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Immunology and Infection

Neuropathogenic की गैर इनवेसिव मॉडल Published: October 29, 2014 doi: 10.3791/52018
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1School of Pharmacy, University College London, 2Mucin Biology Group, University of Gothenburg

Summary

इधर, एक प्रक्रिया Escherichia कोलाई K1 की संस्कृतियों के साथ नवजात चूहे में प्रणालीगत संक्रमण की स्थापना के लिए वर्णित है. इस गैर-आक्रामक प्रक्रिया रंजित जाल में जठरांत्र संबंधी मार्ग के उपनिवेशन, प्रणालीगत संचलन को रोगाणु का स्थानान्तरण, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के आक्रमण देता है.

Abstract

कार्यरत संक्रमण मॉडल प्राकृतिक संक्रमण का प्रमुख सुविधाओं प्रतिकृति अगर पशु मेजबान और बैक्टीरियल रोगज़नक़ के बीच बातचीत की जांच ही सार्थक है. इस प्रोटोकॉल के कारण नवजात चूहे में neuropathogenic Escherichia कोलाई K1 के लिए प्रणालीगत संक्रमण की स्थापना और मूल्यांकन के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है. जठरांत्र पथ का औपनिवेशीकरण संक्रमण का पेट-लसीका-रक्त-मस्तिष्क पाठ्यक्रम के साथ रोगाणु के प्रसार की ओर जाता है और मॉडल मजबूत उम्र निर्भरता को प्रदर्शित करता है. ई के एक तनाव कोलाई O18: नवजात चूहे के लिए बढ़ाया डाह के साथ K1 के उपनिवेशवाद के असाधारण उच्च दर, रक्त कम्पार्टमेंट और रंजित जाल के माध्यम से पारगमन निम्नलिखित तानिका के आक्रमण के लिए स्थानान्तरण पैदा करता है. मानव मेजबान के रूप में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की पहुंच स्थानीय सूजन और एक सदा ही घातक परिणाम के साथ है. मॉडल तंत्र के अध्ययन के लिए साबित उपयोगिता का हैरोगजनन की, उपचारात्मक उपायों के मूल्यांकन के लिए और बैक्टीरियल डाह के आकलन के लिए.

Introduction

प्रणालीगत जीवाणु संक्रमण अच्छी तरह से किया जा रहा है और नवजात शिशु के अस्तित्व के लिए एक बड़ा खतरा हैं; अपरिपक्व शिशुओं विशेष रूप से कमजोर कर रहे हैं. अक्सर बैक्टीरिया पूति के साथ जुड़े नवजात बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस (NBM), जीवन के पहले कुछ हफ्तों के दौरान मृत्यु दर और रुग्णता का एक महत्वपूर्ण स्रोत बना हुआ है और समस्या सीमावर्ती जीवाणुरोधी दवाओं 1,2 करने के लिए प्रतिरोध के सतत विकास के द्वारा exacerbated है. NBM के एक मामले में एक उच्च, चिकित्सा, सामाजिक और आर्थिक बोझ 3 वहन करती है कि एक आपातकालीन चिकित्सा है; फलस्वरूप, संक्रमण का बोझ कम करने के लिए नई चिकित्सा विज्ञान और, विशेष रूप से, उपन्यास रोगनिरोधी रणनीतियों के लिए एक तत्काल आवश्यकता है. NBM की कुछ विशेषताएं असामान्य हैं: विकसित देशों में, Escherichia कोलाई और ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोक्की लगभग हमेशा एक सुरक्षात्मक पोलीसेकेराइड सीए की उपस्थिति के साथ जुड़ा हुआ है मामलों की बड़ी संख्या और NBM बटोर इन उपभेदों की क्षमता के लिए जिम्मेदार हैंप्रतिरक्षा मान्यता से बचने के लिए रोगाणु सक्षम बनाता है कि psule 4 प्रक्रियाओं. Neuroinvasive ई की - (85% 80) एक बहुत ही उच्च अनुपात कोलाई K1 के कैप्सूल 5,6, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी 7 की modulators के होस्ट करने के लिए संरचनात्मक रूप से समान है कि एक α-2,8-लिंक्ड polysialic एसिड बहुलक व्यक्त करते हैं.

नई चिकित्सा विज्ञान और NBM के लिए prophylactics और जुड़े bacteremia और पूति के मूल्यांकन स्पष्ट रूप से विशेष रूप से मजबूत उम्र-निर्भरता और संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग में, मानव नवजात शिशु में रोग की प्रमुख विशेषताओं mimics कि संक्रमण का एक मजबूत पशु मॉडल से लाभ होगा . ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस के लिए मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला 8,9 उपलब्ध हैं और इन में काफी इन संक्रमणों में रोगजनन, pathophysiology और उपचार के विकल्प के हमारे ज्ञान बढ़ा दिया है. इस प्रकार, चूहों, चूहों, खरगोशों और बंदरों में प्रयोगात्मक संक्रमण दोनों एन में दिमागी बुखार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैeonate और वयस्क. हालांकि, इन मॉडलों के कई उपनिवेशन की साइट से प्रचार-प्रसार की प्राकृतिक प्रक्रियाओं को दरकिनार द्वारा एक कृत्रिम रोगजनन बनाने, संक्रमण की दीक्षा के लिए बैक्टीरिया का प्रत्यक्ष intracisternal या चमड़े के नीचे इंजेक्शन रोजगार. कुछ मामलों में टीका के इन तरीकों विकृति में महत्वपूर्ण परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व; उदाहरण के लिए, ई के चमड़े के नीचे प्रशासन कोलाई K1 के स्ट्रेन नवजात शिशुओं और वयस्कों के 10 दोनों में bacteremia और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के आक्रमण का निर्माण, प्राकृतिक संक्रमण के साथ जुड़े उम्र-निर्भरता निराकृत. ई को गड़बड़ी कोलाई NBM में शिशु को मां से प्रेरणा का एजेंट के ऊर्ध्वाधर संचरण पर निर्भर या जल्द ही जन्म 11 के बाद है. ई माता-व्युत्पन्न कोलाई K1 के बैक्टीरिया जन्म के समय बाँझ है, लेकिन तेजी से एक जटिल microbiota 14 प्राप्त जो नवजात जठरांत्र (सैनिक) पथ 11-13, उपनिवेश. उपनिवेश नवजात शिशुओं में, ई कोलाईK1 के जीवाणु रक्त-मस्तिष्क या रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधाओं 9,15 भर सीएनएस प्रवेश करने से पहले प्रणालीगत संचलन में आंत्र लुमेन से सरकाना की क्षमता है. प्रयोगात्मक संक्रमण की मजबूत मॉडल के डिजाइन को ध्यान में इन विवरणों लेना चाहिए.

