Summary
Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden.
Abstract
Orthotope Tumormodelle sind derzeit die beste Weg, um die Eigenschaften eines Tumortyps zu studieren, mit und ohne Intervention im Kontext von einem lebenden Tier - vor allem an Standorten mit einzigartigen physiologischen und architektonische Qualitäten wie das Gehirn in vitro und Eileiter Modelle nicht. Konto für Funktionen wie Gefäßsystem, Blut-Hirn-Schranke, Stoffwechsel, Lieferung und Toxizität, und eine Vielzahl von anderen relevanten Faktoren. Orthotopen Modelle haben ihre Grenzen auch, aber mit der richtigen Technik Tumorzellen von Interesse genau in das Gewebe eingepflanzt werden, die am ehesten imitiert Bedingungen im menschlichen Gehirn. Durch Verwendung Methoden, die genau abgemessene Mengen zu liefern, genau definierten Stellen in einer konsistenten und Druck, Maus-Modellen der menschlichen Gehirntumoren mit vorhersagbaren Wachstumsraten reproduzierbar erzeugt werden und eignen sich für eine zuverlässige Analyse von verschiedenen Eingriffen. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die technische der Gestaltung und Herstellung für eine intrakraniale Injektion der Durchführung der Operation, und sicherzustellen, erfolgreiche und reproduzierbare Tumorwachstum und stellt Ausgangspunkte für eine Vielzahl von Bedingungen, die für eine Reihe von verschiedenen Gehirntumormodelle angepasst werden kann.
Introduction
In-vitro-Studien der Gehirntumorzellen sind von unschätzbarem Wert für Sezieren molekularen Mechanismen das Wachstum, Überleben, Migration und Invasion von Krebszellen; kultivierten Zellexperimenten können festlegen, Signalwege, schlage potenzielle therapeutische Ziele, und zu charakterisieren, zelluläre Reaktion auf medikamentöse Behandlung. Aber in vitro-Systeme sind viel zu einfach zu organismischen Reaktion auf Arzneimittel vorherzusagen; sie nicht über die physiologischen Reaktionen, Immunreaktionen, Zellmikroumgebung, und die allgemeine Heterogenität der lebenden Tier-Systemen. Gentechnisch veränderte Modelle können von unschätzbarem Wert, wenn verfügbar, aber molekulare Unterschiede zwischen den Arten und murine Zellen nicht Ereignisse in der menschlichen Prozesse zu rekapitulieren, was zu erheblichen Diskrepanzen beim Vergleich von Tiermodellen zu klinischen Beobachtungen 1. Maus-Xenograft-Modelle, die subkutan (SQ) Injektion von menschlichen Gehirntumorzelllinien unter der Haut der Flanke sind einfach durchzuführenund zu messen; sie können verwendet werden, um Auswirkungen von Gen-Modifikation and Drug Administration / Lieferung, Metabolismus und Toxizität anzugehen. Signifikante Nachteile begrenzen jedoch die Nützlichkeit des SQ-Modelle. Die Mikroumgebung nicht rekapitulieren ist die eines natürlich vorkommenden Hirntumor: Wechselwirkungen von verschiedenen Zelltypen und Geweben; die lokale Gefäßsystem und unzähligen anderen Faktoren einzigartig an das Gehirn kann nicht repliziert werden. Um genauer zu reproduzieren die einzigartige Milieu einer natürlich vorkommenden Gehirntumor und Testen der Wirkung von pharmazeutischen Eingriffe sollten eine Maus orthotopen Modell verwendet werden. Darüber hinaus kann orthotopen Techniken als Teil einer gentechnisch veränderten Ansatz, bei dem humane primäre Nicht-Krebszellen (differenzierte oder Vorläufer) verwendet werden genetisch verändert und in die jeweiligen Gelände einer Maus injiziert, mit oder ohne menschliche Stromazellen, was in der Tumorgenese beim Menschen ein ähnlich gesehen.
