Summary
여기에, 절차는 대장균 K1의 문화와 신생아 쥐에 전신 감염의 설립을 설명합니다. 이것은 비 침습성 절차 맥락총에서 위장관 식민 전신 순환에 병원균의 전위, 및 중추 신경계의 침입을 허용한다.
Abstract
채용 감염 모델은 자연 감염의 주요 기능을 복제하는 경우 동물 숙주 박테리아 병원체 간의 상호 작용의 조사 만 의미가있다. 이 프로토콜은 인해 신생아 쥐에서 neuropathogenic 대장균 K1에 전신 감염의 설립 및 평가 절차에 대해 설명합니다. 위장관의 식민 감염의 창자 림프 혈액 - 뇌 코스를 따라 병원균의 확산을 유도하고, 모델은 강력한 인구 부양을 표시합니다. E.의 변형 대장균 Ø18 : 신생아 쥐에 대한 강화 된 독성와 K1는 식민지의 매우 높은 속도, 혈액 구획 및 맥락막 얼기를 통해 전송 다음 수막의 침공에 전위를 생성합니다. 인간 숙주에서와 같이, 중추 신경계의 침투 현지 염증과 변함 치명적인 결과를 수반한다. 모델은기구의 연구 입증 유틸리티이다병인, 치료 개입의 평가 및 세균 독성의 평가.
Introduction
전신 세균 감염은 웰빙과 신생아의 생존에 큰 위협이다 미숙아는 특히 취약하다. 자주 세균성 패혈증과 관련된 신생아 세균성 수막염 (NBM)은 삶의 처음 몇 주 동안 사망률과 이환율의 중요한 원천이 될 때까지 계속 문제가 전선 항균 약물 1, 2에 대한 저항의 지속적인 진화에 의해 악화된다. NBM의 경우는 높은, 의료, 사회적, 경제적 부담 (3)을 전달하는 응급 상황입니다; 결과적으로, 감염의 부담을 줄이기 위해 새로운 치료제 및, 특히, 새로운 예방 전략 절실히 요구되고있다. NBM의 일부 기능은 특이 : 선진국에서, 대장균 B 군 연쇄 구균은 거의 항상 보호 다당류 CA의 존재와 관련된 대부분의 케이스와 NBM을 유도하기 위해 이들 균주의 용량에 대한 책임면역 인식을 피하기 위해 병원균을 가능하게 psule 4를 처리합니다. neuroinvasive E.의 - (85 ~ 80 %)이 매우 높은 비율 대장균은 K1 캡슐 5, 6, 신경 가소성 (7)의 조절을 호스트 할 구조적으로 동일 α-2,8 결합 polysialic 산 폴리머를 표현한다.
새로운 치료제 및 NBM에 대한 예방법 및 관련 균혈증과 패혈증의 평가는 명확하게 특정 강한 연령 의존성 및 감염의 자연 경로에, 인간의 신생아 질병의 주요 기능을 모방 감염의 강력한 동물 모델에서 도움이 될 . 그람 양성과 그람 음성 세균 수막염에 대한 모델의 넓은 범위는 8,9 가능하며이 상당히 이러한 감염의 발병 기전, 병태 생리 및 치료 옵션에 대한 우리의 지식을 확장합니다. 따라서, 래트, 마우스, 토끼, 원숭이 실험 감염은 모두 n이 수막염을 연구하는데 사용되어왔다eonate 및 성인. 그러나, 이러한 모델의 대부분은 식민지의 사이트에서 보급의 자연적인 과정을 우회하여 인공 기전을 만들어 감염의 개시에 대한 박테리아의 직접 수조 내 또는 피하 주사를 사용합니다. 어떤 경우에는 접종이 방법은 병리에 상당한 변화를 주도; 예를 들면, E. 피하 투여 대장균 K1 균주 신생아 및 성인 10 모두 균혈증 및 중추 신경계 (CNS)의 침입을 제조, 자연 감염과 관련된 나이 의존성을 폐기. E.에 경향 대장균 NBM은 유아에 어머니로부터 원인균의 수직 감염에 의해 좌우 또는 곧 탄생 11 이후. E. 모계 유래 대장균 K1 박테리아는 출생시 멸균하지만 빠른 속도로 복잡한 미생물 (14)를 취득 신생아 위장관 11-13, 식민지. 식민지 신생아, E. 대장균K1 박테리아가 혈액 - 뇌 또는 혈액 - 뇌척수액 장벽 9,15 걸쳐 CNS 들어가기 전에 전신 순환으로 장 내강에서 전좌하는 능력을 가지고있다. 실험 감염의 강력한 모델의 디자인은 계정에 이러한 세부 사항을 고려해야한다.
