Non invasiva Modello di neuropatogeno Published: October 29, 2014 doi: 10.3791/52018

DOI

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Fatma Dalgakiran¹, Luci A. Witcomb¹, Alex J. McCarthy¹, George M. H. Birchenough², Peter W. Taylor¹

¹School of Pharmacy, University College London, ²Mucin Biology Group, University of Gothenburg

Summary

Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Abstract

Studio delle interazioni tra ospite e batterio patogeno animale ha senso solo se il modello di infezione utilizzato replica le caratteristiche principali di infezione naturale. Questo protocollo descrive le procedure per la creazione e la valutazione di infezioni sistemiche a causa di neuropatogeno K1 Escherichia coli nel ratto neonato. La colonizzazione del tratto gastrointestinale porta alla diffusione del patogeno lungo il corso budello linfatico-ematoencefalica dell'infezione e il modello mostra forte dipendenza dell'età. Un ceppo di E. coli O18: K1 con una maggiore virulenza del ratto neonato produce eccezionalmente elevati tassi di colonizzazione, traslocazione al vano di sangue e l'invasione delle meningi seguendo il transito attraverso il plesso coroideo. Come nell'ospite umano, la penetrazione del sistema nervoso centrale è accompagnata da infiammazione locale e un risultato invariabilmente letale. Il modello è di provata utilità per gli studi del meccanismodi patogenesi, per la valutazione degli interventi terapeutici e per valutare la virulenza batterica.

Introduction

Infezioni batteriche sistemiche sono una grave minaccia per il benessere e la sopravvivenza del neonato; bambini prematuri sono particolarmente vulnerabili. Meningite batterica neonatale (NBM), spesso associata a sepsi batterica, continua ad essere una fonte significativa di mortalità e morbilità nel corso delle prime settimane di vita e il problema è aggravato dalla continua evoluzione della resistenza ai farmaci antibatterici in prima linea ^1,2. Un caso di NBM è un'emergenza medica che porta un medico, sociale ed economico di alta pressione ^3; di conseguenza, vi è un urgente bisogno di nuove terapie e, in particolare, nuove strategie di profilassi per ridurre l'onere di infezione. Alcune caratteristiche di NBM sono inusuali: nel mondo industrializzato, Escherichia coli e streptococchi di gruppo B sono responsabili della maggior parte dei casi e la capacità di questi ceppi di suscitare NBM è quasi sempre associata alla presenza di un polisaccaride protettiva capsule che permette al patogeno di eludere il riconoscimento immunitario elabora ^4. Una percentuale molto elevata (80 - 85%) di neuroinvasive E. coli esprimere la capsula K1 ^5,6, un polimero di acido α-2,8 polysialic-collegato che è strutturalmente identico a ospitare modulatori di plasticità neuronale ^7.

La valutazione di nuove terapie e profilassi per NBM e batteriemia e sepsi associati trarrebbe beneficio chiaramente da un modello animale robusto di infezione che imita le caratteristiche principali della malattia nel neonato umano, in particolare il forte all'età di dipendenza e il percorso naturale di infezione . Una vasta gamma di modelli per la meningite batterica Gram-positivi e Gram-negativi sono disponibili ^8,9 e questi hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza della patogenesi, fisiopatologia e trattamento opzioni in queste infezioni. Così, infezioni sperimentali su ratti, topi, conigli e scimmie sono stati utilizzati per studiare la meningite sia nel neonate e l'adulto. Tuttavia, molti di questi modelli impiegano iniezione diretta intracisternale o sottocutanea di batteri per apertura di infezione, creando una patogenesi artificiale bypassando processi naturali di diffusione dal sito di colonizzazione. In alcuni casi questi metodi di inoculazione portato a cambiamenti significativi nella patologia; per esempio, la somministrazione sottocutanea di E. ceppi coli K1 abrogati l'età dipendenza associata con l'infezione naturale, la produzione di batteriemia e l'invasione del sistema nervoso centrale (SNC) in entrambi i neonati e gli adulti ^10. Predisposizione per E. coli NBM è criticamente dipendente dalla trasmissione verticale l'agente responsabile dell'infezione dalla madre al neonato al momento o subito dopo la nascita ^11. Materna di derivazione E. batteri coli K1 colonizzano il tratto gastrointestinale neonatale (GI) ^11-13, che è sterile alla nascita, ma rapidamente acquista un microbiota complesso ^14. Nei neonati colonizzati, E. coliK1 batteri hanno la capacità di traslocare dal lume intestinale nella circolazione sistemica prima di entrare nel SNC di tutti i ematoencefalica sangue o fluido cerebrospinale barriere ^9,15. La progettazione di modelli robusti di infezione sperimentale dovrebbe prendere queste informazioni in considerazione.