चूहों को व्यापक रूप से बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस 8 के कुछ रूपों का अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, वे नवजात संक्रमण की पढ़ाई के लिए अनुपयुक्त हैं: वे प्रणालीगत संक्रमण से अभिभूत हैं और मानव शिशुओं में 16 की मजबूत उम्र निर्भरता लक्षण नहीं दिखा. इसके अलावा, α-defensins, ई से प्रणालीगत आक्रमण के खिलाफ संरक्षण प्रदान सैनिक पथ के प्रमुख पेप्टाइड्स कोलाई K1 के 17, अत्यधिक मनुष्यों और चूहों में Paneth कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल में नहीं बल्कि चूहों 18 में व्यक्त कर रहे हैं. एक अन्य में नहीं मिला दोहराव, अतिरेक और माउस defensin में विविधता और संबंधित cryptidin जीन की एक उल्लेखनीय डिग्री नहीं है19 imals. नवजात चूहे शुरू में Moxon द्वारा इस्तेमाल किया और सहकर्मियों 20 intranasal टीका निम्नलिखित हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा दिमागी बुखार के रोगजनन जांच करने के लिए, मानव में इस नवजात रोगाणु का औपनिवेशीकरण की प्राकृतिक साइट नकल, और बाद में उम्र पर निर्भर ई के लिए अनुकूलित किया गया कोलाई K1 के bacteremia और दिमागी बुखार. Bortolussi एट अल. बैक्टीरियल inoculum के 21 नियोजित intraperitoneal इंजेक्शन संक्रमण शुरू करने के लिए, लेकिन कुंजी Glode का अध्ययन और सैनिक उपनिवेशवाद के बाद संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग समानांतर 22 सेकेंड हैंड मौखिक गैस्ट्रिक खिला सहकर्मियों. गैस्ट्रिक ट्यूब mucosal सतहों नुकसान हो सकता है, प्रक्रिया नवजात शिशुओं से 23 inoculum के खिला शामिल करने के लिए परिष्कृत किया गया. इधर, सैनिक पथ बसाना और वर्णित हैं अतिसंवेदनशील चूहा पिल्ले में संक्रमण पर नज़र रखने के लिए प्रक्रियाओं के लिए विधि; इसके अतिरिक्त, मॉडल की चिकित्सीय और preventative आवेदनों पर विचार विमर्श कर रहे हैं.

Protocol

इस अध्ययन में प्रदर्शन सभी पशु प्रयोगों राष्ट्रीय और यूरोपीय कानून के लिए पुष्टि और फार्मेसी के UCL स्कूल की नैतिक समिति और ब्रिटेन के गृह कार्यालय (ओ) द्वारा अनुमोदित किया गया. हो परियोजना के तहत आयोजित किया गया था सभी जानवर काम पीपीएल 80/2243 और पीपीएल 70/7773 लाइसेंस.

1. चूहा तैयारी

  1. रोगाणु-मुक्त Wistar नवजात चूहों का उपयोग सभी में विवो प्रयोगों से बाहर ले जाने.
  2. 21 डिग्री सेल्सियस, 45 - - 55% आर्द्रता, 15 - 20 हवा परिवर्तन / घंटा और इष्टतम स्थितियों (19 के तहत, - (11 सप्ताह पुराने महिलाओं 9) उनके स्तनपान कराने वाली माताओं के साथ अलग-अलग पिंजरों में सभी चूहे litters (कॉलोनी प्रति 12 नवजात शिशुओं) बरकरार 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र).

2. बैक्टीरिया कोशिका तैयार

  1. स्टोर ई -80 डिग्री सेल्सियस पर 20% (v / v) ग्लिसरॉल में कोलाई K1 के शेयरों. एक प्रयोग के लिए, प्लेटें अगर मुलर-हिंटन (महाराष्ट्र) पर शेयर बैक्टीरिया बाहर थाली, और 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं.
  2. खिला, inocu पहले दिनएक भी ई के साथ महाराष्ट्र शोरबा की देर 10 मिलीलीटर कोलाई K1 कॉलोनी और संस्कृति ओ / 37 डिग्री सेल्सियस, 200 rpm पर एन. मध्यम संदूषण के लिए एक नियंत्रण के रूप में, uninoculated महाराष्ट्र शोरबा के 10 एमएल तैयार करने और 200 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. स्थानांतरण महाराष्ट्र शोरबा के 9.9 मिलीलीटर में हे / एन जीवाणु निलंबन के 100 μl (1: 100 वी / वी), और मध्य घातीय चरण में 0.6 की एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए इसी तक पहुँच जाता है, 37 डिग्री सेल्सियस, 200 rpm पर सेते 600 एनएम (600 आयुध डिपो) की एक तरंग दैर्ध्य में मापा जाता है.