Dieser Artikel beschreibt,eine Methode, um Gehirntumore exakt und reproduzierbar zu schaffen, in Mäusen. Mit dieser Technik kann der Benutzer genau einzuspritzen Ein kleines Aliquot von suspendierten Zellen in einer bestimmten Position des fronto-parietooccipitalis Schläfenregion des Maus-Hirnrinde. Maus Sterblichkeit ist extrem niedrig; in unseren Händen sind keine Mäuse von chirurgischen Komplikationen nach 185 Verfahren gestorben. Eigenschaften des resultierenden Tumors mit der typischen klinischen Tumoren verglichen werden; Zum Beispiel: Schnelligkeit des Wachstums, der Grad der Nekrose, das Ausmaß der Invasion, die Heterogenität der Zelltyp, die Anwesenheit von mitotischen Zellen, Marker der Proliferation und Apoptose etc. Zelllinien oder aufgeschlüsselte menschlichem Gewebe oder Tumorproben können dann bewertet werden basierend auf ihrer Fähigkeit zu simulieren tatsächlichen klinischen Präsentation. Arzneimittel, ausgewählt auf der Grundlage ihrer Leistung in Zellkultur kann im Rahmen eines funktionierenden Stoffwechsel, Kreislauf und Blut-Hirn-Schranke nicht getestet werden, da sie in einem Tier belastet wit existierenha Tumor, die alle in einem relevanten architektonischen Kontext. Ferner können die Zellen für die Injektion gewählten genetisch modifiziert werden, um den Einfluss von Niederschlägen, Deletionen untersuchen, Knock-ins, Mutationen usw. auf Tumorwachstum und Überleben.
Eine Anzahl von Veröffentlichungen dokumentieren Tumoren Studien mit einer Vielzahl von Hirntechniken. Yamada et al. Haben eine detaillierte Studie über die Injektion von Farbstoff und der U87-Zellen und fanden, daß die Minimierung Volumen und die Einspritzgeschwindigkeit erzeugt die beste Tumor 2. . Brooks et al legene Reproduzierbarkeit und Effizienz mit einem mikroprozessorgesteuerten Injektor anstatt eine manuelle Methode, um virale Vektoren zu liefern; ihre Schlussfolgerungen in Bezug auf die optimale Einspritzparameter gelten für Zell Lieferung 3. Shankavaram et al., Dass Glioblastoma multiforme (GBM)-Zelllinien injiziert orthotopisch (mit einer manuellen Methode) in das Gehirn rekapituliert das Genexpressionsprofil des clinical Tumoren stärker als in vitro oder SQ Fremdtransplantaten, die den Einsatz von intrakraniellen Modelle für präklinische Studien 4. Giannini et al. Injizierten Zellen aus menschlichen chirurgischen Proben, die in den Flanken von Nacktmäusen durch serielle Passage in das Gehirn von Mäusen weitere erlitten hatte, und zeigte, dass dieser Ansatz erhalten Patienten Tumor-Gen Veränderungen im Modell 5. Ähnliche Ergebnisse wurden von Yi et al 6 angegeben. Mit Hilfe eines stereotaktischen Setup, sorgfältig definierten Injektionsstelle, und eine langsame und stetige Einspritzrate, erhalten sie reproduzierbare Hirntumoren mit konsequenten Wachstumsraten und hohe (100%) Transplantationsrate. Die Gültigkeit dieser Technik ist daher gut etabliert; eine Literaturrecherche zeigt, dass die Anwendungen dieser Technik sind umfangreiche. Carty et al. Verwendet intrakraniellen Injektionen virale Vektoren, die therapeutische Gene erfolgreich liefern in den frontalen Kortex von transgenic Modell der Alzheimer-Krankheit 7. Thaci et al. Die Verwendung intrakranielle Injektionen therapeutische onkolytische Adenovirus in einer neuralen Stammzellträger in Nacktmäuse injiziert bereits orthotopisch GBM Tumoren 8 trägt zu liefern. Offensichtlich sind intrakranielle Injektionen ein vielseitiges und effektives Werkzeug für die präklinische Forschung. Früheren Publikationen im Journal of Visualisierte Experimente beschreiben grundlegende Ansätze 9-11, aber wir nehmen das Konzept der intrakraniellen Tumorinjektion und orthotopen Modellierung zu einem höheren Maß an Präzision mit easy-to-Master-Technologie.
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Protocol
Alle beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von unseren institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss genehmigt.
1. Planen Sie das Experiment
- Wählen Zellen injiziert werden. Zellen, die aus einer Vielzahl von Quellen, sind Kandidaten für die Injektion: adhärente Zellkulturlinien, genetisch veränderte Klone, Neuro Zellen, Primärkulturen oder disaggregierten Tumoren. Die Art der gewünschten Modell wird die am besten geeignete Injektionsstelle zu definieren.
- Bestimmen die Zellzahl zur Injektion. Die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um Tumore zu bilden variiert mit Zelllinie und muß empirisch ermittelt werden; Tumorwachstumsrate hängt stark vom Zelltyp, Zellzahl und Zellkulturpassage Nummer. Zellzahlen im Bereich von 1 x 10 4 bis 2 × 10 5 oder mehr pro Injektion wurden Tumoren mit unterschiedlicher Wachstumsraten erzeugt.