Anche se i topi sono stati ampiamente utilizzati per lo studio di alcune forme di meningite batterica ^8, essi non sono adatti per gli studi di infezione neonatale: sono sopraffatti da infezione sistemica e non mostrano la forte caratteristica di dipendenza dei neonati umani ^16. Inoltre, α-defensine, peptidi chiave del tratto gastrointestinale che fornisce una protezione contro l'invasione sistemica da E. coli K1 ^17, sono altamente espresso nelle cellule Paneth e neutrofili negli esseri umani e ratti, ma non nei topi ^18. Vi è un notevole grado di duplicazioni, la ridondanza e l'eterogeneità nel topo defensine e relativi geni cryptidin non si trovano in altri unimals ^19. Il ratto neonatale è stato inizialmente utilizzato da Moxon e collaboratori ²⁰ per studiare la patogenesi della meningite da Haemophilus influenzae dopo l'inoculazione intranasale, replicando il sito naturale di colonizzazione di questo patogeno neonatale nell'essere umano, e successivamente adattato per età-dipendente E. coli K1 batteriemia e la meningite. Bortolussi et al. ²¹ iniezione intraperitoneale occupati della inoculo batterico per avviare l'infezione, ma lo studio chiave di Glode e collaboratori ²² alimentazione gastrica orale per il parallelo la via naturale d'infezione dopo la colonizzazione GI. Poiché il tubo gastrico può danneggiare le superfici mucose, la procedura è stata affinata per includere l'alimentazione dell'inoculo ai neonati ^23. Qui, il metodo per la colonizzazione e le procedure per il monitoraggio dell'infezione nei ratti neonati sono sensibili descritte tratto gastrointestinale; Inoltre, sono discusse applicazioni terapeutiche e preventive del modello.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati in questo studio erano conformi alla legislazione nazionale ed europea e sono stati approvati dal Comitato Etico della Scuola UCL di Farmacia e il Regno Unito Home Office (HO). Tutti i lavori animale è stata condotta nell'ambito del progetto HO licenze PPL 80/2243 e PPL 70/7773.

1. Rat Preparazione

1. Eseguire tutti gli esperimenti in vivo utilizzando Wistar ratti neonati esenti da organismi patogeni.
2. Conservare tutte le cucciolate di ratto (12 neonati per colonia) in gabbie individuali con le loro madri allattano il bambino (9 - 11 settimane di età femmine), in condizioni ottimali (19 - 21 ° C, 45 - 55% di umidità, 15 - 20 ricambi d'aria / ora e 12 h ciclo luce / buio).

2. cellule batteriche Preparazione

1. Negozio E. scorte coli K1 a 20% (v / v) di glicerolo a -80 ° C. Per ogni esperimento, piastra i batteri azionari su Mueller-Hinton (MH) agar piastre e incubare a 37 ° CO / N.
2. Il giorno prima di alimentazione, inocutardo 10 ml di brodo di MH con un singolo E. coli K1 colonia e la cultura O / N a 37 ° C, 200 rpm. Come controllo per mezzo di contaminazione, preparare 10 ml di brodo inoculato MH e incubare a 37 ° C a 200 rpm.
3. Trasferire 100 ml di O / N sospensione batterica in 9,9 ml di brodo MH (1: 100 v / v), e incubare a 37 ° C, 200 rpm, fino al raggiungimento metà esponenziale fase, corrispondente ad una densità ottica di 0,6 misurata ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD _600).

