Summary
뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.
Abstract
특히 뇌 독특한 생리 학적 및 건축 자질을 가진 사이트에서 시험관과 자궁외 모델은 할 수 없습니다 - 정위 종양 모델은 살아있는 동물의 맥락에서, 현재에 개입하지 않고, 종양 유형의 특성을 연구하는 가장 좋은 방법입니다. 이러한 혈관, 혈액 뇌 장벽, 대사, 약물 전달 및 독성 및 다른 관련 요소의 호스트로서 기능을 차지한다. 동 소성 모델도 자신의 한계를 가지고 있지만, 관심의 적절한 기술 종양 세포가 정확하게 조직으로 접목 할 수와 함께 그 사람의 뇌에서 가장 밀접하게 모방 조건. 정확하게 재현성 생성 될 수 일관된 속도 및 압력 예측 성장률 인간 뇌 종양 마우스 모델에서의 위치를 정의하기 위해 정밀하게 측정 된 볼륨을 제공하며 다양한 중재 신뢰성 분석에 적합한 방법을 사용함으로써. 여기에 설명 된 프로토콜은 TE에 집중chnical 성공 재현 종양의 성장을 설계 및 두개 내 주입을 준비하고, 수술을 수행하고, 보장의 내용과는 다른 뇌종양 모델의 범위를 사용자 정의 할 수있는 다양한 조건 포인트를 시작 제공합니다.
Introduction
뇌 종양 세포의 시험 관내 (in vitro) 연구에서 성장, 생존, 마이그레이션 및 암 세포의 침입을 운전하는 분자 메커니즘을 해부 매우 귀중한 아르; 배양 세포 실험, 신호 전달 경로 정의 잠재적 인 치료 목표를 제시하고, 약물 치료에 대한 세포 반응의 특성을 수 있습니다. 그러나 체외에서 시스템은 의약품에 대한 유기체의 반응을 예측하기가 너무 단순하다; 그들은 생리적 반응, 면역 반응, 세포 미세 환경, 동물 시스템을 생활의 전반적인 이질성이 부족하다. 유전자 조작 모델은 헤아릴 때 사용할 수 있지만, 분자 적 차이는 임상 적 관찰 (1) 동물 모델을 비교할 때 상당한 차이의 결과로, 인간 공정 이벤트 요점을 되풀이하지 않을 수 종 및 뮤린 세포간에 존재. 플랭크의 피부 아래 인간 뇌종양 세포주의 피하 (SQ) 주사를 포함하는 마우스 이종 이식 모델을 수행하기 쉽다및 측정; 그들은 유전자 변형 및 약물 투여 / 전달, 대사 및 독성 효과를 해결하기 위해 사용될 수있다. 중요한 단점은, 그러나, SQ 모델의 유용성을 제한한다. 미세 환경은 자연적으로 발생하는 뇌종양의 요점을 되풀이하지 않습니다 : 다양한 종류의 세포와 조직의 상호 작용을; 뇌 혈관계 고유 로컬 및 무수한 다른 요인은 복제 될 수 없다. 보다 정확하게 천연 뇌종양의 고유 적 환경을 재현하고 약학 개입의 영향을 시험하기 위해, 마우스 동 소성 모델이 이용되어야한다. 또한, 동 소성 기술은 유전자 종양 발생, 또는 인간 간질 세포없이 수정 및 마우스의 관련 사이트에 주입 인간 기본 비 - 암성 세포 (분화 또는 전구)하는 유전 공학적 접근 방법의 일부로서 사용될 수있다 유사한 인간 1에서 볼.