- Begrenzen Sie die Lautstärke für die Injektion. Die Zellen in dem kleinsten Volumen der serumfreien Medium oder Phosphat-gepufferter s ausgesetzt,Aline (PBS), die für glatte, leicht Durchgang durch eine 26 G-Nadel ermöglicht. Je kleiner das Volumen tatsächlich in das Gehirn eingebracht werden, desto präziser und definiert die resultierende Tumor; Optimale Ergebnisse können durch Einspritzen von Mengen von 3 bis 6 ul erhalten wurde. Zu planen, um eine endgültige Volumen von mindestens 50 ul der suspendierten Zellen herzustellen, unabhängig von der Anzahl der Injektionen vorgesehen, um eine genaue Messung, Mischen und Probenahme zu ermöglichen.
- Wählen Sie die entsprechende Mäuse für das Modell. Mausmodellen von menschlichen Tumoren nutzen typischerweise junge immungeschwächten Mäusen, die immunvermittelte Transplantatabstoßung zu vermeiden. Es ist nicht notwendig für die Arbeit in einem biologischen Sicherheitsschrank zu nehmen, wenn geeignete Vorkehrungen getroffen werden, einschließlich Dekontamination, Desinfektion, Sterilisation und von Materialien und Geräten. Die hier gezeigten Arbeiten wurden in Nacktmaus, männlich und weiblich zwischen 6 und 12 Wochen alt sind getan worden. Mäuse, die weniger als 20 g wiegen kann schwierig sein, auf so positionierentereotaxic Rahmen und kann anfälliger für Hypothermie.
2. Bauen Sie die Ausrüstung
- Zu erhalten und zu dekontaminieren eine Maus stereotaktischen Rahmen, Ausrichtung Konsole und Maus Gasnarkose Kopfhalter, Mikropumpe, Wärmekissen, Narkosegerät, LWL-Arbeitsleuchte, und variable Drehbohrer. Reinigung und Dekontamination alle Geräte.
- Programmieren der Einspritzparameter (einschließlich Einspritzvolumen, Durchfluss, Geschwindigkeit Einheiten Spritzentyp) und anderen Variablen, die für den Betrieb der Spritzenpumpe. Optimieren Sie die Einstellungen für jedes einzelne Modell.
HINWEIS: In dieser Injektionen die Einstellungen mit Hilfe eines 25 ul Spritze (Device Type "E") in der nicht gruppierten ("N")-Modus waren 3.000 nl Proben mit einer Rate von 400 nl / min (Rate Einheiten "M"). - Reinigen eines Präzisionsmikro mit 26 G-Nadel mit mehreren Spülungen von sterilen VE-Wasser (DIH 2 O) und 70% Ethanol (EtOH), tut ein Abschluss rinse mit DIH 2 O. Einige, aber nicht alle Modelle sind so konzipiert, autoklaviert werden. Stellen Sie sicher, dass die Kolbenbewegung ist glatt und frei.
- Erhalten Anästhesiegeräten. Isofluran ist das bevorzugte Anästhetikum als es leicht ist, die Tiefe und die Dauer der Anästhesie zu regulieren. Sicherzustellen, dass die stereotaktische Gerät ist mit einer Maus Anästhesiegas Befestigung und daß die erforderlichen Leitungen und Anschlüsse vorhanden sind, um das Gasgemisch aus dem Anästhesiegerät zur Maus liefern ausgestattet.
- Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich feiner Spitze Schere, Pinzette zwei / hemostats (mit Zähnen) zum Nähen, mittelgroße Schere, mittleren und spitzen Pinzette, und mindestens zwei 1 mm Zahnbohrer. Halten Instrumente während des Verfahrens mit 70% EtOH, Desinfektionsmittel oder einem Wulst Sterilisator sauber.
- Isofluran erhalten, analgetisch, Augensalbe / Schmiermittel, antibiotische Salbe, Kochsalzlösung, 30% Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), antiseptische und Knochenwachs (falls gewünscht) von einemTier oder medizinische Versorgung. Bereiten Sie sterile DIH 2 O und 70% EtOH. Einweg wie Gaze-Pads, sterile Wundauflagen, Nähte, Ethanol Tupfer, Wattestäbchen Tupfer, sterile OP-Handschuhe, OP-Sägeblätter und mehr sind in der Materialliste aufgeführt. Eine feine Spitze Permanentmarker zur Markierung des Schädels soll dekontaminiert und für den chirurgischen Einsatz gewidmet sein.