마우스가 널리 세균성 수막염 (8)의 일부 형태의 연구를 위해 사용되었지만, 그들은 신생아 감염의 연구에 부적합하다 : 그들은 전신 감염에 의해 압도하고 인간의 유아 16의 강력한 인구 부양 특성을 표시하지 않습니다. 또한, α-디펜, E.에 의해 전신 침입에 대한 보호를 제공하는 위장관의 키 펩티드 대장균 K1 (17)는, 매우 인간과 쥐에서 Paneth 세포와 호중구에 있지만 마우스 (18)로 표현된다. 다른에서 찾을 수 없습니다 중복, 중복 및 마우스 디펜 신에 이질성과 관련 cryptidin 유전자의 놀라운 정도가있다19 imals. 신생아 쥐 처음 Moxon에 의해 사용 및 동료 (20)를 비강 내 접종 다음 헤모필루스 인플루엔자 수막염의 발병을 조사하기 위해, 인간이 신생아 병원균의 식민지의 자연 사이트를 복제, 이후 연령에 따라 E.에 대한 적응했다 대장균 K1 균혈증 및 수막염. Bortolussi 등. 세균 접종 21 고용 복강 내 주사 감염을 시작하지만 키 Glode의 연구와는 GI 식민지 후 감염의 자연 경로를 병렬 (22) 사용되는 경구 위 먹이를 동료. 위 튜브 점막 표면에 손상을 줄 수 있으므로, 절차는 신생아 (23)에 접종의 공급을 포함하는 정제되었다. 여기에, 위장관 집락과 설명 취약 쥐 새끼의 감염을 추적하기위한 절차에 대한 방법; 또한, 모델의 치료 및 예방 응용 프로그램이 논의된다.
Protocol
본 연구에서 수행되는 모든 동물 실험은 국내 및 유럽 법률을 본 및 약국의 UCL 대학의 윤리위원회와 영국 홈 오피스 (HO)에 의해 승인되었다. HO 프로젝트에서 수행 된 모든 동물의 작업은 PPL 2천2백43분의 80과 PPL 7천7백73분의 70 라이센스.
1. 쥐 준비
- 무균 위 스타 신생아 쥐를 사용하는 모든 생체 실험을 수행하십시오.
- 21 ° C, 45 - - 55 % 습도, 15-20 공기 변화 / 시간 및 최적의 조건 (19에서, - (11 주 오래 된 여성 9) 자신의 양모 개별 케이지에있는 모든 쥐 새끼 (식민지 당 12 신생아를) 유지 12 시간 명 / 암주기).
2. 박테리아 세포 준비
- 스토어 E. -80 ° C에서 20 % (v / v) 글리세롤에서 대장균 K1 주식. 각각의 실험을 위해, 접시 한천 뮬러 - 힌튼 (MH) 위에 재고 세균을 판, 37 ° CO / N 부화.
- 먹이, inocu 전날하나의 E.와 MH 국물의 후반 10 ml의 대장균 K1 식민지 문화 O / 37 ° C, 200 rpm에서 N. 매체 오염 컨트롤로서 uninoculated MH 액체 배지 10 ㎖를 준비하고, 200 rpm에서 37 ° C에서 배양한다.
- 전송 MH 액체 배지 9.9 ml를으로 O / N 세균 현탁액 100 ㎕ (1 : 100 v / v)로하고, 중간 지수 상 0.6의 광학 농도에 대응하여, 도달 할 때까지 37 ° C, 200 rpm에서 부화 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정.