ई के साथ नवजात चूहों के 3. दूध पिलाने कोलाई K1

  1. धीरे मुंह खोलने के लिए अनुमति देता है, गर्दन के कूड़ा से एक हाथ में खड़ी पशु पकड़ो. धीरे-धीरे पशु के मुंह में बाँझ पिपेट टिप डालें, और एक 30 सेकंड समय अवधि में पशु के मुंह में inoculum (~ 37 डिग्री सेल्सियस) के पिपेट 20 μl. तुरंत खिलाने के बाद अपनी मां को पशु लौटें.
  2. 8 एक्स 10 6 बैक्टीरिया टी तंग आ गया है - 4 सत्यापित करें किओ धारावाहिक पीबीएस में inoculum के कमजोर पड़ने और महाराष्ट्र अगर प्लेटों पर खोलना द्वारा प्रत्येक पिल्ला.

ई द्वारा औपनिवेशीकरण 4. आकलन कोलाई K1

  1. धीरे गर्दन के कूड़ा से एक हाथ में पशु पकड़ो. बाँझ पीबीएस में एक बाँझ कपास इत्तला दे दी झाड़ू गीला, और फिर धीरे perianal क्षेत्र झाड़ू. तुरंत swabbing के बाद अपनी मां को पशु लौटें.
  2. बाँझ पीबीएस के 300 μl युक्त ट्यूब में झाड़ू टिप प्लेस और बर्फ पर दुकान.
  3. पीबीएस में सीरियल कमजोर पड़ने से व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या का निर्धारण और MacConkey अगर प्लेट पर चढ़ाना.
  4. व्यवहार्य ई निर्धारण करें जीवाणुभोजी संवेदनशीलता परीक्षण द्वारा कोलाई K1 है. एक बाँझ सूक्ष्मजीवविज्ञानी पाश का उपयोग कर एक व्यक्ति कॉलोनी उठाओ, भंवर मिश्रण करने के लिए तो विषय बाँझ पीबीएस, 200 μl में डूबा हुआ है.
  5. एक सीधी रेखा में महाराष्ट्र अगर पर एक बाँझ सूक्ष्मजीवविज्ञानी पाश, उप-संस्कृति का उपयोग करना. प्लेट 30 सेकंड के लिए सूखी, और फिर बीएसी की 10 μl विंदुक करने की अनुमति देंteriophage K1E लाइन के केन्द्र पर (10 9 पट्टिका इकाइयों / मिलीलीटर (pfu / एमएल) के गठन). 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली ओ / एन सेते हैं.
  6. अगले दिन, जीवाणुभोजी की मध्यस्थता सेल के लिए थाली की जांच.

रोग की गंभीरता के 5. आकलन

  1. 1 टेबल में दिए गए सात सूत्रीय स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए 5 बार दैनिक - 4 प्रत्येक जानवर की बीमारी की गंभीरता का आकलन करें.
  2. एक जानवर स्कोर 7 के बाहर ≥3, तो तुरंत पीड़ा को कम करने के लिए पशु चुनना. मृत के रूप में पशु रिकार्ड.

नवजात चूहों और रक्त संग्रह के 6. Euthanization

  1. धीरे सिर और गर्दन को उजागर, एक हाथ में पशु पकड़ो. एक शराब झाड़ू के साथ पोंछते द्वारा जानवर की गर्दन कीटाणुरहित. ट्रेस इथेनॉल दूर करने के लिए बाँझ पीबीएस में rinsing से पहले, 70% इथेनॉल का उपयोग कैंची की एक बड़ी जोड़ी कीटाणुरहित.
  2. धीरे एक पेट्री डिश के ऊपर सीधे पशु पकड़ो. तेज Surgi का उपयोग नवजात शिशु सिर काटनारक्त पेट्री डिश में भरी सुनिश्चित करना है कि कैलोरी कैंची,. त्वचा वनस्पति के साथ रक्त के संक्रमण को रोकने के लिए सिर के साथ संपर्क से बचें.
  3. इसके तत्काल बाद एक बाँझ पिपेट का उपयोग रक्त इकट्ठा करने और 20 के एक एकाग्रता में हेपरिन सोडियम नमक के साथ मिश्रण - एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 50 इकाइयों / मिलीलीटर.
  4. पीबीएस में सीरियल कमजोर पड़ने से व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या का निर्धारण और MacConkey अगर प्लेट पर चढ़ाना. व्यवहार्य ई की संख्या का निर्धारण जीवाणुभोजी K1E के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया की संवेदनशीलता परीक्षण द्वारा कोलाई K1 है.