3. L'alimentazione di ratti neonati con E. coli K1

1. Tenere delicatamente l'animale verticalmente in una mano dalla collottola, permettendo alla bocca di aprirsi. Lentamente inserire la punta della pipetta sterile nella bocca dell'animale, e pipettare 20 ml di inoculo (~ 37 ° C) nella bocca dell'animale per un periodo di tempo di 30 sec. Rispedire l'animale verso la sua madre subito dopo la poppata.
2. Verificare che il 4 - 8 x 10 ⁶ batteri sono stati alimentati to ogni cucciolo per diluizione seriale del inoculo in PBS e spotting su piastre di agar MH.

4. Valutazione della colonizzazione da E. coli K1

1. Premere delicatamente l'animale in una mano dalla collottola. Inumidire un panno di cotone sterile in PBS sterile, e poi tamponare delicatamente la zona perianale. Rispedire l'animale verso la sua madre subito dopo tampone.
2. Posizionare la punta del tampone in una provetta contenente 300 ml di PBS sterile e memorizzare sul ghiaccio.
3. Determinare il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey.
4. Determinare valida E. coli K1 per test di sensibilità batteriofago. Scegli una colonia individuo che usa un ciclo microbiologico sterili, immerso in 200 ml PBS sterile, poi oggetto di vortex.
5. Utilizzando un sterili ciclo microbiologico, subcultura su MH agar in linea retta. Lasciare che il piatto ad asciugare per 30 secondi, e poi Pipettare 10 ml di bacteriophage K1E (10 ⁹ unità formanti placca / ml (PFU / ml)) sul centro della linea. Incubare la piastra di O / N a 37 ° C.
6. Il giorno dopo, esaminare la piastra per lisi batteriofago-mediata.

5. Valutazione della gravità della malattia

1. Valutare la gravità della malattia di ciascun animale 4 - 5 volte al giorno utilizzando il sistema di punteggio sette punti illustrato nella Tabella 1.
2. Se un animale punteggio ≥3 su 7, abbattere immediatamente l'animale per ridurre al minimo le sofferenze. Registrare l'animale morto.

6. euthanization di ratti neonati e prelievo di sangue

1. Premere delicatamente l'animale in una mano, esponendo la testa e il collo. Disinfettare il collo dell'animale strofinando con un tampone imbevuto di alcool. Disinfettare un grosso paio di forbici con etanolo al 70%, prima del risciacquo in PBS sterile per rimuovere tracce di etanolo.
2. Premere delicatamente l'animale direttamente sopra una piastra di Petri. Decapitare il neonato utilizzando Surgi forteforbici CAL, assicurando che il sangue gocciola nella piastra di Petri. Evitare il contatto con la testa per evitare la contaminazione del sangue con flora cutanea.
3. Subito raccogliere il sangue con una pipetta sterile e mescolare con eparina sale di sodio ad una concentrazione di 20 - 50 unità / ml in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga.
4. Determinare il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey. Determinare il numero di vitali E. coli K1 testando la sensibilità dei batteri vitali per K1E batteriofago.

7. Dissection

1. Dopo la decapitazione del ratto neonato, utilizzare condizioni asettiche di asportare e raccogliere i tessuti di interesse. Lavare tutti gli strumenti (mostrati nella Figura 1) in etanolo al 70% e PBS sterile.
2. Pulire la tavola di dissezione e bagnare completamente l'addome con il 70% di etanolo. Posizionare il cadavere sulla schiena e fissare alla scheda dissezione (i) appuntare la zampa posteriore sinistratavolo operatorio con un ago sterile, (ii) allungamento cadavere e pinning zampa anteriore destra al tavolo operatorio, (iii) appunta la zampa posteriore destra e zampa anteriore sinistra al tavolo operatorio.
3. Tirare la pelle lungo il lato sinistro del basso addome con una pinza, poi tagliare lungo il lato sinistro del corpo dal basso addome allo sterno con piccole forbici dissezione.
4. Estendere l'escissione attraverso lo sterno, e poi lungo il lato destro del corpo dallo sterno al basso addome con pinze e piccole forbici dissezione, garantendo che nessuna delle strutture sottostanti sono danneggiati.
5. Infine, tirare delicatamente verso il basso il lembo cutaneo dallo sterno al basso addome con iris pinze dissezione curve per esporre il peritoneo.
6. Sollevare delicatamente il peritoneo con una pinza e tagliare verticalmente per esporre gli organi interni, in modo che nessuno degli organi sottostanti sono danneggiati.

