, afhankelijk van de snelheid van de injectie.
- Plaats de muis in stereotaxisch frame door het gehemelte bar voorzichtig glijden over de tong en in de mond. Haak de voorste snijtanden in de tand gat. Gebruik oor bars om het hoofd te stabiliseren, met het oor-to-eye oppervlak zo dicht horizontaal mogelijk. Niet bars kracht in de gehoorgang. Het is cruciaal om goed te positioneren het hoofd: check side-to-side en op-en-neer gaande beweging voorzichtig met de vingertoppen. Gebruik de instelbare bedieningselementen van de stereotaxisch eenheid optimaliseren fit.
- Smeer de ogen met oogzalf. Het reinigen van de huid tussen de oren en ogen tweemaal met afwisselende toepassingen van een povidon-jodiume antiseptische en 70% EtOH.
- Injecteren gekozen pijnstillende subcutaan (SQ) in de flank (of zoals voorgeschreven).
5 Voer Injectie
- Bepaal de injectieplaats. De injectieplaats kan variëren met de grootte en de stam van de muis en het type cel. Cellen geïnjecteerd te dicht bij de ventrikels kunnen leiden tot cranio-spinale verspreiding van ziekten. Cellen geïnjecteerd te ondiep kan groeien door de naald spoor.
Opmerking: In de hier getoonde experimenten werd het doelwit gedefinieerd als het frontale gebied van de cerebrale cortex een plaats 2,5 mm lateraal (rechts), 1.5 mm anterior en 3,5 mm ventraal ten opzichte van de fontanel werd gekozen (figuur 1), produceert een middenhersenen tumor in muizen van 20 tot 30 g. - Voeg een kleine incisie (~ 8 mm lang) met behulp van steriele techniek door de huid van het hoofd naar de bregma en de injectieplaats bloot. Een diagonaal gesneden, vanaf een punt tussen de middellijn as en het rechteroog naar het rechteroor (
- Trek de huid en gebruik een steriel wattenstaafje om het oppervlak van de schedel drogen. Dep het bot met een bevochtigd met H 2 O 2 tot bregma visualiseren. De H 2 O 2 zal zuurstofbellen produceren, waardoor er dunne witte lijnen van schuim langs de coronale en sagittale hechtingen, die elkaar onder bregma.
- Kleur een lege injectiespuit met naald op de micropomp en manoeuvreren de punt van de naald direct boven de bregma; set coördineert op de uitlijning console tot 0,0 mm lateraal, 0.0 mm voor / achter, en 0.0 mm ventrale / dorsale.
- Breng de naald tot 2,5 mm lateraal (rechts) en 1,5 mm anterieur ten opzichte van bregma (of gewenste locatie) met de bedieningsknoppen op het stereotaxische apparaat. Til de injectiespuit in een licht en markeer de exacte locatie op de schedel met een speciale viltstift. Indien het buitenoppervlak van de schedel niet horizontaal te bregma met (i.e., de dorsale / ventrale coördineren niet langer nul staat), reset de ventrale / dorsale lezen op 0,0 om ervoor te zorgen dat de diepte van de injectie niet wordt verschoven.
- Boor een gaatje in de schedel met een handbediende boormachine uitgerust met een steriele tandheelkundige tip op de juiste plaats voorzien van de pen in stap 5.5. Houd de boor in een hoek aan de schedel en heel zachtjes aanraken van de tip tot op het bot. Herhalen als nodig is. Boren bijna maar niet geheel door het bot, waardoor de naald daadwerkelijk dringen deze laag van de schedel, bepaalt het schoonste injectie.
- Verwijder het bot stof met een wattenstaafje dat in PBS of zoutoplossing. Zet de spuit op de pomp en laat de naald recht naar beneden naar de braam gat naar de locatie te bevestigen. Als het boorgat niet in het midden met de naald, gebruik maken van de boor voor een vergroting van de opening.
- Meng de celsuspensie en trekken de cellen in de spuit met behulp van de pomp controller. Vermijd bubbels en bosjes en veeg de naald with een alcoholdoekje om contaminerende cellen op het buitenoppervlak te verwijderen. Als de spuit / naald verstopt is of bevroren, te verwijderen en snel schoon met steriel water en 70% EtOH.