7. विच्छेदन

  1. नवजात चूहे के कत्ल के बाद, उत्पाद शुल्क और ब्याज के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए सड़न रोकनेवाला शर्तों का उपयोग करें. 70% इथेनॉल और बाँझ पीबीएस में (चित्र 1 में दिखाया गया है) सभी उपकरणों को धो लें.
  2. विच्छेदन बोर्ड साफ और 70% इथेनॉल के साथ पूरी तरह से पेट गीला. बाईं हिंद पैर को लगाए अपनी पीठ पर लाश स्थिति और (मैं) द्वारा विच्छेदन बोर्ड को ठीक करएक बाँझ सुई के साथ आपरेशन टेबल, (द्वितीय) लाश खींच और आपरेशन टेबल का अधिकार अगली टांग लगाए, (iii) के आपरेशन टेबल को सही हिंद पैर और बाईं अगली टांग लगाए.
  3. संदंश का उपयोग पेट के निचले हिस्से के बाएं हाथ की ओर के साथ त्वचा खींचो, तो छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग उरोस्थि को पेट के निचले हिस्से से शव के बाएं हाथ की ओर के साथ काटा.
  4. उरोस्थि भर छांटना बढ़ाएँ, और फिर अंतर्निहित संरचनाओं में से कोई भी क्षतिग्रस्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करना संदंश और छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग पेट के निचले हिस्से को उरोस्थि से लाश के दाहिने हाथ की ओर, नीचे.
  5. अंत में, धीरे पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए आईरिस घुमावदार विच्छेदन संदंश का उपयोग पेट के निचले हिस्से को उरोस्थि से त्वचा फ्लैप नीचे खींच.
  6. अंतर्निहित अंगों में से कोई भी क्षतिग्रस्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करना, धीरे संदंश के साथ पेरिटोनियम बढ़ाने के लिए और आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए खड़ी काटा.

8. एकत्रितसैनिक पथ

  1. पेट, छोटी आंत, अंधान्त्र, पेट और मेसेंतेरिक लसीका प्रणाली को पहचानें.
  2. धीरे या तो पक्ष में transecting से पेट निकालें, तो बाँझ संदंश का उपयोग बाँझ पीबीएस के 1.6 मिलीलीटर युक्त एक टूम में जगह है.
  3. मलाशय में पेट के आड़ा काट. ध्यान से एक बाँझ पेट्री डिश में विच्छेदन संदंश और जगह का उपयोग कर लाश से पूरे आंतों जन खींच. आंतों संरचना और मेसेंतेरिक लसीका संरचनाओं अलग नहीं है कि तो यह धीरे से किया है कि यह सुनिश्चित करें.

सैनिक पथ और Mesenteric लसीका प्रणाली की 9. पृथक्करण (चित्रा 2)

  1. सैनिक पथ पूरी तरह से जलमग्न है, यह सुनिश्चित करना पेट्री डिश में बाँझ पीबीएस के 30 मिलीलीटर डालो.
  2. मेसेंतेरिक लसीका प्रणाली के केंद्रीय जन पहचानें, और ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग चुटकी. छोटी आंत के सबसे समीपस्थ भाग पहचानें, और ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग चुटकी.
  3. धीरे धीरे CENTRA खींचमेसेंतेरिक लसीका प्रणाली और दो ऊतकों जब तक विपरीत दिशाओं में बाहर का छोटी आंत के एल बड़े पैमाने पर पूरी तरह से एक दूसरे से अलग हो रहे हैं. इस समीपस्थ, मध्य और बाहर क्षेत्रों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संग्रह रोकता है, छोटी आंतों बढ़ाकर नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से इस प्रक्रिया को पूरा करें. 300 में मेसेंतेरिक लसीका प्रणाली जगह - बाँझ पीबीएस 500 μl और बर्फ पर जगह है.

सैनिक पथ के 10 सेक्शनिंग

  1. बृहदान्त्र से छोटी आंत अलग करने के लिए अंधान्त्र में सैनिक पथ आड़ा काट.
  2. 300 में पेट के प्लेस - 500 μl बाँझ पीबीएस और बर्फ पर जगह है.
  3. छोटी आंत की, समीपस्थ मध्यम और बाहर के क्षेत्रों से प्रतिनिधि ऊतकों लीजिए. मध्य बिंदु से छोटी आंत संरेखित करें.
  4. फिर, (मैं) बाहर का छोटी आंत के रूप में काएकुम से पहले ऊतक के पिछले 2 सेमी इकट्ठा, (द्वितीय) 5 से ऊतक इकट्ठा - समीपस्थ छोटी आंत के रूप में मध्य बिंदु से ऊपर 7 सेमी, औरमध्य छोटी आंत के रूप में मध्य बिंदु से नीचे 5 सेमी - (तीन) 3 से ऊतक लेने.

11. जिगर का संग्रह

  1. पेट के हटाने के बाद चूहे जिगर की तीन पालियों पहचानें.
  2. दूर ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग उदर गुहा से पालियों खींचो.
  3. ठीक कैंची का उपयोग कर किसी भी संलग्न स्नायुबंधन काटने से जिगर निकालें. बर्फ पर 500 μl बाँझ पीबीएस और जगह - 300 में जिगर रखें.

12. तिल्ली का संग्रह

  1. तिल्ली को पहचानें.
  2. दूर पेट से तिल्ली खींचो और gastrosplenic बंधन में कटौती करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें.
  3. बर्फ पर 500 μl बाँझ पीबीएस और जगह - 300 में तिल्ली रखें.

13. गुर्दे का संग्रह

  1. जठरांत्र संबंधी मार्ग और अन्य अंगों को हटाने पर उदर गुहा की पीठ पर दिखाई हो जाएगा कि गुर्दे को पहचानें.
  2. कट मूत्रवाहिनी और किसी भी संलग्न स्नायुबंधन यूठीक विच्छेदन कैंची गाना और ठीक संदंश का उपयोग गुर्दे निकाल दें. अधिवृक्क ग्रंथि और ठीक संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग (अभी भी जुड़ी हो तो) किसी भी वसायुक्त सामग्री निकालें.
  3. 300-500 μl बाँझ पीबीएस में दोनों गुर्दे प्लेस और बर्फ पर जगह है.