E.와 신생아 쥐의 3 급지 대장균 K1
- 조심스럽게 입을 열 수 있도록, 목덜미에서 한 손으로 수직으로 동물을 잡아. 천천히 동물의 입에 멸균 피펫 팁을 삽입하고 30 초 기간 동안 동물의 입에 접종 (~ 37 ° C)의 피펫 20 μL. 즉시 공급 한 후 어머니에 동물을 돌려줍니다.
- 8 × 10 6 박테리아 t을 공급 한 - (4)가 있는지 확인O 시리얼 PBS에서 접종의 희석과 MH 한천 플레이트에 잡아 내 각 강아지.
E.에 의해 식민 4. 평가 대장균 K1
- 부드럽게 목덜미에서 한 손으로 동물을 잡아. 멸균 PBS에 멸균 면봉을 적셔 부드럽게 항문 주위 영역을 채취. 바로 보라고 한 후 어머니에 동물을 돌려줍니다.
- 멸균 PBS 300 μl를 포함하는 튜브에 면봉 팁을 놓고 얼음에 저장합니다.
- PBS에서 시리얼 희석 가능한 박테리아의 수를 결정하고 맥 콘키 배지 플레이트에 도금.
- 가능한 E.를 결정 박테리오파지 감수성 검사에 의한 대장균 K1. 멸균 미생물 루프를 사용하여 개별 식민지를 선택, 와류 혼합에 다음 주제 멸균 PBS 200 μL로 감소했다.
- 직선으로 MH 한천 위에 멸균 미생물 루프, 하위 문화를 사용. 판은 30 초 동안 건조하고 혈중 알코올 농도의 10 μl를 피펫 허용teriophage의 K1E 라인의 중심 상 (109 플라크 단위 / ㎖ (PFU / ㎖)을 형성 함). 37 ° C에서 판 O / N을 품어.
- 다음 날, 박테리오파지 매개 용해에 대한 판을 검사합니다.
질병 심각도 5. 평가
- 표 1에 요약 7 점의 점수 시스템을 사용하여 5 회 일일 - 4 각 동물의 중증도를 평가.
- 동물 점수가 7에서 ≥3 경우, 즉시 고통을 최소화하기 위해 동물을 추려. 죽은 동물을 기록합니다.
신생아 쥐와 혈액 수집 6. Euthanization
- 부드럽게 머리와 목을 노출, 한 손으로 동물을 잡아. 알코올 면봉으로 닦아 동물의 목을 소독. 미량의 에탄올을 제거하는 멸균 PBS로 세정 전에 70 % 에탄올을 사용하여 위의 큰 쌍 소독.
- 조심스럽게 페트리 접시 위에 직접 동물을 누르고 있습니다. 날카로운 surgi를 사용하여 신생아 목을 벨혈액 배양 접시에 똑똑 떨어지는 것을 보장 칼 가위,. 피부 식물과 혈액의 오염을 방지하기 위해 머리와의 접촉을 피하십시오.
- 즉시 멸균 피펫을 사용하여 혈액을 수집하고 (20)의 농도로 헤파린 나트륨 염과 혼합 - 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 50 단위 / ㎖.
- PBS에서 시리얼 희석 가능한 박테리아의 수를 결정하고 맥 콘키 배지 플레이트에 도금. 가능한 E.의 수를 결정 박테리오파지 K1E에 가능한 세균의 감수성을 테스트하여 대장균 K1.
7. 해부
- 신생아 쥐의 잘린 후, 절제와 관심의 조직을 수집하기 위해 무균 조건을 사용합니다. 70 % 에탄올과 멸균 PBS에서 (그림 1) 모든 악기를 씻으십시오.
- 해부 보드를 청소하고 70 % 에탄올로 완전히 복부 젖은. 왼쪽 뒷다리에 피닝의 뒷면에있는 시체를 놓고 (I)에 의해 해부 보드에 고정멸균 바늘 동작 테이블, (ⅱ) 시체 스트레칭 동작 테이블 우측 앞다리 피닝, (ⅲ) 작업 테이블 오른쪽 뒷다리와 좌측 앞다리 피닝.
- 집게를 사용 하복부의 왼쪽 측면을 따라 피부를 당겨, 박리 한 후 작은 가위를 사용 흉골 하복부로부터 시체의 왼쪽을 따라 절단.