- Zet de naald omlaag tot het niveau van de schedel oppervlak (0,0 mm ventraal / dorsaal). Dan langzaam (in ongeveer 1 min) lager de naald prikken door de volledige dikte van de schedel en de hersenen doordringen tot een diepte van 4 mm ventrall. Trek de naald langzaam tot 3,5 mm ventraal. Als de muis kop stevig vastgehouden in de stereotaxische apparaat, zou er bijna geen beweging van de schedel zijn.
- Controleer of de juiste parameters in de pomp controller worden ingevoerd (paragraaf 2.2) en druk op "RUN / STOP" (of zoals voorgeschreven door de handleiding van het product) om cellen autoinject. Bewaken van de muis en stel isofluraan indien geïndiceerd. Let op de spuit en ervoor zorgen dat de zuiger beweegt zich in het vat. Bevroren of verstopte beweging kan resulteren in een gebogen / gebroken zuiger.
- Wacht 1 tot 2 minuten met de naald in de bregen, dan heel langzaam (gedurende 3 tot 4 min) terugtrekken naald uit weefsel. Totale tijd om de naald te verwijderen na de injectie is voltooid is 5 minuten. Gebruik een wattenstaafje om het gebied rond het boorgat vlek; Laat de randen van de huid open om het bot drogen.
- Haal de spuit uit de pomp en snel spoelen 3x met steriele H 2 O, 3x met 70% EtOH, en 3x met steriele H 2 O (of zoals voorgeschreven door maker). Veeg naald met EtOH en zet apart.
- Toepassen steriele botwas (overeenkomend met 1 of 2 ui) aan het boorgat en gebruik het houten uiteinde van een steriel wattenstaafje om de was stampen op en in het bot. Als het oppervlak voldoende gedroogd moet blijven.
- Verspreid steriel laken over de muis en het omliggende werkgebied en hechtdraad de incisie; drie steken moet voldoende zijn. Alternatief kan chirurgische kleefmiddel worden gebruikt. Breng een actueel antibioticum.
- Verminder isofluraan tot 0% en verwijder de muis uit de stereotaxisch eenheid, zijnde careful om tanden te beschermen. Controleer de oren, mond en tong.
- Bewaken van de muis volgt de injectie. Plaats muis op een warmte-pad 5 tot 10 min; vervolgens over te dragen aan de kooi (op warmte-pad) en observeren totdat de muis wakker en is ambulant. Laat de muis onbeheerd achter, totdat het genoeg weer bij bewustzijn is om borstbeen recumbence behouden. Laat de muis niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot ze volledig hersteld. Overweeg het gebruik van extra pijnstillende als tekenen van pijn zijn opgevallen.
6 Finish en Monitor Recovery & Tumor Development
- Reinig alle instrumenten en apparatuur met 70% EtOH, een kraal sterilisator of ontsmettingsmiddel tussen muizen.
- Controleer de geïnjecteerde muizen gedurende twee dagen na de procedure op tekenen van pijn, infectie of andere complicaties. Injecteren pijnstillende 24 en 48 uur (of zoals aangegeven) na de procedure. Verwijder hechtingen 7 tot 10 dagen, indien nodig.
- Evalueer de muizen voor de klinische symptomen van de ziekte, paralysis, verminderde activiteit, gewichtsverlies, toevallen of algemene ziekte.
- Controleer de tumorontwikkeling door de geschikte methode [magnetic resonance imaging (MRI), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc.].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Betrouwbare intracraniële xenotransplantaten kunnen worden gemaakt met deze techniek beschreven. Het identificeren van de kritische structuren van de schedel muis (Figuur 1) zal voor de erkenning van de bregma en begeleiden de onderzoeker om een nauwkeurige en reproduceerbare injectie locatie. In deze studies de ouderlijn U251, U251-cellen getransfecteerd met luciferase (U251-Luc) of U87 geïmmortaliseerde humane GBM weefselkweek cellen werden 4 tot 6 pl-SF DMEM gesuspendeerd en geïnjecteerd 2,5 mm lateraal (rechts), 1.5 mm anterior , en 3,5 mm ventraal ten opzichte van bregma (figuur 2).
De resulterende tumoren worden gevisualiseerd en door magnetische resonantie beeldvorming (MRI, figuur 3), in vivo beeldvorming luminescerende (IVIS, figuur 4), of routine macroscopische pathologische technieken (H & E kleuring, figuur 5) geanalyseerd. Bijzondere zorg moet worden genomen en optimalisatie uitgevoerd om de Aangepast decor bepalente cellen en de locatie van de injectie om de timing, groei, en tumor model gewenst vertegenwoordigen.