3. Vorbereitung der Zellen für Injection
- Bei den hier gezeigten Experimente, wählen Sie eine immortalisierte humane GBM-Zelllinie. Bestimmen der Anzahl von Zellen (2 × 10 5) und dem Volumen der Suspension injiziert werden (3 ul) empirisch; Details können bei Zelltyp variieren. Verwenden ein Volumen von mindestens 50 ul, um eine genaue Messung, Mischung und Injektion zu erleichtern.
- Trypsinieren Zellen und Resuspension in Medium oder PBS. Führen Sie die folgenden Schritte kurz vor der Zellinjektion:
- Entfernen Sie das Medium aus den Zellen durch Absaugen und Spülen mit 10 ml PBS pro 100 mm-Platte; PBS zu entfernen.
- Anzeiged 1 ml Trypsin zu jedem 100 mm Platte und Inkubation bei RT gerade lang genug, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Stoppen Trypsin-Aktivität mit 5 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) + 10% fetales Rinderserum (FBS) auf 100-mm-Platte.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g und Resuspendieren in ~ 5 ml serumfreiem DMEM (SF-DMEM) pro 100 mm Platte.
- Graf lebensfähigen Zellen mit einem Hämazytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
- Einstellen der Lebendzelldichte von 2 x 10 5 Zellen / 3 ul (oder wie durch Experimente bestimmt), die durch Pelletieren der Zellen und Resuspendieren in SF-DMEM.
- Halten Zellen auf Eis oder einem kühlen Pack (nicht erlauben Zellen zu frieren) gekühlt. Vorsichtig mischen Finger Schnippen.
4. Bereiten Sie Anesthetize und Maus für Chirurgie
- Induzieren Anästhesie mit ~ 5% Isofluran (Sauerstoffströmungs ~ 2 l / min) oder durch Tierarzt gerichtet. Induktion sollte 2 bis 3 Minuten dauern. Pflegen Maus in einer angemessenen Tiefeder Narkose mit Isofluran ~ 3%.
- Überprüfen der Narkosetiefe durch toe Prise, Isofluran einstellen, wenn angegeben und weiter, um die Atmung und Zehen Prise Reaktion während des gesamten Verfahrens zu überwachen. Decken Maus mit Gaze-Pads für Wärme und regelmäßig überwachen Maus während des gesamten Verfahrens, die 45 Minuten bis 1 Stunde in Anspruch nehmen kann, abhängig von der Geschwindigkeit der Injektion.
- Bewegen Sie die Maus in stereotaktischen Rahmen von sorgfältig Schiebe den Gaumen bar über die Zunge und in den Mund. Haken Sie die Frontzähne in die Zahn Loch. Verwenden Sie Ohr Bars, um den Kopf zu stabilisieren, mit dem Ohr-zu-Augenoberfläche so horizontal wie möglich. Bars nicht mit Gewalt in den Gehörgang. Es ist entscheidend, um den Kopf sicher zu positionieren: Check von Seite zu Seite und nach oben und unten Bewegung sanft mit den Fingerspitzen. Mit den einstellbaren Bedienelementen der stereotaktischen Gerät zur Optimierung der Passform.
- Schmieren Sie die Augen mit Augensalbe. Reinigen Sie die Haut zwischen den Ohren und Augen zweimal mit wechselnden Anwendungen einer PVP-Jode antiseptische und 70% EtOH.
- Injizieren gewählt Analgetikum subkutan (SQ) in Flanke (oder wie vorgeschrieben).
5. Führen Injection
- Bestimmen Sie die Injektionsstelle. Die Injektionsstelle kann mit der Größe und Mäusestamm und dem Zelltyp variieren. Zellen zu nahe an den Ventrikel injiziert können cranio-Rücken Ausbreitung der Krankheit führen. Zellen zu flach eingespritzt wird, durch die Nadelbahn wachsen.
