Summary
Hjernen er et unikt område med egenskaper som ikke er godt representert ved in vitro eller i ektopiske analyser. Ortotopiske musemodeller med reproduserbare beliggenhet og vekstegenskaper kan bli pålitelig laget med intrakranielle injeksjoner ved hjelp av en stereotaxic fiksering instrument og et lavtrykk pumpe.
Abstract
Ortotopiske tumormodeller er for øyeblikket den beste måten å studere egenskapene til en tumor type, med og uten intervensjon, i sammenheng med et levende dyr - spesielt i områder med unike fysiologiske og arkitektoniske kvaliteter som hjernen In vitro og ektopiske modeller ikke kan. står for funksjoner som blodkar, blod-hjerne barrieren, metabolisme, levering av legemidler og giftighet, og en rekke andre relevante faktorer. Ortotopiske modeller har sine begrensninger også, men med riktig teknikk kreftceller av interesse kan være nøyaktig innpodet i vev som best etterligner forholdene i den menneskelige hjerne. Ved å ansette metoder som leverer presist målt volumer til nøyaktig definerte steder i en jevn hastighet og trykk, musemodeller av menneskelige hjernesvulster med forutsigbare vekstrater kan reproduserbart laget og er egnet for pålitelig analyse av ulike intervensjoner. Protokollen er beskrevet her fokuserer på technical detaljer om å designe og forbereder en intrakraniell injeksjon, utføre operasjonen, og sikre en vellykket og reproduserbar tumorvekst og gir utgangspunkt for en rekke forhold som kan tilpasses for en rekke ulike hjernetumormodeller.
Introduction
In vitro-studier av hjernekreftceller er uvurderlig for dissekere molekylære mekanismer driver veksten, overlevelse, migrasjon og invasjon av kreftceller; dyrkede celle eksperimenter kan definere signalveier, foreslår potensielle terapeutiske mål, og karakter cellulær respons på medikamentell behandling. Men in vitro systemer er altfor forenklede å forutse organisme respons på legemidler; de mangler de fysiologiske reaksjoner, immunreaksjoner, celle mikromiljøet, og generell heterogenitet av levende dyr systemer. Genmanipulerte modeller kan være uvurderlig, når det er tilgjengelig, men molekylære forskjeller mellom arter og murine celler kan ikke rekapitulere hendelser i menneskelige prosesser, noe som resulterer i betydelige avvik når man sammenligner dyremodeller til kliniske observasjoner en. Mus xenograft-modeller som involverer subkutan (SQ) injeksjon av humane hjernetumorcellelinjer under huden på den flanken som er enkle å utføreog måle; de kan brukes til å adressere virkninger av genet modifikasjon and Drug Administration / levering, metabolisme og toksisitet. Vesentlige ulemper, men begrenser nytten av SQ-modeller. Den mikromiljøet ikke rekapitulere det av en naturlig forekommende hjernesvulst: interaksjonene mellom ulike celletyper og vev; den lokale vaskulatur, og utallige andre faktorer som er unik for hjernen, kan ikke replikeres. For mer nøyaktig gjengir den unike miljø av en naturlig forekommende hjernesvulst og teste effekten av farmasøytiske intervensjoner, bør en mus orthotopic modellen utnyttes. Videre kan ortotopiske teknikker bli brukt som en del av en genetisk konstruert tilnærming der humane primære ikke-kreftceller (differensiert eller progenitor) er genetisk modifisert, og injiseres i det aktuelle området for en mus, med eller uten humane Stroma-celler, noe som resulterer i tumorigenesis lik den som ses hos mennesker en.
Denne artikkelen beskriveren metode for å presist og reproduserbart skape hjernesvulster hos mus. Ved hjelp av denne teknikken, kan brukeren nøyaktig injisere en liten delmengde av suspendert celler i en bestemt plassering av fronto-parieto-tinning muse hjernebarken. Mus dødeligheten er svært lav; i våre hender, har ingen mus døde av kirurgiske komplikasjoner etter 185 prosedyrer. Kjennetegn ved den resulterende svulst kan sammenlignes med det typiske kliniske svulster; for eksempel: hurtighet av vekst, grad av nekrose, omfanget av invasjonen, heterogenitet av celletype, tilstedeværelse av mitotiske celler, markører for spredning og apoptose, etc. cellelinjer eller disaggregerte menneskelig vev eller tumorprøver kan da bli vurdert basert på deres evne å simulere faktiske klinisk presentasjon. Pharmaceuticals, valgt basert på deres prestasjoner i cellekultur, kan testes i sammenheng med et fungerende metabolisme, sirkulasjonssystemet, og blod-hjerne barrieren som de eksisterer i et dyr tynget viddhektar tumor, alt i en relevant arkitektonisk sammenheng. Videre kan cellene valgt til injeksjon være genetisk endret for å undersøke effekten av spesifikke knockdowns, slettinger, knock-ins, mutasjoner, etc. på tumorvekst og overlevelse.