이 문서에서는방법은 정확하고 재현성 생쥐에서 뇌 종양을 만들 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 사용자가 정확히 마우스 대뇌 피질 fronto-두정 시간 영역의 지정된 위치에 현탁 세포의 작은 분취 액을 주입 할 수있다. 마우스의 사망률은 매우 낮습니다; 우리 손에 더 마우스는 185 절차 후 수술 합병증으로 사망 없다. 얻어진 종양의 특성은 전형적인 인간 임상 종양의 것과 비교 될 수있다; 예를 들어 : 성장, 괴사의 정도, 침해의 정도, 세포 유형, 유사 분열 세포의 존재 등의 증식과 세포 자멸사의 마커의 이질성의 인텔리 세포주 또는 세분화 된 인체 조직 또는 종양 샘플은 자신의 능력에 따라 평가 될 수있다 실제 임상 양상을 시뮬레이션합니다. 제약은, 세포 배양에서의 성능에 기초하여 선택, 대사 기능, 순환계 및 혈액 - 뇌 장벽의 문맥에서 시험 될 수 그들은 동물 부담 재치에 존재하는하 종양, 관련 건축 맥락에서 모든. 또한, 주입을 위해 선택된 세포 유전자, 종양의 성장 및 생존에 등 노크 인 돌연변이를 특정 knockdowns, 삭제의 영향을 조사하기 위해 수정 될 수있다.
출판물의 수가 두개 다양한 기술을 이용하여 종양 연구를 문서화. 야마다 등의 알. 염료 및 U87 세포의 주입의 상세한 연구를하고 양과 분사 율을 최소화하는 최적의 종양이 생산하였습니다. . 브룩스 등은 마이크로 프로세서 제어 인젝터보다는 바이러스 벡터를 제공하는 수동 방법을 사용하여 뛰어난 재현성과 효율성을 발견; 최적 주입 파라미터에 관한 그들의 결론 셀 전달 3에 적용 가능하다. Shankavaram 외는. 뇌로 CL의 유전자 발현 프로필을 효과적으로 요약 (수동 방법을 사용하여) 다형성 아교 모세포종 (GBM) 세포주 orthotopically 주입 것으로 보여inical 종양보다 더 가깝게하거나 또는 SQ 체외 이식편의 전임상 연구를 위해 두개 4 모델의 사용을 지원. 지아니니 외은. 추가 마우스의 뇌에 직렬 계대하여 누드 마우스의 옆구리에 유지되었던 사람 수술 표본에서 세포를 주입하고,이 방법은 모델 (5)에 환자의 종양 유전자 변형을 유지하는 것이 나타났다. 비슷한 결과는 이순신 외 (6)에 의해보고되었다. 정위 설치 신중 정의 주사 부위, 및 느린 상승과 분사량을 이용하여, 그들이 일관된 성장 속도 및 높은 (100 %) 생착 레이트로 재현 뇌종양 획득. 이 기술의 유효성 따라서 잘 설립되었습니다; 문헌 조사는이 기술의 응용 프로그램이 광범위 것이 좋습니다. 카티 등은. 성공적으로 transgeni의 전두엽 피질에 치료 유전자를 발현하는 바이러스 벡터를 제공하기 위해 두개 내 주사를 사용알츠하이머 병 (7)의 C 모델입니다. Thaci는 외. 이미 orthotopically 주입 GBM 종양 8 운반 누드 마우스에게 신경 줄기 세포 기반 치료 용 담체에 온 콜리 틱 아데노 바이러스를 제공하는 두개 내 주사의 사용을 설명했다. 분명히, 두개 내 주사는 임상 연구를위한 다양하고 효과적인 도구입니다. 가시화 실험의 저널 이전 출판물 근본적인 접근 방법 9-11을 설명하지만, 우리는 쉬운에 마스터 기술을 사용하여보다 높은 정밀도로 두개 내 종양 주입 및 소성을 모델링의 개념을 가지고.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 설명 된 절차를 검토하고 우리의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1 계획 실험
- 셀을 선택하는 주입한다. 부착 성 세포 배양 라인, 유 전적으로 변형 된 클론, neurosphere 셀, 차 배양, 또는 분해 된 종양 : 다양한 소스로부터 세포를 주입 후보들이다. 원하는 모델의 종류는 분사의 가장 적절한 위치를 정의하는 것이다.
- 주입 세포 수를 결정합니다. 종양을 형성하는데 필요한 세포의 수는 세포주에 따라 다양하고 경험적으로 결정되어야한다; 종양 성장 속도는 세포 유형, 세포 수 및 조직 배양 통과 수에 크게 의존한다. 1 × 104 내지 2 × 105 또는 주입 당 더 많은 범위의 세포 수는 변화 성장률의 종양을 제조했다.