HINWEIS: In der hier gezeigten Experimenten wurde das Target als der Vorderbereich der Hirnrinde definiert eine Stelle 2,5 mm lateral (rechts), 1,5 mm anterior und 3,5 mm ventral bezüglich des Bregma gewählt wurde (Figur 1), wodurch eine Mittelhirn-Tumors bei Mäusen von 20 bis 30 g. - Machen Sie einen kleinen Schnitt (~ 8 mm lang) mit steriler Technik durch die Haut des Kopfes, um das Bregma und der Injektionsstelle aus. Ein diagonaler Schnitt, von einem Punkt zwischen der Mittellinie Achse und das rechte Auge in Richtung des rechten Ohres (
- Ziehen Sie die Haut und eine sterile Wattestäbchen, um die Oberfläche des Schädels zu trocknen. Tupfen Sie den Knochen mit einem anderen Tupfer mit H 2 O 2 befeuchtet Bregma visualisieren. Das H 2 O 2 Sauerstoffblasen zu produzieren, so dass dünne Linien von weißen Schaum entlang der koronalen und sagittalen Nähten, die an Bregma schneiden.
- Sperren eine leere Spritze mit Nadel auf der Mikropumpe und manövrieren die Spitze der Nadel direkt über dem Bregma; Satz Koordinaten auf der Ausrichtung Konsole, um 0,0 mm seitlich, 0,0 mm anterior / posterior und 0,0 mm ventral / dorsal.
- Bewegen Sie die Nadel bis 2,5 mm lateral (rechts) und 1,5 mm vor in Bezug auf Bregma (oder gewünschten Ort) mit den Steuerknöpfen auf der stereotaktischen Gerät. Heben Sie die Spritze leicht und markieren Sie den genauen Standort auf dem Schädel mit einem speziellen Filzstift. Wenn die Außenfläche des Schädels ist nicht auf eine ebene Fläche mit Bregma (i.e. der dorsal / ventral Koordinaten nicht mehr auf Null steht), Zurücksetzen der ventrale / dorsale Lese bis 0,0, um zu gewährleisten, daß die Tiefe der Injektion nicht verschoben wird.
- Bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel mit einem Handdrehbohrer mit einem sterilen Dentalspitze an der entsprechenden Stelle mit dem Stift in Schritt 5.5 markiert ausgestattet. Halten Sie den Bohrer in einem Winkel auf den Schädel und sehr sanft berühren die Spitze bis auf die Knochen. Wiederholen Sie nach Bedarf. Bohren fast, aber nicht vollständig durch den Knochen, so dass die Nadel, um diese Schicht des Schädels tatsächlich zu durchdringen, führt der saubersten Injektion.
- Entfernen Knochenstaub mit einem Wattestäbchen in PBS oder Kochsalzlösung befeuchtet. Bringen Sie die Spritze mit der Pumpe und senken Sie die Nadel gerade in den Bohrloch zu Ort zu bestätigen. Wenn das Bohrloch wird nicht mit der Nadel zentriert, verwenden Sie den Bohrer die Öffnung zu vergrößern.
- Vorsichtig mischen die Zellsuspension und zeichnen Sie die Zellen in die Spritze mit der Pumpensteuerung. Vermeiden Sie Blasen und Klumpen, und wischen Sie die Nadel Witzh einem Alkoholtupfer, um kontaminierende Zellen auf der Außenfläche zu entfernen. Wenn die Spritze / Nadel ist verstopft oder gefroren, herausnehmen und schnell sauber mit sterilem Wasser und 70% EtOH.
- Senken Sie die Nadel auf der Ebene der Schädeloberfläche (0,0 mm ventral / dorsal). Dann langsam (ca. 1 min) Absenken der Nadel durch die gesamte Dicke des Schädels durchbohren und durchdringen das Gehirn zu einer Tiefe von 4 mm ventrall. Ziehen Sie die Nadel langsam auf 3,5 mm ventralen. Wenn die Maus den Kopf sicher in der stereotaktischen Einheit gehalten, sollte es fast keine Bewegung des Schädels sein.
- Bestätigen Sie, dass die richtigen Parameter sind in der Pumpensteuerung eingegeben werden (Abschnitt 2.2) und drücken Sie "RUN / STOP" (oder wie von Produkthandbuch gerichtet), um Zellen autoinject. Überwachen Sie die Maus und passen Isofluran, wenn angegeben. Spritze beobachten und sicherzustellen, dass der Kolben im Zylinder bewegt. Gefroren oder verstopft Bewegung kann in einer gebogenen / gebrochen Kolben führen.
- Warte 1 bis 2 min mit der Nadel in der bregen, dann sehr langsam (über 3 bis 4 min) zurücktreten Nadel von Gewebe. Gesamtzeit, um die Nadel zu entfernen, nachdem die Injektion abgeschlossen ist, 5 min. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die Gegend rund um den Bohrloch auslöschen; lassen die Ränder der Haut offen, damit der Knochen zu trocknen.