8. Raccoltail tratto GI

1. Identificare lo stomaco, intestino tenue, intestino cieco, colon e del sistema linfatico mesenterico.
2. Rimuovere lo stomaco da sezionare con delicatezza su entrambi i lati, quindi inserire in un bijou contenente 1,6 ml di PBS sterile con pinza sterile.
3. Transetto il colon al retto. Estrarre con cautela l'intera massa intestinale dal cadavere con pinze dissezione e posto in una piastra di Petri sterile. Assicurarsi che questo è fatto delicatamente in modo che la struttura intestinale e strutture linfatici mesenterici non si separano.

9. La separazione del tratto GI e il sistema linfatico mesenterica (Figura 2)

1. Versare 30 ml di PBS sterile nella capsula di Petri, garantendo il tratto gastrointestinale è completamente sommerso.
2. Identificare la massa centrale del sistema linfatico mesenterico, e pizzicare con pinza sottile dissezione. Identificare la parte più prossimale del piccolo intestino, e pizzicare con pinza sottile dissezione.
3. Tirare lentamente la central massa del sistema linfatico mesenterico e piccolo intestino distale in direzioni opposte fino a due tessuti sono completamente separati gli uni dagli altri. Eseguire questa procedura con attenzione per garantire che l'intestino tenue non sono allungate, come questo impedisce raccolta riproducibile prossimale, medio e regioni distali. Posizionare il sistema linfatico mesenterico in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio.

10. Sezione del tratto GI

1. Transect tratto gastrointestinale al cieco per separare tenue dal colon.
2. Posizionare i due punti in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio.
3. Raccogliere tessuti rappresentativi regioni prossimali, medie e distali dell'intestino tenue. Allineare l'intestino tenue dal punto centrale.
4. Poi, (i) raccogliere gli ultimi 2 cm di tessuto prima cieco come il piccolo intestino distale, (ii) raccogliere il tessuto 5-7 cm sopra il punto medio come il piccolo intestino prossimale, e(Iii) raccoglie il tessuto dal 3 - 5 cm al di sotto del punto medio come il piccolo intestino medio.

11. Raccolta del Fegato

1. Identificare le tre lobi del fegato di ratto dopo la rimozione dello stomaco.
2. Tirare lobi di distanza dalla cavità addominale con pinza sottile dissezione.
3. Rimuovere il fegato tagliando eventuali legamenti connessi con le forbici sottili. Mettere il fegato in 300-500 ml PBS sterile e posto sul ghiaccio.

12. Raccogliere la Milza

1. Identificare la milza.
2. Tirare milza via dallo stomaco e usare le forbici sottili per tagliare il legamento gastrosplenico.
3. Mettere milza in 300-500 ml PBS sterile e posto sul ghiaccio.

13. Raccogliere i Reni

1. Identificare i reni che diventeranno visibili nella parte posteriore della cavità addominale alla rimozione del tratto gastrointestinale e di altri organi.
2. Ureteri Cut ed eventuali legamenti connessi ucantare belle forbici dissezione e rimuovere reni con una pinza sottile. Rimuovere ghiandole surrenali e qualsiasi materiale grasso (se ancora attaccato) utilizzando una pinza sottile e forbici dissezione.
3. Posizionare entrambi i reni in 300-500 ml PBS sterile e disporli sul ghiaccio.

14. Raccogliere il cervello

1. Dopo la decapitazione, tenere la testa in posizione verticale con pinze curve. Pizzicare la pelle sulla parte superiore della testa in senso longitudinale con un altro set di pinze curve, e fare un'incisione con fini forbici dissezione. Tagliare restante pelle in prossimità del collo, ancora una volta in senso longitudinale con fini forbici dissezione.
2. Tirare la pelle in una direzione verso l'esterno con una pinza sottile su entrambi i lati per rivelare il cranio e rimuovere lembi cutanei utilizzando sottili forbici dissezione. Bel posto forbici dissezione in apertura della colonna vertebrale e fare un'incisione lungo il cranio verso la tribuna.
3. Tirare entrambe le sezioni del cranio in una direzione verso l'esterno con una pinza sottile. Tagliare per rimuovere i segmenti del cranio.