- 주입의 볼륨을 제한합니다. 세포를 혈청이없는 배지 또는 인산염 완충 (S)의 최소 용적에 현탁되어야26 G 바늘을 통해 부드럽고 쉽게 통과를 위해 수 있습니다 알린 (PBS). 더 작은 부피가 실제로 뇌에 전달하며,보다 정확한 결과를 정의 종양; 최적의 결과는 3에서 6 μL에 이르기까지 주입 볼륨에 의해 얻을 수있다. 정확한 측정, 혼합 및 샘플링을 허용하는 관계없이 계획된 주입 수, 부유 세포의 적어도 50 μL의 최종 총 부피를 준비 할 계획이다.
- 모델에 적합한 마우스를 선택합니다. 인간 종양의 쥐 모델은 일반적으로 면역 매개 성 거부 반응을 방지하기 위해 젊은 면역 손상 마우스를 사용합니다. 적절한 예방 조치가 살균, 소독, 재료 및 장비의 살균 포함한 촬영하는 경우 작업이 생물학적 안전 캐비넷에 일어날 필요는 없다. 여기에 표시된 작업은 6 세부터 12 주 사이에, 남성과 여성의 무 흉선 누드 마우스에 완료되었습니다. 어려울 수 있습니다보다 20g 무게 쥐로 위치합니다및 tereotaxic 프레임 저체온증에 더 취약 할 수있다.
2 장비를 조립
- 구하여 마우스에게 고정대, 배향 콘솔, 마우스 가스 마취 헤드 홀더, 또는 마이크로 펌프, 열 패드, 마취 기계, 광섬유 작업 등, 및 가변 속도 회전 드릴 오염을 제거. 청소하고 모든 장비의 오염을 제거.
- 주사기 펌프의 동작에 필요한 변수 및 다른 (레이트, 레이트 단위, 주사기 형 흐름 주입량 포함) 주입 파라미터를 프로그래밍. 각각의 특정 모델에 대한 설정을 최적화 할 수 있습니다.
NOTE : 설정 3,000 NL 샘플 25 μL 주사기 (장치 타입 "E") 비 그룹화에 ( "N") 모드를 사용하여 (레이트 단위 "M") 400 NL / 분의 속도로 된 이러한 주사한다. - 최종 리를하고, 멸균 증류수 여러 린스와 26 G 바늘 정밀 마이크로 실린 (DIH 2 O) 및 70 % 에탄올 (EtOH로)를 청소DIH 2 O.와 NSE 일부를 제외한 모든 모델은 멸균하도록 설계되지. 플런저의 이동이 원활하고 무료 있는지 확인하십시오.
- 마취 배달 장비를 얻습니다. 이 마취 깊이 및 길이를 조절하기 쉽다는 이소 플루 란으로 마취 바람직한 것이다. 정위 장치가 마우스를 마취 가스 첨부하고 필요한 튜브 및 커넥터를 마우스로 취 기계에서 가스 혼합물을 제공하는 장소에 있는지가 장착되어 있는지 확인합니다.
- 좋은 팁 (이빨) 가위,이 집게 / 지혈 봉합을 위해, 중간 크기의 위, 중간과 끝이 뾰족한 핀셋, 적어도이 1mm 치과 드릴 비트를 포함하여 오토 클레이브 수술 도구. 70 % EtOH로, 소독제, 또는 비드 살균기와 절차를 수행하는 동안 청소 도구를 보관하십시오.
- 이소 플루 란으로부터, 진통제, 안연고 / 윤활제, 항생제 연고, 식염수, 30 % 과산화수소 (H 2 O 2), 방부제, 및 원하는 경우 뼈 왁스를 구하는수의학 또는 의료 공급. 멸균 DIH 2 O와 70 %의 EtOH를 준비합니다. 거즈 패드, 멸균 드레싱, 봉합, 에탄올, 면봉,면 스쳐 면봉, 무균 수술 장갑, 수술 블레이드 등과 같은 일회용품은 물질 목록에 항목별로된다. 두개골을 표시하기위한 좋은 팁 영구 마커 오염 제거 및 수술 용으로 전용해야합니다.