- Entfernen Sie Spritze aus der Pumpe und 3x schnell gründlich mit sterilem H 2 O, 3x mit 70% EtOH und 3x mit sterilem H 2 O (oder, wie von Hersteller gerichtet). Wischen Nadel mit EtOH und beiseite stellen.
- Steriler Knochenwachs (entspricht 1 oder 2 ul) mit dem Bohrloch und verwenden Sie die Holz Ende einer sterilen Wattestäbchen, um das Wachs auf und in die Knochen verstopfen. Wenn die Oberfläche ausreichend getrocknet, sollte dabei bleiben.
- Verbreiten sterilen Tuch über die Maus und die umliegenden Arbeitsbereich und Naht der Schnitt; drei Maschen ausreichend. Alternativ kann eine chirurgische Klebstoff verwendet werden. Gelten eine topische Antibiotika.
- Reduzieren Isofluran auf 0% und entfernen Sie die Maus aus der stereotaktischen Einheit, wobei careful, um die Zähne zu schützen. Überprüfen Ohren, Mund und Zunge.
- Überwachen Sie die Maus eng nach der Einspritzung. Bewegen Sie die Maus auf einem Heizkissen für 5 bis 10 min; dann Transfer zum Käfig (auf Wärmekissen) und beobachten, bis der Maus wacht auf und wird ambulant. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um genug sternalen recumbence halten. Nicht Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren zurück, bis vollständig erholt. Betrachten Sie die Verwendung von zusätzlichen analgetischen, wenn Anzeichen von Schmerzen bemerkt.
6. Beenden und Monitor-Recovery-& Tumorentwicklung
- Reinigen Sie alle Instrumente und Geräte mit 70% EtOH, eine Perle Sterilisator oder Desinfektionsmittel zwischen Mäusen.
- Überwachung der injizierten Mäuse zwei Tage nach der Behandlung auf Anzeichen von Schmerzen, Infektionen oder andere Komplikationen. Injizieren Analgetikum bei 24 und 48 h (oder wie angegeben) nach der Prozedur. Nahtmaterial zu entfernen, auf 7 bis 10 Tage, wenn nötig.
- Bewerten Sie die Mäuse für die klinische Anzeichen der Krankheit, paralysis, verminderte Aktivität, Gewichtsverlust, Krampfanfälle oder allgemeine Krankheit.
- Überwachen Sie die Tumor-Entwicklung durch die entsprechende Methode [Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT), In-vivo-Imaging Systems (IVIS), etc.].
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Representative Results
Zuverlässigen intrakraniellen Xenotransplantaten mit diesem beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Identifizierung der kritischen Strukturen der Maus Schädel (Abbildung 1) wird für die Anerkennung der Bregma ermöglichen und führen die Ermittler auf eine präzise und reproduzierbare Injektion Lage. In diesen Studien wurde die Elternlinie U251, U251-Zellen mit Luciferase (U251-Luc) oder U87 transfizierten immortalisierten menschlichen GBM-Gewebekulturzellen wurden in 4 bis 6 ul SF-DMEM suspendiert und 2,5 mm lateral (rechts), 1,5 mm vor spritzt und 3,5 mm ventral bezüglich Bregma (Abbildung 2).
Die resultierenden Tumoren visualisiert und durch Magnetresonanztomographie (MRI, Abbildung 3), in vivo-Bildgebung Leucht (IVIS, Abbildung 4), oder eine Routine grobe Pathologie Techniken (H & E-Färbung, 5) analysiert werden. Muss insbesondere darauf geachtet werden, und die Optimierung durchgeführt, um festzustellen, das? Fallte-Zellen und den Ort der Injektion, um die Zeit, Wachstumsrate, und Tumormodell gewünschten darstellen.
Abbildung 1. Schädel Anatomie. Die anatomischen Merkmale der Maus Kopf und Schädel sind dargestellt. Bregma, die auf den Mittellinienachse zwischen den Augen und den Ohren an der Kreuzung der koronalen und sagittalen Naht ist, verwendet wird, um reproduzierbar zu lokalisieren die Injektionskoordinaten.
Abbildung 2. Inzision und Injektions Karte. Die zur Hautschnitt die Injektionsstelle zu bestimmen und genau zu lokalisieren Features veranschaulicht. Eine diagonale Schnitt gemacht, um Zugang zu beiden Bregma und der Injektionsstelle zu ermöglichen. Anwendung von 30% H 2 O 2an der Oberfläche des Schädels hilft Schädelnähte sichtbar zu machen. Positionieren Sie eine Spritze mit Nadel auf der Mikropumpe und manövrieren die Nadelspitze direkt über der Bregma. Set-Koordinaten auf die Ausrichtung Konsole auf Null; Alle Schädel Messungen werden dann reproduzierbar in Bezug auf Bregma gemacht.