Figuur 1 Schedel anatomie. De anatomische kenmerken van de muis hoofd en de schedel worden geïllustreerd. De bregma, die op de middellijn as tussen ogen en oren op het kruispunt van de coronale en sagittale hechtingen, wordt gebruikt om reproduceerbaar vind injectie coördinaten.
Figuur 2 incisie en injectie kaart. De functies die worden gebruikt om de huid incisie te bepalen en precies te lokaliseren de injectieplaats worden geïllustreerd. Een diagonaal incisie toegang tot zowel bregma en de injectieplaats mogelijk. Toepassing van 30% H 2 O 2het oppervlak van de schedel helpt schedel hechtingen visualiseren. Plaats een spuit met naald op de micropump en manoeuvreren de naald direct over de bregma. Set coördineert op de uitlijning console op nul; alle schedel metingen worden vervolgens reproduceerbaar gemaakt met betrekking tot bregma.
Figuur 3 Representatieve intracraniële xenograft tumoren: MRI beelden MRI T2 gewogen beelden van een tumor afgeleid van (A) 2 x 10 5 cellen U87 tegen een tumor afgeleid van (B) 2 x 10 5 U251 cellen.. (C) Tumor volumes berekend MRI beelden van drie afzonderlijke muizen geïnjecteerd met U251 cellen uitgezet in de tijd toont een reproduceerbare raam van tumorontwikkeling en groei die consistent in alle experimenten.
Figuur 4 vertegenwoordiger xenograft tumoren: IVIS beelden. IVIS beeld van U251-Luciferase getransduceerde cellen GBM intracraniaal geïnjecteerd in naakt muizen (A). De muis naar de linkerkant is succesvol geïnjecteerd als beschreven U251-Luc-cellen en vertoont een zeer sterke gefocaliseerd signaal (fotonen / sec) in de gewenste locatie. De muis op de juiste demonstreert een mislukte resultaat van onjuiste injectie locatie. H & E onderzoek van de wervelkolom bleek tumorcelgroei in de wervelkolom als gevolg van injectie te dicht bij middellijn met ventriculaire verspreiding. (B) De tumorgrootte wordt bepaald luciferaseactiviteit (fotonen / seconde) in het hersengebied plaats, uitgezet in de tijd. De blauwe lijn komt overeen met de muis een succesvolle intracraniële injectie, terwijl de rode lijn correspondeert met de muis tumorcel verplaatsing naar de wervelkolom.
Figuur 5 H & E van intracraniële xenograft tumoren. Hele hersenen werden verzameld van muizen te posten opoffering en in formaline gefixeerde, gemonteerd in paraffine, coupes en gekleurd met H & E. Tumor (A) werd afgeleid van U87 GBM cellen en illustreert een gebied van dichte tumorgroei (linker bovenhoek) en de aangrenzende normale hersenweefsel met microscopische invasie van kwaadaardige cellen (rechts onder in de hoek). Tumor (B) is gemaakt uit een deel van het centrum van een tumor afkomstig van U251 cellen GBM. De sectie nauw repliceert de bizarre histopathologie met meerkernige kwaadaardige cellen gezien in de typische menselijke GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orthotopische muismodellen van menselijke hersenen kanker kan een uitstekend hulpmiddel voor het beoordelen van de effectiviteit van klinische therapieën te zijn, maar zorg moeten worden genomen om de plaatsing van de cellen in het hersenweefsel te optimaliseren. Studies hebben aangetoond dat overmatige hoeveelheid volumes suboptimale injectietechniek en haastige injectiesnelheden kan leiden tot lekkages en de verschijning van tumorcellen in ongewenste plaatsen (ventrikels, ruggenmerg, extradurale gebieden, etc.) En hoge variatie in tumorgrootte 2 (persoonlijke waarnemingen ). Een analyse van microprocessor gestuurde aflevering van niet-cellulaire monsters gevonden dat het gebruik van een micropomp produceerde meer gefocaliseerd levering, minder monster reflux en minder variabiliteit dan handmatige methoden van injectie, toegeschreven aan de gladde, uniforme en consistente aflevering druk 3. Hoewel het een uitdaging om het benodigde aantal cellen condenseren in een volume van 2 of 4 ui, het gebruik van een stereotaxische instrument uitlijning console equipped met een programmeerbare micro-pomp kan reproduceerbare en betrouwbare tumoren met gelijkaardige groeicijfers opleveren. Een xenotransplantaatmodel kan nooit echt dupliceren de micro-omgeving, initiatie en ontwikkeling van een natuurlijk voorkomende tumor, in het bijzonder met immuundeficiënte gastheren, maar een goed ontworpen en geïmplementeerd orthotopic model is het beste alternatief en is veel beter dan een buitenbaarmoederlijke model.