3 사출에 대한 세포를 준비
- 여기에 도시 된 실험에서, 불멸화 된 인간 GBM 세포주를 선택한다. 세포 수 (2 × 105)과 경험적으로 주입되는 현탁액의 부피 (3 μL)을 결정하고; 자세한 사항은 세포 유형에 따라 차이가 날 수 있습니다. 정확한 측정, 혼합 및 주입을 용이하게하기 위해 최소 50 μL의 볼륨을 사용합니다.
- 미디어 또는 PBS의 세포에 resuspend을를 Trypsinize. 세포 주입 직전에 다음 단계를 수행 :
- 흡인 세포에서 용지를 제거하고 100mm 플레이트 당 10 ㎖의 PBS로 씻어; PBS를 제거합니다.
- 광고각 100mm 플레이트 D 1 ml의 트립신 및 단일 세포 현탁액을 수득 단지 충분히 RT에서 배양한다.
- 5 트립신의 활동을 중지 ML 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) + 10 % 100mm 플레이트 당 태아 혈청 (FBS).
- 100mm 플레이트 당 ~ 5 ㎖의 무 혈청 DMEM (SF-DMEM)에서 450 XG에 원심 분리 및 재현 탁하여 펠렛 세포.
- hemacytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- 2 × 105 세포 / 3 μL로 살아있는 세포 밀도를 조절 (또는 실험에 의해 결정된 바와 같이) 세포 펠렛과 SF-DMEM에 재현 탁하여.
- 얼음 또는 차가운 팩 (세포가 동결 허용하지 않는)에 차게 세포를 보관하십시오. 손가락 긋기에 의해 부드럽게 섞는다.
(4) 마취 및 수술을 위해 마우스를 준비합니다
- 마취를 사용하여 ~ 5 % 이소 플루 란 (산소 흐름 ~ 2 L / 분) 또는 수의사의 지시에 따라을 유도한다. 유도는 2 분 3를 취해야한다. 적절한 깊이에 마우스를 유지~ 3 % 이소 플루 란으로 마취.
- 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인 표시된 경우 이소 플루 란을 조정하고 절차를 통해 호흡과 발가락 핀치 반응을 모니터링하기 위해 계속합니다. 따뜻함 거즈 패드와 마우스를 커버 및 사출 속도에 따라 1 시간에 45 분 정도 걸릴 수 있습니다 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 마우스를 모니터링 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 혀를 통해 입으로 미각 줄을 밀어 고정대에서 마우스를 놓습니다. 치아에 구멍 앞니 후크. 가능한 한 수평 근처로 귀를 눈 표면, 머리를 안정시키기 위해 귀 막대를 사용합니다. 외이도에 막대를 강요하지 마십시오. 그것은 안전하게 머리를 배치하는 것이 중요합니다 : 손가락 끝으로 부드럽게 나란히과 상하 움직임을 확인합니다. 맞는 최적화 정위 장치의 조정 컨트롤을 사용합니다.
- 안과 연고 눈을 윤활합니다. 두 번 포비돈 - iodin의 교류 응용 프로그램과 함께 눈과 귀 사이의 피부를 청소전자 방부제 및 70 %의 EtOH.
- 측면에 선택 진통 피하 (SQ)를 주입 (또는 감독).
(5) 주입을 수행
- 주사 부위를 결정합니다. 주사 부위는 크기 및 마우스 균주 및 세포의 종류에 따라 달라질 수있다. 심실에 너무 가까이 주입 된 세포는 질병의 cranio - 척추 확산으로 이어질 수 있습니다. 너무 얕은 주입 된 세포는 바늘 트랙을 통해 성장할 수있다.