15. Lavorazione tessuti e omogeneizzazione

1. Per gli esperimenti che richiedono i conteggi di fattibilità o l'estrazione del DNA, tessuti posto in provette contenenti PBS sterile. Determinare immediatamente il numero di batteri vitali da diluizioni seriali in PBS e placcatura su piastre di agar MacConkey, o conservare a -20 ° C con il 20% di glicerolo per il breve termine. Per l'estrazione del DNA, negozio di tessuti a -20 ° C.
2. Per gli esperimenti che richiedono l'estrazione di RNA, posto in tessuti adeguati volumi di soluzione RNAlater (10 ml per 1 mg di tessuto), quindi memorizzare immediatamente a -20 ° C per breve termine o a -80 ° C conservazione a lungo termine.
3. Per gli esperimenti che richiedono l'imaging, luogo tessuti in 10 ml di soluzione Methacarn (60% metanolo, 30% di cloroformio e il 10% di acido acetico), quindi memorizzare unt RT (20 - 25 ° C) per 3 settimane.
4. Calcolare il peso del tessuto confrontando peso di tubi prima e dopo l'aggiunta dei tessuti. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore. Lavare l'omogeneizzatore una volta in etanolo al 70% e due volte in PBS sterile tra omogeneizzazione di ogni campione.
   NOTA: la fissazione Methacarn è auspicabile per il fissaggio dei campioni intestinali, al fine di preservare le strutture di difesa della mucosa mucina correlata; fissazione in formalina può essere utilizzato per tessuti sistemici.

Representative Results

Il E. coli K1 modello di infezione sistemica qui descritto replica molte delle caratteristiche della infezione naturale nell'uomo. I batteri sono ingeriti, colonizzare il tratto gastrointestinale, traslocare nel compartimento sanguigno attraverso i linfonodi mesenterici prima di stabilire la malattia organo-specifica, con infiammazione associata del cervello ^24. È importante sottolineare che il modello mostra una forte dipendenza degli anziani; come mostrato in Figura 3, due giorni di età (P2) ratti sono altamente suscettibili alla malattia invasiva ma per un periodo di sette giorni gli animali diventano progressivamente più refrattari alle infezioni, ma non Gi colonizzazione del tratto ^17. Dopo transito dal sito di colonizzazione GI al comparto sangue, i batteri possono essere visualizzati in campioni di sangue mediante microscopia a fluorescenza (Figura 4) prima di entrare nel SNC prevalentemente nel plesso coroide ^25. In alcuni animali, vi è ampia invasione di altri organi importanti comepolmone, milza e reni ^25.

Numeri batterica in tessuti possono variare notevolmente tra i singoli cuccioli ^25, ma quando la carica batterica è segnato come presente o assente vi è un alto grado di riproducibilità in materia di invasione di organi. Con una cucciolata di 12 cuccioli come una singola coorte di prova, calcoli di potenza utilizzando G * software Alimentazione determinato che questa dimensione del campione equivale a una probabilità del 98,6% di trovare un effetto basato sulla sopravvivenza con sei animali della coorte e> probabilità del 99% se tutti dodici sono presi in considerazione. Il modello è quindi adatto alla valutazione di nuovi agenti appositamente per il trattamento di infezioni batteriche neonatali ed è stato utilizzato nella procedura per valutare il potenziale terapeutico della capsula depolymerase EndoE che rimuove selettivamente la capsula K1 dalla superficie batterica ^24-26. Può anche essere usato per studiare interazioni ospite-batteri che impatto sul pathogenesis di E. coli neuropathogens; in questo contesto è stato impiegato per studi di E. colonizzazione coli A192PP e la diffusione. È stato dimostrato che E. cellule coli A192PP persistono nel tratto gastrointestinale di P2, P5 e P9 cuccioli in gran numero; aspetti temporali della colonizzazione in questi tre gruppi erano molto simili (Figura 5) e riflette la capacità dei batteri di replicare e mantenere la densità di popolazione all'interno dell'intestino.