Et antall publikasjoner dokumentere svulster studier ved hjelp av en rekke intrakraniale teknikker. Yamada et al. Gjorde en detaljert studie av injeksjon av fargestoff og av U87-celler, og funnet ut at å minimalisere volum og injeksjonshastighet ga best tumor 2. . Brooks et al funnet overlegen reproduserbarhet og effektivitet ved hjelp av en mikroprosessorstyrt injektor i stedet for en manuell metode til å levere virale vektorer; sine konklusjoner om optimale injeksjons parametre gjelder for celle levering tre. Shankavaram et al. Viste at glioblastoma multiforme (GBM) cellelinjene injisert orthotopically (ved hjelp av en manuell metode) inn i hjernen rekapitulert genekspresjonen profil av clinical svulster tettere enn både in vitro eller SQ xenografts, støtter bruk av intrakranielle modeller for prekliniske studier fire. Giannini et al. Injiserte celler fra menneskelige kirurgiske prøver som hadde blitt påført i flankene av nakenmus av serieaging inn i hjernen til flere mus, og viste at denne tilnærmingen bevart pasient svulst genet endringer i modellen fem. Lignende resultater ble rapportert av Yi et al seks. Ved hjelp av en stereotaxic oppsett, nøye definert injeksjonsstedet, og en langsom og jevn injeksjonshastighet, fikk de reproduserbare hjernesvulster med konsistent vekst og høy (100%) engraftment rate. Gyldigheten av denne teknikken har derfor blitt godt etablert; litteratursøk antyder at bruk av denne teknikken er omfattende. Carty et al. Brukt intrakranielle injeksjoner for å kunne levere virale vektorer som uttrykker terapeutiske gener inn i frontal cortex av transgenic modell av Alzheimers sykdom syv. Thaci et al. Beskrev bruken av intrakranielle injeksjoner for å levere terapeutiske onkolytisk adenovirus i en nevral stamcelle basert carrier i nakne mus allerede bærer orthotopically injisert GBM svulster åtte. Åpenbart intrakranielle injeksjoner er et allsidig og effektivt verktøy for preklinisk forskning. Tidligere publikasjoner i The Journal of visualisert Experiments beskrive grunnleggende tilnærminger 9-11, men vi tar begrepet intrakraniell tumor injeksjon og orthotopic modellering til et høyere nivå av presisjon ved hjelp av enkle å mestre teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av vår institusjonelle dyr omsorg og bruk komité.
1. Planlegg Experiment
- Velge celler som skal injiseres. Celler fra en rekke kilder er kandidater for injeksjon: heftcellekultur linjer, genmodifiserte kloner, neurosphere elementer, kulturer, eller disaggregerte svulster. Den type modell ønskede vil definere den mest passende injeksjonsstedet.
- Bestem celle nummer for injeksjon. Antallet celler som kreves for å danne tumorer varierer med cellelinjen og må bestemmes empirisk; tumor vekst er svært avhengig av celletype, celle nummer og vev kultur passasje nummer. Celle tall fra 1 x 4-2 oktober x 10 5 eller mer per injeksjon har produsert svulster av varierende vekstrater.
- Begrenser volumet til injeksjon. Cellene bør være suspendert i det minste volum av serum-frie medier eller fosfatbufrede sAline (PBS) som gjør det mulig for en jevn og enkel passasje gjennom en 26 G nål. Jo mindre volum som faktisk blir levert inn i hjernen, desto mer presis og definert den resulterende tumor; optimale resultater oppnås ved å injisere volumer som strekker 3-6 pl. Plan for å klargjøre en endelig samlet volum på minst 50 pl av suspenderte celler, uavhengig av det antall injeksjoner planlagt, for å tillate nøyaktig måling, blanding og prøvetaking.