NOTE : 여기에 도시 된 실험에서, 타겟은 대뇌 피질의 전두부로 정의 하였다 사이트는 2.5 mm (오른쪽), 1.5 mm의 전방 및 브레 그마에 대하여 3.5 mm 복부가 선택되었다 측 방향 (도 1), 제조 20-30g까지 마우스의 중뇌 종양. - 브레 그마 및 주사 부위를 노출 헤드의 피부를 통해 무균 기술을 사용하여 작은 절개 (~ 8mm 길이)을 확인. 정중선 축과 오른쪽 귀쪽으로 우안 (포인트 사이에서 대각선 잘라
- 피부를 후퇴와 두개골의 표면을 건조 멸균 면봉을 사용합니다. 브레 그마를 시각화 H 2 O 2에 적신 다른 면봉으로 뼈를시킨다. H 2 O 2는 브레 그마에서 교차 관상 및 시상 봉합을 따라 하얀 거품의 얇은 선을 떠나, 산소 거품을 생성합니다.
- 마이크로 바늘에 빈 주사기를 잠그고 직접 브레 그마 위에 바늘의 선단을 기동; 세트는 0.0 mm 측면, 0.0 mm의 전방 / 후방 및 0.0 mm 복부 / 지느러미에 정렬 콘솔에서 조정합니다.
- 정위 기기의 컨트롤 노브를 사용하여 2.5 mm 측면 (오른쪽)와 브레 그마 (또는 원하는 위치)에 대한 1.5 mm 전방에 바늘을 이동합니다. 약간 주사기를 올리고 전용 펠트 펜으로 두개골의 정확한 위치를 표시합니다. 두개골의 외부 표면은 브레 그마 (Ⅰ와 평면 레벨에 있지 않으면.전자., 지느러미 / 복부 좌표 더 이상 리셋)에 0이 표시 복부 / 지느러미 0.0에 읽는 주사의 깊이가 이동되지 않도록합니다.
- 단계 5.5에서 펜으로 표시 해당 사이트에서 멸균 치과 팁이 장착 휴대용 회전 드릴로 두개골에 작은 구멍을 뚫는다. 두개골 각도로 드릴을 잡고 아주 부드럽게 뼈 끝을 터치합니다. 필요에 따라 반복합니다. 실제로 두개골의이 층을 관통하는 바늘을 떠나 뼈를 통해 거의가 아니라 완전히 드릴링, 깨끗한 주입의 결과.
- PBS 또는 식염수에 적신 면봉으로 뼈 먼지를 제거합니다. 펌프에 주사기를 돌려과 위치를 확인하기 위해 아래로 똑바로 버 구멍에 바늘을 낮 춥니 다. 버 홀을 바늘로 중앙에 있지 않은 경우, 개구를 확대 된 드릴을 사용한다.
- 부드럽게 세포 현탁액을 혼합하고 펌프 제어기를 사용하여 주사기로 세포를 그린다. 거품 덩어리를 피하고 바늘 재치를 닦아알코올 면봉 시간은 외부 표면에 오염 세포를 제거합니다. 주사기 / 바늘이 막히거나 동결하는 경우, 제거하고 멸균 70 % EtOH로 빠르게 청소.
- 두개골 표면의 레벨까지 바늘 (0.0 mm 복부 / 지느러미)을 내린다. 그런 다음 천천히 이상 (약 1 분) 두개골의 전체 두께를 관통하고 4mm의 ventrall의 깊이로 뇌를 관통하는 바늘을 낮 춥니 다. 복부 3.5 mm 천천히 바늘을 철회. 마우스 헤드 정위 부에 고정 유지되는 경우, 두개골의 움직임이 거의 없어야한다.
- 올바른 매개 변수가 펌프 컨트롤러에 입력되어 있는지 (2.2 절)을 입력하고 Enter 키를 눌러 "RUN / STOP"을 확인 (또는 제품 설명서의 지시에 따라) 세포를 autoinject 할 수 있습니다. 마우스를 모니터하고 표시하는 경우 이소 플루 란을 조정합니다. 주사기를 보면서 플런저 배럴에 이동되어 있는지 확인합니다. 냉동 또는 막힌 운동은 굴곡 / 깨진 플런저가 발생할 수 있습니다.
- B의 바늘로 2 분에 일을 기다립니다비는 매우 천천히 (3-4 분 이상) 조직에서 바늘을 철회. 주사가 완료된 후 바늘을 제거하는 전체 시간은 5 분이다. 버 구멍 주위를 지워하기 위해 면봉을 사용하여; 뼈가 건조 할 수 있도록 열려있는 피부의 가장자리를 둡니다.