Het grote voordeel van dit protocol is de oprichting van detecteerbare tumoren binnen een consistente tijdsbestek. De timing van tumor uiterlijk is afhankelijk van celtype en het aantal geïnjecteerde cellen, maar is tamelijk voorspelbaar, en de meeste tumoren binnen een smal venster van tijd ten opzichte van de duur van tumorgroei (dwz tijd totdat eindpunt) ingesteld. Dit stelt de onderzoeker om tijd aan te wijzen voor het verzamelen van gegevens (zoals MRI of IVIS) of interventie (zoals behandeling met geneesmiddelen). Tumorgroei variëren met celtype, aantal cellen geïnjecteerd, en frOM muis muis (net zoals ze doen in menselijke patiënten), maar zijn consistent van experiment om te experimenteren.
Hoewel dit protocol gebruikt een techniek die meer instrumenten en tijd van minder nauwkeurige handmatige methoden van injectie kan verlangen en niet van toepassing op grote schaal onderzoeken zijn technieken voor intracraniale injecties die zorgen voor doorvoer van grote aantallen dieren (zoals beschreven door Iwami et al. 12) per definitie betrekken snelle, hoge druk injectie en vaak sprake van hand-held instrumenten en handmatige meting, die onderhevig zijn aan wankel en onzekerheid zijn. Deze factoren kunnen worden geassocieerd met lekkage en off-doelgegevensdrager 2,3. De precisie, reproduceerbaarheid, en de lage sterfte van deze procedure kan de onderzoeker om de behandeling experimenten met minder muizen om statistisch significante resultaten te verkrijgen te ontwerpen - een netto besparing.
Een stap is kritisch voor desucces van tumor implantatie: de precieze locatie van de injectie. Cellen geïnjecteerd te dicht bij de ventrikels kunnen leiden tot CSF verspreiding van ziekten via het ventriculaire systeem of in extracranial gebieden. Cellen geïnjecteerd te ondiep kan groeien door de naald spoor. Vooraf bepaalde coördinaten zijn van weinig waarde als plaatsing van de naald is slordig. Neem de tijd om stevig te positioneren met de muis hoofd in de stereotaxisch unit. Gebruik de stereotaxisch instelmogelijkheden en het oor bars om de apparatuur te passen aan de muis, en ervoor zorgen dat het hoofd stabiel ligt en zal tijdens de procedure niet rocken of twist. Veranderingen of wijziging indien de injectieplaats kunnen beïnvloeden tumorkarakteristieken, waaronder tumor take, groei, invasiepotentieel en toegang tot toediening van medicijnen en zuurstof.
Andere parameters die een grote invloed op de resulterende tumor hebben onder meer de injectie snelheid, het aantal cellen en het volume; alle moeten empirisch worden bepaald. Het volume van de numbe minimaliserenr cellen nodig voor tumorgroei; Gebruik de langzaamste injectie tarief praktisch. Cel aantal en passage nummer hebben ook belangrijke effecten op de tumor te nemen en de groeisnelheid. De gespecialiseerde uitrusting hier gebruikte bieden superieure controle, maar de begrippen minimaal volume, doelgerichtheid, minimaal en consistent injectiehoeveelheid en langzame naald intrekking kan worden toegepast op een verscheidenheid van technieken (waaronder handmatige injectie) en verschillende instrumenten.
Deze procedure staat open voor een verscheidenheid van wijzigingen: de injectieplaats kan worden aangepast aan specifieke soorten tumoren recapituleren. Aanhangend weefselcultuurcellen, genetisch gemodificeerde klonen, neurosferen, uitgesplitst muis tumoren, of menselijk weefsel fragmenten kunnen worden geënt in een muis hersenen. Deze techniek kan ook worden aangepast voor niet-cellulaire studies, waaronder virale gentransfer 3. Als een werkwijze voor het produceren van betrouwbare tumoren van de gewenste eigenschappen vastgesteld, experimenten vergelijken de effiwerkzaamheid van therapieën, behandelingen met medicijnen en combinaties, en andere opties, zoals gen-overdracht kan worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dr Keating wordt gefinancierd door DOD subsidie CA100335 en is een St. Baldrick's Foundation Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