Abbildung 3. Repräsentative intrakraniale Xenograft: MRT-Bilder MRI T2 gewichtete Bilder eines Tumors aus (A) 2 x 10 5 Zellen U87 verglichen mit einem Tumor aus (b) abgeleitet von der 2 × 10 5 U251-Zellen.. Von MRT-Bildern von drei einzelnen Mäusen mit U251-Zellen über die Zeit aufgetragen injiziert (c) berechneten Tumorvolumina zeigt eine reproduzierbare Fenster der Tumorentwicklung und Wachstum an, das in allen Experimenten ist.
Abbildung 4. Repräsentative Xenotransplantattumoren: IVIS Bilder. IVIS Bild von U251-Luciferase transduziert GBM Zellen intrakranial in Nacktmäusen (A) eingespritzt. Die Maus auf der linken Seite erfolgreich eingespritzt, wie mit U251-Luc-Zellen und an der gewünschten Stelle beschrieben zeigt eine sehr starke focalized Signal (Photonen / sec). Die Maus auf der rechten zeigt einen erfolglosen Folge falscher Injektionsstelle. H & E-Untersuchung der Wirbelsäule ergeben, das Tumorzellwachstum in der Wirbelsäule von der Injektion zu nahe mit ventrikulären Verbreitung Mittellinie resultieren. (B) Die Tumorgröße wird aus Luciferase-Aktivität abgeschätzt (Photonen / Sekunde) in der Hirnregion von Interesse, aufgetragen über die Zeit. Die blaue Linie entspricht der Maus mit einem erfolgreichen intrakraniale Injektion, während die rote Linie entspricht der Maus mit Tumorzellen Verschiebung der Wirbelsäule.
Abbildung 5. H & E von intrakraniellen Xenotransplantattumoren. Ganze Gehirn von Mäusen wurden gesammelt veröffentlichen Opfer und in Formalin fixiert, in Paraffin gelagert, geschnitten und mit H & E gefärbt. Tumor (A) wurde von U87 GBM Zellen abgeleitet und stellt ein Gebiet mit dichter Tumorwachstum (linke obere Ecke) und angrenzenden normalen Hirngewebe mit mikroskopischen Invasion von malignen Zellen (rechte untere Ecke). Tumor (B) wurde aus einem Teil der Mitte eines Tumors von U251 Zellen stammt GBM gemacht. Der Abschnitt sehr eng repliziert die bizarre Histopathologie mit mehrkernigen malignen Zellen in typischen menschlichen GBM gesehen.
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Discussion
Orthotopen Mausmodell des menschlichen Gehirns Krebs kann ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Beurteilung der Wirksamkeit von klinischen Therapien sein, aber darauf zu achten, um die Platzierung der Zellen im Hirngewebe zu optimieren. Studien haben gezeigt, dass die übermäßige aliquoten Volumen, suboptimal Injektionstechnik und hastig Injektionsraten können zu Undichtigkeiten und dem Auftreten von Tumorzellen in unerwünschten Stellen (Kammern, Rückenmark, extradural Regionen, etc.) Und hohe Variation in der Tumorgröße 2 persönliche Beobachtungen führen ( ). Eine Analyse der mikroprozessorgesteuerte Abgabe von nicht zellulären Proben festgestellt, dass die Verwendung einer Mikropumpe erzeugt mehr focalized Lieferung, weniger Probenrückfluss und weniger Variabilität als manuelle Verfahren der Injektion, um die glatte, gleichmäßige und konsistente Abgabedruck 3 zurückzuführen. Zwar mag es schwierig, die benötigte Anzahl von Zellen in einem Volumen von nur 2 oder 4 ul, die Verwendung eines stereotaktischen Instrument und Ausrichtungskonsole eq kondensierenmit einem programmierbaren Mikropumpe können reproduzierbare und zuverlässige Tumoren mit ähnlichen Wachstumsraten ergeben uipped. Ein Xenograftmodell kann nie wirklich duplizieren die Mikroumgebung, Initiierung und Entwicklung eines natürlich vorkommenden Tumor, insbesondere immungeschwächten Gastgeber, aber ein gut konzipiert und umgesetzt orthotopen Modell ist die beste Alternative und weit überlegen ist eine Eileitermodell.