- 펌프에서 주사기를 제거하고 신속하게 70 % EtOH로, 멸균 H 2 O 3 배를 배를 세척, 멸균 H 2 O 3 배 (또는 메이커의 지시에 따라). EtOH로 바늘을 닦아 따로 설정합니다.
- 버 구멍 (1 또는 2 μL에 해당) 멸균 뼈 왁스를 적용하고에 뼈에 왁스를 탐포하는 멸균 면봉의 나무 끝을 사용합니다. 표면을 충분히 건조 할 경우, 부착한다.
- 마우스와 주변의 작업 영역을 통해 무균 드레이프 확산 절개 봉합; 세 바늘은 충분합니다. 다르게는, 수술 접착제가 사용될 수있다. 국소 항생제를 적용합니다.
- 0 %로 이소 플루 란을 줄이고 C 인, 정위 장치에서 마우스를 제거치아를 보호하기 areful. 귀, 입과 혀를 확인합니다.
- 밀접하게 주입 다음 마우스를 모니터링합니다. 5 분 ~ 10에 대한 열 패드의 장소 마우스; 다음 (열 패드) 케이지에 전송하고 마우스가 깨어 및 외래 될 때까지 관찰한다. 이 흉골로 누워을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. 통증의 징후가 발견 된 경우 추가 진통제의 사용을 고려한다.
6 마침 모니터 복구 및 종양 개발
- 70 % EtOH로, 마우스 사이에 비드 소독 또는 살균 소독제를 사용하여 청소 모든 악기 및 장비.
- 통증, 감염 또는 기타 합병증의 징후 시술 후 이틀 동안 주입 된 쥐를 모니터링합니다. 시술 후 24 및 48 시간 (또는 지시)에 진통제를 주사. 필요한 경우, 7~10일에 봉합사를 제거합니다.
- 질병, paralysi의 임상 증상의 쥐를 평가S, 체중 감소, 발작, 또는 일반적 질병 활성을 감소시켰다.
- [생체 이미징 시스템에서 자기 공명 영상 (MRI), (IVIS) 등] 적절한 방법으로 종양 발생을 모니터링합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
신뢰할 수있는 두개 내 이종 이식이 설명 된 기술로 만들 수 있습니다. 마우스 두개골의 중요한 구조 (그림 1) 식별 브레 그마의 인식을 허용하고 정확하고 재현성 주입 위치에 수사관을 안내합니다. 이러한 연구에서 U251 부모 행은, 루시퍼 라제 (U251 뤽) 또는 U87 형질 U251 세포는 인간 GBM 조직 배양 세포는 SF-DMEM 4-6 μL에 현탁 불멸화 및 2.5 mm (오른쪽) 측면, 1.5 mm 전방 주입 , 그리고 브레 그마에 대해 3.5 mm 복부 (그림 2).
얻어진 종양 시각화 및 자기 공명 영상 (MRI,도 3), 생체 내 형광 영상 (IVIS,도 4), 또는 루틴 병리학 적 기법 (H & E 염색,도 5)에 의해 분석 될 수있다. 특별한주의를 기울여야합니다 및 최적화는 appropria을 결정하기 위해 수행TE 세포 주입의 위치는 원하는 타이밍, 성장율, 및 종양 모델을 표현한다.
그림 1의 두개골 해부학입니다. 마우스 머리와 두개골의 해부학 적 특성이 도시되어있다. 눈과 관상면과 시상 봉합의 교차점에서 귀 사이의 중간 선 축에 브레 그마는, 재현성 사출 좌표를 찾는 데 사용됩니다.
그림 2 절개 및 사출지도. 주사 부위를 피부 절개를 결정하고 정확하게 찾는 데 특징이 도시되어있다. 대각선 절개 브레 그마 및 주사 부위 모두에 액세스 할 수 있도록 만들어진다. 30 %의 H의 적용이 O이두개골의 표면에 두개골 봉합을 시각화하는 데 도움이됩니다. 마이크로에 바늘 주사기를 놓고 브레 그마 바로 위에 바늘 끝을 기동. 집합은 제로로 정렬 콘솔 좌표; 모든 두개골 측정은 다음 재현성 브레 그마에 대해 만들어집니다.