- Velg riktig mus for modellen. Murine modeller av humane tumorer vanligvis utnytte unge svekket immunforsvar mus for å unngå immun mediert pode avvisning. Det er ikke nødvendig for at arbeidet skal foregå i et biologisk sikkerhetskabinett hvis riktige forholdsregler er tatt, inkludert rensing, desinfisering og sterilisering av materialer og utstyr. Arbeidet som vises her er blitt gjort i atymiske nakne mus, mannlige og kvinnelige, mellom 6 og 12 ukers alder. Mus som veier mindre enn 20 g kan være vanskelig å plassere på somtereotaxic ramme og kan være mer utsatt for hypotermi.
2. Fest Utstyr
- Få tak i og decontaminate en mus stereotaxic ramme, justering konsoll og mus gass anestesi hodet holder, en mikro pumpe, varmepute, anestesi maskin, fiberoptisk arbeidslampe, og variabel hastighet roterende drill. Rengjøre og rense alt utstyr.
- Programmere injeksjonsparametere (inkludert injeksjonsvolum, strømningshastighet, hastighet enheter, type sprøyte) og andre størrelser som er nødvendig for drift av sprøytepumpen. Optimalisere innstillinger for hver enkelt modell.
MERK: I disse injeksjonene innstillingene var 3000 nl prøver med en hastighet på 400 nl / min (rente enheter "M") ved hjelp av en 25 mL sprøyte (Enhetstype "E") i den ikke-gruppert ("N") modus. - Rengjør en presisjon en mikro med 26 G nål med flere skyllinger sterilt avionisert vann (Dih 2 O) og 70% etanol (EtOH), gjør en endelig riNSE med DIH 2 O. Noen, men ikke alle modeller er designet for å autoklaveres. Sørg for at stempelet bevegelse er glatt og gratis.
- Skaff anestesi leveringsutstyr. Isofluran er den foretrukne bedøvelse som det er lett å regulere dybden og varigheten av anestesi. Kontroller at stereotaxic enheten er utstyrt med en mus anestesi gass vedlegg og at nødvendig slange og kontakter er på plass for å levere gassblandingen fra anestesiapparatet til musen.
- Autoklav kirurgiske verktøy, inkludert fin spiss saks, to pinsett / hemostats (med tenner) for suturering, mellomstore saks, middels og tynn pinsett, og minst to 1 mm tannborekroner. Hold instrumenter rent under inngrepet med 70% EtOH, desinfeksjonsmiddel, eller en perle sterilisator.
- Skaff isofluran, analgetisk, oftalmisk salve / smøremiddel, antibiotisk salve, saltvann, 30% hydrogenperoksyd (H 2 O 2), antiseptisk, og benvoks (hvis ønskelig) fra enveterinær eller medisinsk forsyning. Forbered steril DIH 2 O og 70% EtOH. Forbruksmateriell som gasbind pads, sterile bandasjer, sting, etanol vattpinner, bomull tippet vattpinner, sterile kirurgiske hansker, kirurgiske kniver og flere er spesifisert i listen over materialer. En fin spiss permanent markør for merking skallen bør renses og dedikert for kirurgisk bruk.
3. Forbered Cells for injeksjon
- I forsøkene som vises her, velg en foreviget menneskelig GBM cellelinje. Bestem antall celler (2 x 10 5) og volumet av suspensjonen som skal injiseres (3 mL) empirisk; detaljer kan variere med celletype. Bruk et volum på minst 50 pl for å lette nøyaktig måling, blanding og injisering.
- Trypsinize celler og resuspender i media eller PBS. Utfør følgende trinn like før celle injeksjon:
- Fjern media fra cellene ved aspirasjon og skyll med 10 ml PBS per 100 mm plate; fjerne PBS.
- Add 1 ml trypsin til hver 100 mm plate og inkuberes ved RT akkurat lenge nok til å gi en enkeltcelle-suspensjon.
- Stopp trypsinaktivitet med 5 ml Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) + 10% fetalt bovint serum (FBS) per 100 mm plate.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 450 xg og resuspender i ~ 5 ml serum gratis DMEM (SF-DMEM) per 100 mm plate.
- Count levedyktige celler ved hjelp av en hemacytometer eller en automatisert celleteller.
- Juster levende celletetthet på 2 x 10 5 celler / 3 mL (eller som bestemt ved eksperimentering) ved å pelletere cellene og resuspendere i SF-DMEM.