Der Hauptvorteil des Protokolls ist die Einrichtung nachweisbaren Tumore innerhalb eines einheitlichen Zeitrahmen. Der Zeitpunkt der Tumor Erscheinungsbild abhängig vom Zelltyp und der Anzahl der Zellen injiziert, sondern ist ziemlich vorhersagbar, und die meisten Tumoren werden in einem engen Zeitfenster relativ zu der Dauer des Tumorwachstums (dh die Zeit, bis zum Endpunkt) hergestellt. Dies ermöglicht es dem Forscher, der Zeitpunkte für die Datenerhebung (wie MRT oder IVIS) oder Intervention (wie Drogenbehandlung) zu identifizieren. Tumorwachstumsraten variieren je nach Zelltyp, die Anzahl der Zellen injiziert und from Maus zu Maus (viel wie sie tun, in menschlichen Patienten), aber sind konsistent von Versuch zu Versuch.
Während dieses Protokoll verwendet eine Technik, die mehr Zeit als Instrumentierung und weniger genau manuellen Methoden der Injektion erfordern kann und nicht für Groß Untersuchungen sein, Techniken für intrakranielle Injektionen, die für den Durchsatz einer großen Zahl von Tieren (wie die von Iwami beschrieben erlauben et al. 12) per Definition beinhalten schnelle, Hochdruckeinspritzung und oft mit Hand Instrumentierung und manuelle Messung, die unter Unsicherheit und Ungewissheit sind. Diese Faktoren können mit Leckage und Off-Target-Liefer 2,3 zugeordnet werden. Die Präzision, Reproduzierbarkeit und niedrige Sterblichkeit dieses Verfahrens wird es dem Prüfer, die Behandlung Experimente mit Mäusen weniger um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten Design - eine Nettoersparnis.
Ein Schritt ist entscheidend, um dieErfolg der Tumorimplantation: der genaue Ort der Injektion. Zellen zu nahe an den Ventrikel injiziert kann CSF Ausbreitung von Krankheiten durch das ventrikuläre System oder in extrakranielle Regionen führen. Zellen zu flach eingespritzt wird, durch die Nadelbahn wachsen. Vorgegebenen Koordinaten sind von geringem Wert, wenn Nadelplatzierung ist schlampig. Nehmen Sie sich Zeit, um die Maus Kopf sicher in der stereotaktischen Gerät positionieren. Mit den stereotaktischen Einstellmöglichkeiten und die Ohr Bars, um die Ausrüstung an die Maus passt, und sicherzustellen, dass der Kopf stabil positioniert und werden nicht während des Verfahrens Rock oder Twist. Änderungen oder Variation, wenn die Einstichstelle kann Tumoreigenschaften beeinflussen, einschließlich Tumor nehmen, Wachstum, invasive Potential, und der Zugang zu Medikamentenabgabe und Sauerstoffversorgung.
Andere Parameter, die tiefgreifende Auswirkungen auf die resultierende Tumor sind die Einspritzrate, Zellzahl und Volumen; alle müssen empirisch ermittelt werden. Minimieren Sie die Lautstärke für die NUMBEr von Zellen für das Tumorwachstum notwendig; verwenden Sie die langsamste Injektionsrate praktisch. Zellzahl und der Durchgang Nummer haben auch große Auswirkungen auf das Tumorwachstum und nehmen. Der spezialisierte Ausrüstung verwendet hier bieten überlegene Kontrolle, aber die Konzepte der minimalen Volumen, präzise Ausrichtung, minimale und einheitliche Einspritzrate und langsames Zurückziehen der Nadel kann mit einer Vielzahl von Techniken (einschließlich manueller Injektion) und eine Vielzahl von Instrumenten angewendet werden.
Dieses Verfahren ist für eine Vielzahl von Modifikationen: Die Injektionsstelle kann angepasst werden, um bestimmte Arten von Tumoren zu rekapitulieren. Anhaftenden Gewebekulturzellen, genetisch veränderte Klone, Neurosphären, aufgeschlüsselt Maus Tumoren oder menschlichen Gewebefragmente in eine Maus eingepflanzt werden Gehirn. Diese Technik kann auch für nicht zellulären Studien, einschließlich viralen Gentransfer 3 angepasst werden. Sobald ein Verfahren zur zuverlässigen Herstellung von Tumoren mit den gewünschten Eigenschaften hergestellt ist, Versuche zum effisamkeit von Therapien, medikamentöse Behandlungen und Kombinationen, und andere Optionen, wie Gen-Transfer durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Dr. Keating wird durch DOD Zuschuss CA100335 finanziert und ist ein St. Baldrick Foundation Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
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