도 3 주제 두개 내 종양 이종 이식 : MRI 이미지 MRI T2보기 (B)로부터 유도 된 종양과 비교 (A) 2 × 10 5 U87 세포를 2 × 5 U251 세포로부터 유래 된 종양의 가중 된 이미지.. 시간이 지남에 그려 U251 세포를 주입 세 개인 마우스의 MRI 이미지에서 계산 (C) 종양 볼륨은 모든 실험에서 일관성이 종양 발생과 성장의 재현 창을 보여줍니다.
그림 4 대표 이종 이식 종양 : IVIS 이미지. U251-루시퍼 라제의 IVIS 이미지 누드 마우스 (A)으로의 두개골 내에 주입 GBM 세포를 형질 도입. 원하는 위치에 루크 U251 세포 설명과 매우 강한 focalized 신호 (광자 / 초)와 같이 왼쪽 마우스 성공적으로 주입 하였다. 오른쪽 마우스 부적절한 주입 위치에서 실패하는 결과를 보여줍니다. 척추의 H & E 검사는 심실 보급과 중간 선에 너무 가까이 주입으로 인한 척추에 종양 세포의 성장을 한 것으로 밝혀졌습니다. (B) 종양의 크기는 루시퍼 라제 활성로부터 추정, 뇌의 관심 영역 (/ 초 광자)은 시간이 지남에 플롯. 적색 선은 척추 종양 세포와 마우스의 변위에 대응하면서 청색 라인은, 성공적인 두개 내 주입으로 마우스에 대응한다.
두개 내 이종 이식 종양의 그림 5 H & E. 전체 뇌는 쥐가 희생을 게시에서 수집 포르말린에 고정 된 파라핀에 장착, 단면 및 H & E 염색을 하였다. 종양은 (A) U87 GBM 세포 유래의 조밀 종양 성장 (좌측 상부 모서리) 및 악성 세포 (오른쪽 아래 코너)의 미세 침윤 인접 정상 뇌 조직의 영역을 도시 하였다. 종양 (B)의 GBM U251 세포로부터 유래 된 종양의 중심 부분에서 촬영했다. 섹션은 매우 밀접 보통 사람의 GBM에서 볼 다핵 악성 세포와 기괴한 조직 병리학을 복제합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
인체 뇌암의 동 소성 마우스 모델은 임상 치료의 효과를 평가하기위한 훌륭한 도구 일 수 있지만, 뇌 조직에서 세포의 위치를 최적화하기 위해 수행해야 상관있다. 연구는 과도한 나누어 볼륨, 최적 주입 기술과 성급한 사출 속도는 (종양의 크기 2 leakiness 바람직하지 않은 위치 (심실, 척추, 경막 지역, 등.)에서 종양 세포의 모양과 높은 변화에 개인 관측을 이끌 수 있다는 것을 보여 주었다 ). 비 세포 샘플의 마이크로 프로세서 기반의 배달의 분석은 마이크로의 사용이 더 focalized 배달, 적은 샘플 역류와 부드럽고 균일하게 전달하고 일관된 압력 3에 의한 주입 수동 방법보다 적은 변동성을 생산 것을 발견했다. 오직 2 또는 4 μL, 정위 악기와 배향 콘솔 당량의 사용 양에 필요한 세포의 수를 응축하기 어려울 수도 있지만비슷한 성장 속도와 재현성 및 신뢰성있는 종양을 생성 할 수있는 프로그램 가능한 마이크로 펌프 uipped. 이종 이식 모델은 진정한 특히 면역 결핍 호스트로, 자연적으로 발생하는 종양 미세 환경, 개시 및 개발을 복제 할 수 없다, 그러나 잘 설계되고 구현 동 소성 모델은 최상의 대안과 자궁외 모델보다 훨씬 우수하다.