- Hold celler kjølt på is eller en chill pakke (ikke tillater cellene å fryse). Bland forsiktig med fingerFlikKing.
4. Anesthetize og Forbered mus for kirurgi
- Indusere anestesi ved hjelp av ~ 5% isofluran (oksygen ~ 2 L / min) eller som anvist av veterinær. Induksjon bør ta 2 til 3 min. Oppretthold musen på en tilstrekkelig dybdeav anestesi med ~ 3% isofluran.
- Sjekk anestesidybden ved tå klype, justere isofluran hvis indisert og fortsette å overvåke pust og tå klype respons gjennom hele prosedyren. Dekker mus med gasbind puter for varme og overvåke mus jevne gjennom hele prosedyren, noe som kan ta 45 minutter til 1 time, avhengig av hastigheten av injeksjon.
- Sett musen i stereotaksisk ramme ved forsiktig å skyve ganen bar over tungen og inn i munnen. Hekt de fremre fortenner i tannen hullet. Bruk hørsels barer å stabilisere hodet, med øret til øye overflaten så nær horisontalt som mulig. Ikke tving barer i øregangen. Det er viktig å plassere hodet på en sikker måte: kontrollere side-til-side og opp-og-ned-bevegelse av forsiktig med fingertuppene. Bruk de justerbare kontroller av stereotaxic enhet for å optimalisere passform.
- Smør øynene med øyensalve. Rengjør huden mellom ører og øyne to ganger med vekslende bruk av en povidon-iodine antiseptisk og 70% EtOH.
- Injisere valgt analgetisk subkutant (SQ) inn flanke (eller som anvist).
5. Utfør Injection
- Bestem injeksjonsstedet. Injeksjonsstedet kan variere med størrelsen og stamme av mus og typen av celle. Celler injisert for nær ventriklene kan føre til cranio-spinal spredning av sykdommen. Celler injisert for grunt kan vokse ut gjennom nålen spor.
NB: I forsøkene som er vist her, er målet definert som den fremre delen av hjernebarken et område 2,5 mm lateral (til høyre), 1,5 mm anterior, og 3,5 mm ventralt i forhold til bregma ble valgt (figur 1), som produserer en midthjernen tumor hos mus fra 20 til 30 g. - Lag et lite snitt (~ 8 mm lang) ved hjelp av steril teknikk gjennom huden av hodet for å eksponere bregma, og injeksjonsstedet. En diagonalt snitt, fra et punkt mellom midtlinjen aksen og høyre øyet mot høyre øre (
- Trekk inn i huden og bruke en steril vattpinne for å tørke overflaten av kraniet. Blot bein med en annen pinne fuktet med H 2 O 2 for å visualisere bregma. H 2 O 2 vil produsere oksygen bobler, forlater tynne linjer med hvitt skum langs koronale og sagittal sting som krysser hverandre på bregma.
- Låse en tom sprøyte med kanyle på Micro og manøvrere spissen av nålen direkte over bregma; sett koordinater på justeringen konsollen til 0,0 mm lateral, 0,0 mm anterior / posterior, og 0,0 mm ventral / rygg.
- Flytte nålen til 2,5 mm lateral (th) og 1,5 mm anterior med hensyn til bregma (eller ønsket plassering) ved hjelp av bryterne på stereotaxic enhet. Hev sprøyten litt og markere den nøyaktige plasseringen på skallen med en dedikert tusjpenn. Hvis den ytre overflate av hodeskallen ikke er på et nivå med planet bregma (i.e., dorsal / ventral koordinaten ikke lenger står null), tilbakestiller den ventrale / dorsal lesing til 0,0 for å sikre at dybden av injeksjonen ikke er forskjøvet.
- Bore et lite hull i skallen med en hånd-holdt roterende bore utstyrt med et sterilt tannspissen på hensiktsmessig sted som er merket med pennen i trinn 5.5. Hold drillen i en vinkel til skallen og berører svært forsiktig tuppen til beinet. Gjenta etter behov. Boring nesten, men ikke helt gjennom benet, slik at nålen for å faktisk trenge gjennom dette lag av skallen, resulterer i det reneste injeksjon.