La virulenza del A192 isolato clinico è stata potenziata mediante passaggio seriale in ratti neonati per garantire poca o nessuna ridondanza di uso animale. E. coli A192 colonizzato P2 ratti neonati con il 100% di efficienza, ha suscitato batteriemia nel 35% degli animali e ha prodotto un effetto letale nel 25% ^27. Il A192PP derivata diversi passaggi colonizza il tratto gastro-intestinale, produce batteriemia e causa letalità in tutti i cuccioli P2. Pertanto, il modello può essere impiegato per studiare la virulenza different K1 ceppi rispetto alla loro capacità di invadere il SNC e altri organi dal sito di colonizzazione. In questo contesto, Pluschke e collaboratori ²³ hanno utilizzato un modello di infezione ratto neonato per determinare la capacità di 95 E. coli K1 ceppi di origine umana per provocare batteriemia dopo la colonizzazione dell'intestino; hanno osservato notevoli differenze in termini di efficienza sia di colonizzazione e la capacità invasiva, alla base della natura clonale di E. coli K1 neuropathogens.

Figura 1. Materiali per la raccolta dei tessuti: (A) bilancia, (b) i tubi pre-pesato contenenti supporti necessari, (C) Funzionamento tavolo, righello e aghi da definire l'animale, (D) il 70% (v / v) etanolo e PBS per sterilizzare le attrezzature di raccolta dei tessuti, (F) ghiaccio per preservare i tessuti, (G) 70% (v / v) di etanolo per la sterilizzazione il tavolo operatorio e circonda. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Separazione del tratto gastrointestinale e il sistema linfatico mesenterico. (A) Afferrare la massa centrale del sistema linfatico mesenterico con pinza sottile dissezione. (B) Afferrare la parte prossimale del piccolo intestino, e tirare in direzioni opposte. (C) Il tratto gastrointestinale e del sistema linfatico mesenterico sarà completamente separate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. La sopravvivenza dei cuccioli di ratto neonatale di età compresa tra due giorni (P2) a nove giorni (P9) a seguito della somministrazione orale di E. coli A192PP, che illustra la forte dipendenza degli anziani di infezione sistemica. Ogni gruppo rappresenta 24 neonati.

Figura 4. immagini di fluorescenza di E. cellule coli A192PP in uno striscio di sangue da un cucciolo P2 infetta dopo somministrazione orale di batteri. L'antigene lipopolisaccaride O sulla superficie batterica era stained con coniglio anti-O18 anticorpo policlonale e secondo anticorpo Alexa546 coniugato capra anti-coniglio. La capsula K1 è stato visualizzato con il reagente EndoE-GFP. Praticamente tutti i batteri rilevati nei campioni di sangue visualizzata la K1 capsula protettiva. Le immagini sono state catturate dal dottor Andrea Zelmer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. E. coli A192PP colonizzazione intestinale dopo somministrazione dell'inoculo batterico. Il DNA è stato estratto da tutta dell'intestino ed E. coli K1 unità formanti colonia / g (CFU / g) dei tessuti determinato per reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) mira il gene polysialyltransferasi (Neus) come descritto altrove ¹⁷

Caratteristica	Sano	Malsano
Colore della pelle	Rosa	Pallido / giallo
Agility (riflesso di raddrizzamento)	Pup inverte immediatamente sul collocamento indietro	Difficoltà a invertire il posizionamento all'indietro (> 3 sec) o non possono raggiungere
Leggera pressione sull'addome	Nessun suono	Suono di agitazione
Stomaco / Linea latte	Visibile e nero	Non visibile
Temperatura	Caldo	Relativamente freddo *
Peso	Guadagno di 1,5-2 g al giorno	Nessun aumento di peso o perdita di peso
Comportamento quando messo in gabbia	Si muove verso la madre e inizia flimentazione	Non può muoversi verso la madre e mostra la difficoltà di alimentazione

Tabella 1. sette punti sistema di punteggio: I primi tre punteggi riportati sono di solito i primi segnali osservati. * I neonati con infezione sistemica esperienza temperatura corporea elevata (> 2 ° C). Tuttavia, a causa della mancanza di agilità degli animali per raggiungere la loro madre per mantenere la temperatura corporea, animali insalubri possono separarsi da lettiera e sentire freddo alla mano nuda.