이 프로토콜의 주요한 장점은 일정한 기간 내에 검출 종양의 확립이다. 종양의 출현 타이밍은 세포 유형 및 분사 셀의 수에 의존하지만, 비교적 예측 가능하고, 대부분의 종양은 종양의 성장 (즉, 엔드 포인트까지의 시간)의 재생 시간에 상대적인 시간의 좁은 윈도우 내에서 설정된다. 이 데이터 (예 : MRI 또는 IVIS)를 수집 또는 개입 (예 : 약물 치료 등) 시간의 점을 확인하는 연구를 할 수 있습니다. 종양 성장 속도는 세포 유형, 세포의 수를 주입하고, FR과 다를(그들은 인간의 환자에서 할만큼)하지만, 실험 실험에서 일관성을 마우스로 톰 마우스입니다.
이 프로토콜이 기술을 사용하는 동안 분사 덜 정확한 수작업 이상 계측 시간이 필요할 수 있으며, 대규모 연구에 적용되지 않을 수 있으며, 이때 미 설명되도록 같은 동물의 다수 (처리량을 허용 두개 내 주사를위한 기술 등. 12) 정의에 의해 빠른, 고압 분사를 포함하고 종종 비정상과 불확실성이 적용됩니다 휴대용 계측 및 수동 측정을 포함한다. 이러한 요소 누설 및 오프 대상 배달 2,3과 관련 될 수있다. 순 저축 - 정밀도, 재현성,이 절차의 낮은 사망률은 연구자가 통계 학적으로 유의 한 결과를 얻기 위해 적은 수의 마우스를 사용하여 치료 실험을 설계 할 수 있습니다.
한 단계는 중요하다종양 이식 성공 : 분사의 정확한 위치. 심실에 너무 가까이 주입 된 세포는 심실 시스템을 통해 또는 extracranial 지역으로 질병의 CSF의 확산으로 이어질 수 있습니다. 너무 얕은 주입 된 세포는 바늘 트랙을 통해 성장할 수있다. 바늘의 위치가 실수 인 경우 소정의 좌표는 작은 값이다. 정위 장치에 안전하게 마우스 머리의 위치를 시간을 가지십시오. 마우스에이 장치에 맞게, 그리고 머리가 안정적으로 위치 및 절차를 수행하는 동안 바위 또는 트위스트되지 않도록하기 위해 정위 조정 옵션과 귀 막대를 사용합니다. 변화 또는 변형은 주사 부위는 종양 인출, 성장, 침윤성 전위, 및 약물 전달 및 산소 공급에 대한 액세스를 포함하여, 종양 특성에 영향을 미칠 수있는 경우.
얻어진 종양에 지대한 영향을 미치는 기타 파라미터는 사출 속도, 세포 수와 체적을 포함한다; 모든 경험적으로 결정해야합니다. numbe의 볼륨을 최소화종양 성장에 필요한 세포의 R; 실제 가장 느린 주입 속도를 사용합니다. 세포 수와 통과 수는 종양 포획 및 성장 속도에 큰 효과가있다. 여기에서 사용 된 특수 장비는 우수한 제어를 제공하지만, 최소한의 볼륨을 정확하게 타겟팅을 최소화하고 일관된 사출 속도 및 느린 바늘 인출 개념 (수동 주사 포함) 다양한 기술과 다양한 악기들에 적용될 수있다.
이 절차는 수정의 다양한 열려 : 주사 부위의 종양 특정 유형의 요점을 되풀이하도록 사용자 정의 할 수 있습니다. 부착 성 조직 배양 세포, 유전자 재조합 클론 neurosphere를, 세분화 된 마우스의 종양, 또는 인체 조직 단편을 마우스 뇌에 접목 될 수있다. 이 기술도 바이러스 유전자 전달 3 포함한 비 세포 연구를 위해 적응 될 수있다. 안정적으로 원하는 특성의 종양의 제조 방법이 확립되면, 실험을 비교 effi치료, 약물 치료 및 이들의 조합과 같은 유전자 전달과 같은 다른 옵션 cacy이 수행 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
박사 키팅은 DOD 부여 CA100335에 의해 투자되고, 세인트 Baldrick의 재단 장학생이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