- Fjern bein støv med en bomullspinne fuktet i PBS eller saltvann. Returner sprøyten til pumpen og senke nålen rett ned til graden hullet for å bekrefte plasseringen. Dersom graden hullet ikke er sentrert med nålen, å bruke boret for å forstørre åpningen.
- Bland forsiktig cellesuspensjonen og trekke cellene inn i sprøyten ved hjelp av pumperegulatoren. Unngå bobler og klumper og tørk nålen viddh en alkoholtørk for å fjerne kontaminerende celler på den ytre overflate. Hvis sprøyten / nålen er tett eller frosset, fjerne og raskt rent med sterilt vann og 70% EtOH.
- Senke nålen til nivået av skalleoverflaten (0,0 mm ventralt / dorsal). Deretter langsomt (i løpet av omtrent 1 min) senke nålen til å stikke gjennom den fulle tykkelse av skallen og trenge inn i hjernen til en dybde på 4 mm ventrall. Trekk nålen langsomt til 3,5 mm ventral. Hvis muse hodet holdes sikkert i stereotaxic enhet, bør det være nesten ingen bevegelse av skallen.
- Bekrefte at de riktige parametrene er inngått pumpekontrolleren (§ 2.2) og trykk "RUN / STOP" (eller som anvist av produktmanualen) til autoinject celler. Overvåk musen og justere isofluran hvis indisert. Se sprøyten og sikre at stempelet beveger seg i tønnen. Frosset eller tilstoppet bevegelse kan resultere i en bøyd / brutt stempelet.
- Vent 1 til 2 min med nålen i bregn, så veldig sakte (over 3 til 4 min) trekke nålen fra vev. Total tid for å fjerne nålen etter at injeksjonen er fullført er 5 min. Bruk en bomullspinne for å utslette området rundt graden hull; la kantene av huden åpen for å tillate at bein for å tørke.
- Fjern sprøyten fra pumpen og raskt skylle 3x med steril H 2 O, 3x med 70% EtOH, og 3x med steril H 2 O (eller som anvist av trakter). Tørk nål med EtOH og sett til side.
- På steril benvoks (ekvivalent med 1 eller 2 mL) til burr hullet, og bruk av tre ende av en steril vattpinne for å tamp voks på og inn i benet. Hvis overflaten er tørket tilstrekkelig, bør det sitte fast.
- Spre steril drapere over musen og rundt arbeidsområdet og sy såret; tre sting bør være tilstrekkelig. Alternativt, kan kirurgisk klebemiddel benyttes. Påfør en aktuell antibiotika.
- Reduser isofluran til 0% og fjerne musen fra stereotaxic enhet, være careful å beskytte tennene. Sjekk ørene, munnen og tungen.
- Overvåk musen tett etter injeksjon. Plasser musen på en varmepute for 5 til 10 min; deretter overføre til bur (på varme pad) og observere før musen våkner og er oppegående. Ikke la musen ubetjent før den har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbence. Ikke returner musen til selskap med andre dyr før fullt restituert. Vurdere bruk av ytterligere smertestillende hvis tegn til smerte blir lagt merke til.
6. Avslutt og Monitor Recovery & Tumor Development
- Rengjør alle instrumenter og utstyr som bruker 70% EtOH, en perle sterilisator eller desinfeksjonsmiddel mellom mus.
- Overvåk de injiserte mus til to dager etter inngrepet for tegn på smerte, infeksjon eller andre komplikasjoner. Injisere smertestillende på 24 og 48 timer (eller som angitt) etter prosedyren. Fjern suturer på 7 til 10 dager, om nødvendig.
- Vurdere mus for kliniske tegn på sykdom, paralysis, redusert aktivitet, vekttap, kramper eller generell sykdom.
- Overvåke svulsten utvikling av den aktuelle metoden [magnetic resonance imaging (MRI), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc.].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pålitelige intrakranielle xenografts kan lages med dette beskrevet teknikk. Identifisering av de kritiske strukturer av museskallen (figur 1) gjør det mulig for erkjennelse av bregma, og lede undersøkeren til en nøyaktig og reproduserbar injeksjon sted. I disse studiene var foreldrelinje U251, U251-celler transfektert med luciferase (U251-Luc), eller U87 udødelig humane GBM vevskultur-celler ble suspendert i 4-6 mL av SF-DMEM og injisert 2,5 mm lateral (til høyre), 1,5 mm anterior , og 3,5 mm ventralt i forhold til bregma (figur 2).