Discussion

Il modello animale qui descritto si basa sul precedente lavoro che mira a riprodurre le caratteristiche salienti di naturali infezioni negli esseri umani. Ratti neonati sono stati inizialmente utilizzati per studiare la meningite infantile a causa di H. influenzae di tipo b come la specie soddisfaceva i criteri chiave per un modello affidabile di infezione. Così, il portale d'ingresso del patogeno in questione dovrebbe riflettere sul fatto che l'infezione umana naturale e riproducibile dar luogo a simile patologia di durata sufficiente per consentire un intervento terapeutico. Le tecniche utilizzate non devono limitare l'applicabilità della procedura e non dovrebbero contribuire al decorso della malattia ^20. Il modello di H. influenzae di meningite in ratti neonati sviluppati da Moxon e colleghi risponde a questi criteri ^20; l'infezione naturale si verifica dopo la colonizzazione delle membrane mucose del tratto respiratorio superiore e questa caratteristica importante è stato replicato nei ratti da non-traumainstillazione tic dei batteri sulle membrane dei passaggi nasali. È importante sottolineare che la natura età-dipendente del l'infezione è stata replicata nel modello.

Lo stesso gruppo sono stati anche i primi a sviluppare un modello di non-invasiva di E. coli K1 NBM nel ratto neonato ^22. Esenti da organismi patogeni Sprague-Dawley cuccioli sono stati colonizzati da alimentazione ^{8 Ottobre - 10} Ottobre batteri attraverso un sondino gastrico per via orale; l'inoculo era quindi notevolmente superiore a quello impiegato da noi. La colonizzazione con i tre ceppi K1 esaminati, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) e LH (O75: K1: H3), si è verificato in una percentuale relativamente elevata (48-74%) di animali K1-alimentato, ma l'incidenza di batteriemia, meningite e la mortalità era variabile e significativamente più bassi rispetto ai tassi di colonizzazione. La natura clonale di E. infezione sperimentale coli K1 è stata stabilita entro ²³ ed è ora evidente che solo O18: K1 e, in misura minore, O7: sierotipi K1 sono in gradodi provocare costantemente infezione sistemica. Per questo motivo, queste indagini di patogenesi di neuropatogeno E. coli K1 si basavano sull'uso della O18 virulenza avanzata: K1 ceppo A192PP. Un confronto di E. coli K1 alimentazione di ratti neonati attraverso un tubo gastrico, come usato da Glode e colleghi ^22, e un metodo di alimentazione goccia come impiegata dal gruppo di Achtman ²³ ha rivelato un numero eccessivo di morti con il primo metodo, quasi certamente a causa di danni alle superfici mucose da parte del tubo gastrico. Poiché i tassi di colonizzazione sono paragonabili con questi due metodi, si consiglia di utilizzare il metodo meno invasivo di alimentare i batteri con una pipetta con una punta sterile, come descritto nella presente comunicazione.