14. मस्तिष्क का संग्रह

  1. कत्ल के बाद, घुमावदार संदंश का उपयोग एक ईमानदार स्थिति में सिर पकड़. अनुलंबीय घुमावदार संदंश का एक और सेट का उपयोग कर सिर के ऊपर त्वचा चुटकी, और ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग एक चीरा बनाने. गर्दन के पास शेष त्वचा, फिर longitudinally के साथ ठीक विच्छेदन कैंची काटें.
  2. ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग त्वचा फ्लैप खोपड़ी पता चलता है और दूर करने के लिए दोनों पक्षों पर ठीक संदंश का उपयोग कर एक बाहर दिशा में त्वचा खींचो. रीढ़ खोलने में ठीक विच्छेदन कैंची प्लेस और मंच की ओर खोपड़ी के साथ एक चीरा बनाने.
  3. ठीक संदंश का उपयोग कर एक बाहर दिशा में खोपड़ी के दोनों वर्गों खींचो. खोपड़ी खंडों को दूर करने के लिए कट.

15. ऊतक प्रसंस्करण और Homogenization

  1. बाँझ पीबीएस युक्त ट्यूबों में व्यवहार्यता मायने रखता है या डीएनए निष्कर्षण, जगह ऊतकों की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए. इसके तत्काल बाद लघु अवधि के लिए 20% ग्लिसरॉल के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर धारावाहिक पीबीएस में कमजोर पड़ने और MacConkey अगर प्लेट पर चढ़ाना, या दुकान से व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करते हैं. डीएनए निष्कर्षण, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ऊतकों के लिए.
  2. शाही सेना निष्कर्षण, RNAlater समाधान का उचित मात्रा में जगह ऊतकों (1 मिलीग्राम ऊतक प्रति 10 μl) की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए, तो लघु अवधि के लिए या -80 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण में -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत दुकान.
  3. 10 मिलीलीटर Methacarn समाधान में इमेजिंग की आवश्यकता के प्रयोगों, जगह ऊतकों (60% मेथनॉल, 30% क्लोरोफॉर्म और 10% एसिटिक एसिड) के लिए, तो एक दुकानटी आर टी - 3 सप्ताह के लिए (20 से 25 डिग्री सेल्सियस).
  4. पहले और ऊतकों के बाद इसके अलावा ट्यूबों के वजन की तुलना से ऊतक वजन की गणना. एक homogenizer का उपयोग ऊतकों homogenize. प्रत्येक नमूने के homogenization के बीच में बाँझ पीबीएस में एक बार 70% इथेनॉल में और दो बार homogenizer धो लें.
    नोट: Methacarn निर्धारण mucin से संबंधित mucosal रक्षा संरचनाओं की रक्षा करने के क्रम में आंतों के नमूने के निर्धारण के लिए वांछनीय है; formalin निर्धारण प्रणालीगत ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Representative Results

ई यहाँ वर्णित कोलाई K1 के प्रणालीगत संक्रमण मॉडल मनुष्य में प्राकृतिक संक्रमण की विशेषताओं के कई replicates. बैक्टीरिया, सैनिक पथ उपनिवेश मस्तिष्क 24 से जुड़े सूजन के साथ अंग-विशेष बीमारी की स्थापना से पहले mesenteric लिम्फ नोड्स के माध्यम से रक्त डिब्बे में सरकाना, किया जाता है. महत्वपूर्ण बात है, मॉडल मजबूत उम्र निर्भरता को प्रदर्शित करता है; चित्रा 3 में दिखाया गया है, दो दिन पुरानी (p2) चूहा पिल्ले इनवेसिव रोग के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं लेकिन एक सात दिन की अवधि से अधिक पशुओं के संक्रमण को उत्तरोत्तर अधिक दुर्दम्य हो जाते हैं, लेकिन पथ बसाना 17 सैनिक के लिए नहीं. रक्त डिब्बे को सैनिक उपनिवेशन की साइट से पारगमन के बाद, बैक्टीरिया रंजित जाल 25 पर मुख्य रूप से सीएनएस प्रवेश करने से पहले प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के द्वारा रक्त के नमूनों में देखे जा सकते हैं. कुछ पशुओं में, जैसे अन्य प्रमुख अंगों की व्यापक आक्रमण हैफेफड़े, तिल्ली और गुर्दे 25.

ऊतकों में बैक्टीरियल संख्या व्यक्ति पिल्ले 25 लेकिन बीच काफी भिन्न हो सकते हैं bioburden वर्तमान या अंग आक्रमण के संबंध में reproducibility के एक उच्च डिग्री है अनुपस्थित रूप में या तो रन बनाए है. एक टेस्ट मैच पलटन के रूप में 12 पिल्ले का एक कूड़े के साथ, जी * पावर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बिजली की गणना इस नमूने का आकार छह पलटन से जानवरों और अगर सब> 99% संभावना का उपयोग अस्तित्व पर आधारित एक प्रभाव पाने का एक 98.6% संभावना के लिए equates कि निर्धारित बारह को ध्यान में रखा जाता है. मॉडल विशेष रूप से नवजात जीवाणु संक्रमण के इलाज के लिए सिलवाया उपन्यास एजेंट के मूल्यांकन के लिए इसलिए उपयुक्त है और चुनिंदा बैक्टीरियल सतह 24-26 से K1 के कैप्सूल को हटा EndoE depolymerase कैप्सूल की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया गया है. यह भी मेजबान बैक्टीरिया बातचीत पैट पर प्रभाव है कि जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई के hogenesis कोलाई neuropathogens; इस संदर्भ में यह ई की पढ़ाई के लिए नियोजित किया गया है कोलाई A192PP बसाना और प्रसार. ऐसा लगता है कि प्रदर्शन किया गया है ई कोलाई A192PP कोशिकाओं बड़ी संख्या में p2, पी -5 और P9 पिल्ले की सैनिक पथ में जारी रहती है; इन तीन समूहों में उपनिवेशन के लौकिक पहलुओं (चित्रा 5) बहुत समान थे और दोहराने के लिए और पेट के भीतर जनसंख्या घनत्व को बनाए रखने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता को दर्शाता है.