De resulterende svulster kan visualiseres og analysert av magnetisk resonans imaging (MRI, figur 3), in vivo lysende imaging (IVIS, figur 4), eller rutine brutto patologi teknikker (H & E farging, figur 5). Spesiell forsiktighet må utvises og optimalisering utført for å bestemme appropriate celler og sted for injeksjonene å representere timing, vekst, og tumor modell ønsket.
Figur 1. Skull anatomi. Den anatomiske trekk av musen hodet og skallen er illustrert. Bregma, som er på midtlinje aksen mellom øynene og ørene i skjæringspunktet mellom den koronale og sagittal sting, blir brukt til å reproduserbart finne injeksjon koordinater.
Figur 2. Incisjon og injeksjon kartet. Funksjonene som brukes til å bestemme hud snitt og presist finne injeksjonsstedet er illustrert. En diagonal innsnitt er gjort for å tillate tilgang til både bregma, og injeksjonsstedet. Anvendelse av 30% H 2 O 2til overflaten av skallen hjelper til med å visualisere skull suturer. Plasser en sprøyte med nålen på Micro og manøvrere nålespissen direkte over bregma. Set koordinater på justeringen konsollen til null; alle skallen målinger blir deretter reproduserbart gjort med hensyn til bregma.
Figur 3. Representative intrakranielle xenografttumorer: MR-bilder MRI T2 vektede bilder av en svulst avledet fra (A) 2 x 10 5 U87 celler sammenlignet med en svulst avledet fra (B) 2 x 10 5 U251 celler.. (C) Tumor volum beregnet fra MR-bilder av tre individuelle mus injisert med U251-celler er plottet over tid viser en reproduserbar vindu tumor utvikling og vekst som er konsistent i alle eksperimenter.
Figur 4. Representative xenografttumorer: Ivis bilder. IVIS bilde av U251-Luciferase omformet GBM celler injisert intracranially inn i nakne mus (A). Musen til venstre ble vellykket injisert som beskrevet med U251-Luc celler og viser en veldig sterk focalized signal (fotoner / sek) på ønsket sted. Musen til høyre viser et mislykket resultat av feil injeksjon plassering. H & E undersøkelse av ryggraden viste tumor cellevekst i ryggsøylen som følge av injeksjon for nær midtlinjen med ventrikkel formidling. (B) Tumorstørrelsen er beregnet fra luciferase-aktivitet (fotoner / sekund) i hjernen regionen av interesse, er plottet over tid. Den blå linje tilsvarer musen med en vellykket intrakranial injeksjon, mens den røde linje tilsvarer den mus med tumorcelle-forskyvning til ryggraden.
Figur 5. H & E av intrakranielle xenografttumorer. Hjernene ble samlet inn fra mus legge offer og fiksert med formalin, montert i parafin, seksjonert og farget med H & E. Tumor (A) ble avledet fra U87 GBM-celler, og illustrerer et område av tett tumorvekst (øvre venstre hjørne) og tilstøtende normalt hjernevev med mikroskopisk invasjon av ondartede celler (høyre nedre hjørne). Tumor (B) ble tatt fra en del av midten av en tumor avledet fra U251-celler GBM. Seksjonen svært tett replikerer den bisarre histopatologi med multinucleated ondartede celler sett i typisk menneskelig GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orthotopic musemodeller av human kreft i hjernen kan være et utmerket verktøy for å bedømme effektiviteten av kliniske behandlinger, men omsorg må bli tatt for å optimalisere plasseringen av celler i hjernevev. Studier har vist at overdreven aliquot-volumer, suboptimal injeksjonsteknikk og hastige injeksjonsrater kan føre til leakiness og utseendet av tumorceller på uønskede steder (ventriklene, ryggmarg, extradural regioner, etc.) Og høy variasjon i tumorstørrelse 2 (personlige observasjoner ). En analyse av mikroprosessorstyrt levering av-cellulære prøvene funnet at bruk av en Micro produsert mer focalized levering, mindre prøve tilbakeløp og mindre variasjon enn manuelle metoder for injeksjon, tilskrives det glatt, jevn levering og konsistente presset tre. Mens det kan være utfordrende å kondensere den nødvendige antall celler i et volum på kun 2 eller 4 mL, bruk av et stereotaksisk instrument og innretting konsoll equipped med en programmerbar mikro-pumpe kan gi reproduserbare og pålitelige svulster med lignende vekstrater. En xenograft modell kan aldri virkelig duplisere mikromiljøet, initiering og utvikling av en naturlig forekommende svulst, særlig med immunmangelfulle verter, men en godt designet og implementert orthotopic modellen er det beste alternativet, og er langt bedre enn en ektopisk modell.