E. coli A192PP ceppo usato nei nostri studi è O18: K1. Si tratta di un derivato più virulento del ceppo clinico E. coli A192 che è stato originariamente recuperato da un paziente con la setticemia ²⁷ 26. Il ceppo suscita una gravità della malattia età-dipendente, con il 100% batteriemia e la mortalità quando somministrato a due giorni animali vecchi ^28. Al contrario, a 9 giorni di età animali sono completamente resistenti alle malattie. Specifici K1 batteriofago litico può essere utilizzata per differenziare E. coli K1 da altri E. coli ceppi ^29. In questo studio, sensibilità di batteri vitali per K1E batteriofago deve essere utilizzato (i) controllare la purezza del E. sospensioni coli K1 pronti ad essere somministrati agli animali, e (ii) per differenziare E. coli K1 dagli altri coliformi per calcolare la redditività in tamponi perianali, sangue e campioni di tessuto. Se la colonia è E. coli K1, sarà suscettibile di batteriofago K1E lisi, e la crescita batterica viene inibita nel sito di inoculazione batteriofago. Se la colonia non è E. coli K1, sarà bresistenti alla lisi KIE batteriofago e, e ci dovrebbe essere un'area di crescita batterica nel sito di inoculazione batteriofago. Va tenuto presente che modelli animali non possono riflettere tutte le caratteristiche della malattia naturale. Il modello attuale può essere modificato per esaminare le caratteristiche di virulenza dei batteri neuropatogeno diversi da E. coli A192PP e variazioni nelle dimensioni dell'inoculo colonizzare possono essere ospitati. Le future applicazioni della tecnica potrebbero includere la valutazione dei farmaci tanto necessari per trattare la condizione e per scoprire i dettagli della risposta dell'ospite alla colonizzazione e l'invasione dei tessuti.

Il metodo qui descritto è semplice ma efficace. Cucciolate singole di 10 - 12 cuccioli sono stati impiegati come gruppi di prova o di controllo e questo approccio intra-lettiera garantisce un alto grado di riproducibilità e validità statistica. È indispensabile che i cuccioli vengono restituiti al loro madri naturali appena possibile dopo ogni immissioe cucciolate e non dovrebbero pertanto comprendere gli animali sottoposti a diversi interventi. È importante che l'inoculo alimentato riscaldare altrimenti i cuccioli rifiuterà cultura offerta. I cuccioli sviluppano rapidamente una microflora complessa ed entro due giorni dalla nascita del tratto gastrointestinale è colonizzato con una vasta gamma di batteri dalla phyla stabilito come i microbi più abbondanti nel bambino e l'adulto intestino. Cuccioli che non sono stati alimentati E. coli A192PP non svolge E. coli K1 nel tratto GI ¹⁷ e quindi la determinazione dei tassi di colonizzazione è relativamente semplice. Tuttavia, il Neus -based metodo qPCR per il rilevamento di colonizzare E. coli K1 è molto più sensibile che i metodi di coltura tradizionali ed è fortemente consigliato ^17.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)	Harlan, UK
E. coli K1 A192PP	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E	Taylor lab		Mushtaq et al. 2004
Glycerol	Sigma, UK	G5516
Mueller-Hinton Agar	Oxoid, UK	CM0037
Mueller-Hinton Broth	Oxoid, UK	CM0405
MacConkey Agar	Oxoid, UK	CM0007
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma, UK	P4417
Ethanol 100%	Sigma, UK	E7023
Heparin Sodium Salt	Sigma, UK	84020	Prepare 20 - 50 units/ml
RNAlater Solution	Sigma, UK	R0901	10 μl/mg tissue
Acetic Acid	Sigma, UK	320099
Chloroform	Sigma, UK	C2432
Methanol	Sigma, UK	322415
Cotton-tipped swabs	Fisher Scientific, UK	11542483
Alcotip Swabs	Scientific Laboratory Supplies, UK	SWA1000
Petri dishes	Sigma, UK	P5856
30 ml Universal Tube	AlphaLaboratories, UK	CW3890
0.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1405-1500
1.5 ml microcentrifuge tubes	StarLab, UK	I1415-1000
0.1 μl calibrated loops	StarLab, UK	E1412-0112
L-shaped spreaders	StarLab, UK	E1412-1005
Cuvettes	Fisher Scientific, UK	10594175
Forceps straight with fine points	Fisher Scientific, UK	12780036
Forceps straight with blunt tips	Fisher Scientific, UK	12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points	Fisher Scientific, UK	12740926
Scissors straight with very fine points	Fisher Scientific, UK	12972055
Laboratory Scissors	VWR, UK	USBE4251
25 G Syringe Needles	Greiner Bio-One Ltd	N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers	PerkinElmer, UK	L60000BB
Unitemp Incubator	B&T, UK	OP958
Multitron shaking incubator	INFORS HT, UK	AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer	IKA Werke	0003737000