नैदानिक ​​अलग A192 की डाह पशु उपयोग की कम या कोई अतिरेक सुनिश्चित करने के लिए नवजात चूहों में सीरियल बीतने के द्वारा बढ़ाया गया था. ई कोलाई A192, 100% दक्षता के साथ p2 नवजात चूहों उपनिवेश जानवरों के 35% में bacteremia हासिल है और 25% 27 में एक घातक प्रभाव का उत्पादन किया. passaged व्युत्पन्न A192PP, सैनिक पथ colonizes bacteremia पैदा करता है और सभी p2 पिल्ले में मारक का कारण बनता है. इस प्रकार, मॉडल डि की डाह की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता हैfferent K1 के उपनिवेशन की साइट से सीएनएस और अन्य अंग प्रणालियों पर आक्रमण करने के लिए अपनी क्षमता के संबंध में उपभेदों. इस संदर्भ में, Pluschke और सह कार्यकर्ता 23 95 ई की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक नवजात चूहे संक्रमण मॉडल का इस्तेमाल किया कोलाई K1 के पेट उपनिवेशवाद के बाद bacteremia पैदा करने के लिए मानव मूल के तनाव; वे ई का प्रतिरूप प्रकृति underpinning, उपनिवेशवाद और आक्रामक क्षमता दोनों की दक्षता में व्यापक बदलाव मनाया कोलाई K1 के neuropathogens.

चित्रा 1
चित्रा ऊतक संग्रह के लिए 1. सामग्री: (ए) वजन पैमाने, (बी) आवश्यक मीडिया वाले पूर्व तौला ट्यूब, (सी) ऑपरेशन टेबल, शासक और पशु नीचे पिन सुई, (डी) 70% (वी / वी) इथेनॉल और पीबीएस, ऊतक संग्रह उपकरण बाँझ (एफ) बर्फ की ब्लेड की एक बड़ी जोड़ी सहित ऊतक संग्रह किट, (जी) 70% (v / v) इथेनॉल आपरेशन टेबल और चारों ओर से घेरे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. सैनिक पथ का पृथक्करण और मेसेंतेरिक लसीका प्रणाली. (ए) पकड़ ठीक विच्छेदन संदंश के साथ मेसेंतेरिक लसीका प्रणाली के केंद्रीय जन. (बी) पकड़ छोटी आंत के समीपस्थ हिस्सा है, और विपरीत दिशाओं में खींच. (सी) सैनिक पथ और मेसेंतेरिक लसीका प्रणाली पूरी तरह से separat होगाई. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
ई की मौखिक प्रशासन के बाद नौ दिनों (पी 9) को दो दिन (p2) से वृद्ध नवजात चूहे पिल्ले की चित्रा 3. जीवन रक्षा कोलाई A192PP, प्रणालीगत संक्रमण की मजबूत उम्र निर्भरता illustrating. प्रत्येक समूह में 24 नवजात शिशुओं का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 4
ई चित्रा 4. प्रतिदीप्ति छवियों एक p2 पिल्ला से एक रक्त स्मीयर में कोलाई A192PP कोशिकाओं बैक्टीरिया की मौखिक प्रशासन के बाद संक्रमित. बैक्टीरियल सतह पर lipopolysaccharide हे प्रतिजन सेंट थाखरगोश विरोधी O18 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी और Alexa546 संयुग्मित बकरी-विरोधी खरगोश दूसरा एंटीबॉडी के साथ ained. K1 के कैप्सूल EndoE-GFP अभिकर्मक के साथ कल्पना की गई थी. वस्तुतः रक्त के नमूनों में पाया सभी बैक्टीरिया सुरक्षात्मक K1 के कैप्सूल का प्रदर्शन किया. छवियाँ डॉ एंड्रिया ZELMER द्वारा कब्जा कर लिया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. ई बैक्टीरियल inoculum. डीएनए के कोलाई A192PP आंतों बसाना निम्नलिखित प्रशासन पूरी आंत और ई से निकाला गया था polysialyltransferase (neuS) जीन को लक्षित मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा निर्धारित कोलाई K1 कॉलोनी इकाइयों के गठन / G (CFU / छ) ऊतक कहीं और 17 के रूप में वर्णित

फ़ीचर स्वस्थ बीमार
त्वचा का रंग गुलाबी पीला / पीला
चपलता (ठीक पलटा) पिल्ला तुरंत पिछड़े नियुक्ति पर पराजयों पिछड़े प्लेसमेंट (> 3 सेकंड) पीछे में कठिनाई या प्राप्त नहीं कर सकता
पेट पर कोमल दबाव कोई आवाज़ नहीं आंदोलन की आहट
पेट / दूध लाइन दर्शनीय और सफेद दिखाई नहीं
तापमान गरम अपेक्षाकृत ठंडा *
भार दिन प्रति 1.5-2 जी का लाभ कोई वजन या वजन घटाने
पिंजरे में रखा जब व्यवहार मां की ओर कदम और एफ शुरू होता हैeeding मां की ओर बढ़ने और कठिनाई खिलाने से पता चलता है नहीं कर सकते

तालिका 1. सात सूत्रीय स्कोरिंग प्रणाली: सूचीबद्ध पहले तीन स्कोर आम तौर पर मनाया प्रारंभिक संकेत मिल रहे हैं. * प्रणालीगत संक्रमण अनुभव ऊंचा शरीर के तापमान (> 2 डिग्री सेल्सियस) के साथ नवजात शिशुओं. हालांकि, जानवरों की चपलता की कमी के कारण शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए उनकी माँ तक पहुँचने के लिए, अस्वस्थ पशुओं कूड़े से अलग हो और नंगे हाथ को ठंड महसूस हो सकता है.