Den store fordelen med denne protokollen er etablering av påviselige tumorer i løpet av et konsistent tidsramme. Tidspunktet for tumor utseende er avhengig av celletype og antall celler injisert, men er ganske forutsigbar, og de fleste tumorer er etablert innenfor et smalt tidsvindu i forhold til varigheten av tumorvekst (dvs. tiden inntil endepunktet). Dette gjør det mulig for forskere å identifisere tidspunkter for datainnsamling (slik som MRI eller IVIS) eller inngrep (for eksempel behandling). Tumor vekst variere med celletype, antall celler injisert, og frOM mus til mus (mye som de gjør hos mennesker), men er konsekvent fra eksperiment for å eksperimentere.
Mens denne protokollen benytter en teknikk som kan kreve mer instrumentering og tid enn mindre nøyaktige manuelle metoder for injeksjon og gjelder ikke nødvendigvis til store undersøkelser, teknikker for intrakranielle injeksjoner som gir mulighet for gjennomstrømming av et stort antall dyr (for eksempel som beskrevet av Iwami et al. 12) ved definisjon innebærer hurtig, høytrykksinjeksjon og ofte innebære hånd instrumentering og manuell måling, som er gjenstand for ustøhet og usikkerhet. Disse faktorer kan være forbundet med lekkasje og off-target levering 2,3. Presisjonen, reproduserbarhet, og lav dødelighet av denne prosedyren vil tillate etterforsker for å utforme behandlingsforsøk med færre mus for å oppnå statistisk signifikante resultater - en netto besparelse.
Ett trinn er kritisk forSuksessen til tumorimplantasjonen: den nøyaktige plasseringen av injeksjon. Celler injisert for nær ventriklene kan føre til CSF spredning av sykdom gjennom ventrikkel system eller inn ekstrakraniale regioner. Celler injisert for grunt kan vokse ut gjennom nålen spor. Forhåndsbestemte koordinater er av liten verdi hvis nål plassering er slurvete. Ta deg tid til å plassere musehode sikkert i stereotaxic enhet. Bruk stereotaksiske innstillingsmuligheter og øret barer å passe på utstyret til musen, og sørge for at hodet er stabilt plassert og vil ikke rock eller vri under prosedyren. Endringer eller variasjon hvis injeksjonsstedet kan påvirke kreft egenskaper, inkludert svulst take, vekst, invasiv potensial, og tilgang til levering av legemidler og oksygentilførsel.
Andre parametere som har en betydelig innflytelse på den resulterende svulst inkluderer injeksjonsraten, celle antall og volum; alt må bestemmes empirisk. Minimer volumet for number av celler som kreves for tumorvekst; bruke den tregeste injeksjonsraten praktisk. Celle nummer og passasje nummer har også store effekter på tumor ta og vekstrate. Den spesialiserte utstyret som brukes her tilbyr overlegen kontroll, men begrepene minimalt volum, nøyaktig målretting, minimal og konsistent injeksjonsrate, og langsom tilbaketrekking nålen kan anvendes på en rekke forskjellige teknikker (inkludert manuell injeksjon), og en rekke instrumenter.
Denne fremgangsmåten er åpen for en rekke modifikasjoner: injeksjonsstedet kan være tilpasset for å rekapitulere bestemte typer av tumorer. Heft vev kultur celler, genmodifiserte kloner, neurospheres, disaggregerte mus svulster, eller menneskelige vev fragmenter kan være innpodet i en musehjerne. Denne teknikken kan også bli tilpasset for-cellulære studier, inkludert virale genoverføring 3. Når en fremgangsmåte for pålitelig fremstilling av tumorer i de ønskede karakteristika er etablert, eksperimenter sammenligne effcacy av terapi, medikamentell behandling og kombinasjoner, og andre alternativer som genoverføring kan utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dr. Keating er finansiert av DOD bevilgning CA100335 og er en St. Baldrick stiftelse Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 μl microsyringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s G | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% Ethanol | for cleaning | ||
| Sterile diH2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull | ||
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