Discussion

यहाँ वर्णित पशु मॉडल स्वाभाविक रूप से मानव में संक्रमण से होने वाली की मुख्य विशेषताएं पुन: पेश करने के उद्देश्य से है कि पिछले काम पर बनाता है. नवजात चूहों शुरू में एच के कारण शिशु दिमागी बुखार का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया प्रजातियों के संक्रमण का एक मजबूत मॉडल के लिए महत्वपूर्ण मानदंडों को संतुष्ट के रूप में बी इन्फ्लुएंजा टाइप. इस प्रकार, प्रासंगिक रोगाणु की प्रविष्टि के पोर्टल प्राकृतिक मानव संक्रमण की कि प्रतिबिंबित करना चाहिए और reproducibly चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त अवधि के समान विकृति को जन्म दे. तकनीक प्रक्रिया के लागू सीमा नहीं होनी चाहिए इस्तेमाल किया और बीमारी परिणाम 20 में योगदान नहीं होना चाहिए. एच के मॉडल Moxon और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित शिशु चूहों में इन्फ़्लुएन्ज़ा मैनिंजाइटिस इन मानदंडों 20 संतुष्ट; ऊपरी श्वास नलिका और इस महत्वपूर्ण सुविधा के mucosal झिल्ली की बसाना गैर आघात से चूहे पिल्ले में दोहराया गया था के बाद प्राकृतिक संक्रमण होता हैनासिका मार्ग की झिल्ली पर बैक्टीरिया की टिक टपकाना. महत्वपूर्ण बात है, संक्रमण की उम्र पर निर्भर प्रकृति मॉडल में दोहराया गया था.

एक ही समूह में भी ई के एक गैर इनवेसिव मॉडल विकसित करने के लिए पहले किए गए नवजात चूहे 22 में कोलाई K1 के NBM. पैथोजन से मुक्त Sprague-Dawley पिल्ले एक मौखिक गैस्ट्रिक ट्यूब के माध्यम से 10 अगस्त - 10 अक्टूबर बैक्टीरिया खिला द्वारा उपनिवेश थे; inoculum इसलिए हमारे द्वारा नियोजित है कि तुलना में काफी अधिक था. तीन K1 के स्ट्रेन की जांच के साथ औपनिवेशीकरण, C94 (O7: K1: एच), EC3 (O1: K1: एच) और एलएच (O75: K1: H3), एक अपेक्षाकृत उच्च अनुपात (48-74%) की में हुई जानवरों K1-खिलाया, लेकिन bacteremia, दिमागी बुखार और मृत्यु दर की घटनाओं चर और उपनिवेशवाद की दरों की तुलना में काफी कम थे. ई का प्रतिरूप प्रकृति कोलाई K1 के प्रयोगात्मक संक्रमण बाद में 23 स्थापित किया गया था और यह केवल O18 कि अब स्पष्ट है: K1 है और एक हद तक कम करने के लिए, O7: K1 के सीरमप्रकारों में सक्षम हैंलगातार प्रणालीगत संक्रमण के कारण. इस कारण से, neuropathogenic ई के रोगजनन की इन जांच के लिए K1 के तनाव A192PP: कोलाई K1 के डाह बढ़ाया O18 के उपयोग पर आधारित थे. ई की तुलना द्वारा सतहों mucosal की वजह से नुकसान के लिए लगभग निश्चित रूप से, पूर्व विधि का उपयोग होने वाली मौतों की अत्यधिक संख्या Achtman का समूह 23 द्वारा नियोजित रूप Glode और उनके सहयोगियों ने 22, और एक छोटी बूंद खिला विधि द्वारा इस्तेमाल किया प्रगट रूप में एक गैस्ट्रिक ट्यूब के माध्यम से नवजात चूहों के कोलाई K1 के खिला गैस्ट्रिक ट्यूब. उपनिवेशन की दरों इन दो तरीकों के साथ तुलना कर रहे हैं जैसा कि इस संचार में वर्णित के रूप में, यह एक बाँझ टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग बैक्टीरिया खिलाने का कम आक्रामक विधि का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.

हमारे अध्ययन में इस्तेमाल ई कोलाई तनाव A192PP O18 है: K1 है. यह नैदानिक ​​तनाव ई के एक अधिक उग्र व्युत्पन्न है मूल रूप से सेप्टिसीमिया 27 के साथ एक रोगी से बरामद किया गया था कि कोलाई A192 26 के माध्यम से धारावाहिक पारित होने से प्राप्त हुई थी. 2 दिन पुराने जानवरों 28 को दिलाई जब तनाव 100% bacteremia और मृत्यु दर के साथ, एक उम्र पर निर्भर रोग की गंभीरता elicits. इसके विपरीत, 9 दिन पुरानी पशुओं की बीमारी को पूरी तरह से प्रतिरोधी रहे हैं. K1 के विशिष्ट अपघट्य जीवाणुभोजी ई अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अन्य ई से कोलाई K1 कोलाई 29 उपभेदों. इस अध्ययन में, जीवाणुभोजी K1E के लिए व्यवहार्य बैक्टीरिया की संवेदनशीलता ई की शुद्धता की जांच (मैं) के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कोलाई K1 के निलंबन पशुओं को खिलाया जा करने के लिए तैयार है, और (द्वितीय) ई अंतर करने के लिए perianal swabs, रक्त और ऊतकों के नमूनों में व्यवहार्यता की गणना करने के क्रम में अन्य coliforms से कोलाई K1 है. कॉलोनी ई है कोलाई K1 है, यह जीवाणुभोजी K1E सेल करने के लिए अतिसंवेदनशील हो जाएगा, और बैक्टीरियल वृद्धि जीवाणुभोजी टीका के स्थल पर हिचकते किया जाएगा. कॉलोनी ई नहीं है कोलाई K1 है, यह ख होगाKIE जीवाणुभोजी सेल के लिए प्रतिरोधी ई, और जीवाणुभोजी टीका के स्थल पर बैक्टीरिया विकास के एक क्षेत्र होना चाहिए. यह पशु मॉडल स्वाभाविक रूप से होने वाली बीमारी की सभी सुविधाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं कि मन में वहन किया जाना चाहिए. वर्तमान मॉडल ई के अलावा अन्य neuropathogenic बैक्टीरिया की डाह विशेषताओं की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है कोलाई A192PP और बस्तियां inoculum के आकार में बदलाव शामिल किया जा सकता है. तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों बहुत जरूरी दवाओं का मूल्यांकन हालत का इलाज करने के लिए और उपनिवेशवाद और ऊतक आक्रमण करने के लिए मेजबान प्रतिक्रिया का ब्यौरा उजागर करने के लिए शामिल हो सकते हैं.

यहाँ वर्णित विधि सरल लेकिन प्रभावी है. 10 की एकल litters - 12 पिल्ले परीक्षण या नियंत्रण समूहों के रूप में कार्यरत थे और इस के भीतर-कूड़े दृष्टिकोण reproducibility और सांख्यिकीय वैधता के एक उच्च स्तर सुनिश्चित करता है. यह पिल्ले किसी procedur के बाद जितनी जल्दी हो सके अपने प्राकृतिक माताओं को लौट रहे हैं कि जरूरी हैई और litters इसलिए विभिन्न उपायों के दौर से गुजर जानवरों शामिल नहीं किया जाना चाहिए. यह फेड inoculum अन्यथा पिल्ले की पेशकश की संस्कृति को अस्वीकार कर देंगे गरम हो कि महत्वपूर्ण है. पिल्ले तेजी से एक जटिल microbiota विकसित और जन्म के दो दिन के भीतर सैनिक पथ शिशु और वयस्क पेट में सबसे प्रचुर मात्रा में रोगाणुओं के रूप में स्थापित संघ से बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ उपनिवेश है. ई खिलाया नहीं किया गया है कि पिल्ले कोलाई A192PP ई ले नहीं उपनिवेशन की दरों की कोलाई K1 के सैनिक पथ में 17 और इतने दृढ़ संकल्प अपेक्षाकृत सरल है. हालांकि, neuS ई बस्तियां का पता लगाने के लिए qPCR विधि आधारित कोलाई K1 के पारंपरिक संस्कृति तरीकों कि कहीं अधिक संवेदनशील है और दृढ़ता से 17 की सिफारिश की है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम के चिकित्सा अनुसंधान परिषद से अनुदान अनुसंधान G0400268 और एमआर / K018396 / 1 के द्वारा समर्थित है, और लड़ाई मेडिकल रिसर्च द्वारा किया गया था. इसके अलावा समर्थन स्वास्थ्य अनुसंधान यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन के अस्पताल बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर के लिए राष्ट्रीय संस्थान द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) Harlan, UK
E. coli K1 A192PP Taylor lab Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E Taylor lab Mushtaq et al. 2004
Glycerol Sigma, UK G5516
Mueller-Hinton Agar Oxoid, UK CM0037
Mueller-Hinton Broth Oxoid, UK CM0405
MacConkey Agar Oxoid, UK CM0007
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma, UK P4417
Ethanol 100% Sigma, UK E7023
Heparin Sodium Salt Sigma, UK 84020 Prepare 20 - 50 units/ml
RNAlater Solution Sigma, UK R0901 10 μl/mg tissue
Acetic Acid Sigma, UK 320099
Chloroform Sigma, UK C2432
Methanol Sigma, UK 322415
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, UK 11542483
Alcotip Swabs Scientific Laboratory Supplies, UK SWA1000
Petri dishes Sigma, UK P5856
30 ml Universal Tube AlphaLaboratories, UK CW3890
0.5 ml microcentrifuge tubes StarLab, UK I1405-1500
1.5 ml microcentrifuge tubes StarLab, UK I1415-1000
0.1 μl calibrated loops StarLab, UK E1412-0112
L-shaped spreaders StarLab, UK E1412-1005
Cuvettes Fisher Scientific, UK 10594175
Forceps straight with fine points Fisher Scientific, UK 12780036
Forceps straight with blunt tips Fisher Scientific, UK 12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points Fisher Scientific, UK 12740926
Scissors straight with very fine points Fisher Scientific, UK 12972055
Laboratory Scissors VWR, UK USBE4251
25 G Syringe Needles Greiner Bio-One Ltd N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers PerkinElmer, UK L60000BB
Unitemp Incubator B&T, UK OP958
Multitron shaking incubator INFORS HT, UK AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer IKA Werke 0003737000

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References

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संक्रमण अंक 92 बैक्टीरियल संक्रमण नवजात बैक्टीरियल मैनिंजाइटिस bacteremia पूति पशु मॉडल K1 के पोलीसेकेराइड प्रणालीगत संक्रमण जठरांत्र संबंधी मार्ग उम्र निर्भरता
Neuropathogenic की गैर इनवेसिव मॉडल<em&gt; Escherichia कोलाई</em&gt; नवजात चूहे में संक्रमण
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Dalgakiran, F., Witcomb, L. A.,… More

Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M. H., Taylor, P. W. Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat. J. Vis. Exp. (92), e52018, doi:10.3791/52018 (2014).

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