- 흉골에 걸쳐 절제를 확장 한 다음 기본 구조 중에 손상되지 않도록 보장하는 집게와 작은 해부 가위를 사용하여 하복부에 흉골에서 시체의 오른쪽, 아래로.
- 마지막으로, 부드럽게 복막을 노출 홍채 곡선 해부 집게를 사용하여 복부에 흉골에서 피부 덮개를 아래로 당깁니다.
- 기본 장기 중에 손상되지 않도록 보장, 부드럽게 집게로 복막을 제기하고 내부 장기를 노출 수직으로 잘라.
8. 수집GI 요로
- 위, 소장, 맹장, 결장 및 장간막 림프 시스템을 확인합니다.
- 부드럽게 양쪽에에 병행하여 배를 제거한 다음 멸균 집게를 사용하여 멸균 PBS의 1.6 ml의를 포함하는 장식품에 배치합니다.
- 직장에서 콜론을 가로로 쪼개다. 조심스럽게 멸균 페트리 접시에 해부 포셉과 장소를 사용하여 시체에서 전체 장 질량을 당깁니다. 장 구조 및 장간막 림프 구조가 분리되지 않도록이 부드럽게 수행되었는지 확인합니다.
GI 요로 및 장간막 림프 시스템 9. 분리 (그림 2)
- GI 관이 완전히 잠기 보장 페트리 접시로 멸균 PBS 30 ㎖에 붓고.
- 장간막 림프 시스템의 중심 질량을 식별하고 미세 해부 집게를 사용 꼬집어. 소장의 가장 근위부를 식별하고 미세 해부 집게를 사용 꼬집어.
- 천천히 센트라를 당겨장간막 림프계 및 두 조직까지 반대 방향 말단부 소장 리터 매스 서로 완전히 분리된다. 이 근위부, 중간 및 말단 지역의 재현 수집을 방지로, 작은 창자가 늘어되지 않도록주의하여이 과정을 수행합니다. (300)에 장간막 림프 시스템을 배치 - 멸균 PBS 500 μL와 얼음에 배치합니다.
GI 요로 10. 단면
- 결장로부터 소장을 분리 맹장에서 GI 트랙트를 횡단면.
- (300)에 결장 장소 - 500 μL 멸균 PBS를 얼음에 배치합니다.
- 소장의 근위 중간 및 말단 지역의 대표 조직을 수집합니다. 중앙으로부터 소장을 맞 춥니 다.
- 이어서, (i)는 원위 소장 등 맹장에 앞서 조직의 마지막 2cm를 수집, (ⅱ) 5 내지 조직 수집 - 근위 소장 등의 중간 지점 위에 7 센티미터, 및중간 소장 등 중간 지점 아래 5 센티미터 - (III) 3의 조직을 수집합니다.
11. 간 수집
- 위의 제거 후 쥐의 간 세 로브를 식별합니다.
- 멀리 미세 해부 집게를 사용하여 복강에서 로브를 당깁니다.
- 미세 가위를 사용하여 부착하는 인대를 절단하여 간을 제거합니다. 얼음에 500 ㎕의 멸균 PBS 및 장소 - (300) 간을 놓습니다.
12. 비장 수집
- 비장을 확인합니다.
- 멀리 배에서 비장을 당겨 gastrosplenic 인대를 잘라 미세 가위를 사용합니다.
- 얼음에 500 ㎕의 멸균 PBS 및 장소 - (300)에 비장를 놓습니다.
제 12 항에있어서, 상기 신장을 수집
- 위장관 및 다른 장기의 제거시 복강의 뒤쪽에 가시 상태가 신장을 확인합니다.
- 컷 요관 및 부착 인대 U미세 해부 가위를 노래하고 미세 집게를 사용하여 신장을 제거합니다. 부신 및 미세 집게 및 해부 가위를 사용하여 (아직도 붙어있는 경우) 지방산 물질을 제거합니다.
- 300 ~ 500 ㎕의 멸균 PBS에 모두 신장을 놓고 얼음에 배치합니다.
14. 뇌를 수집
- 잘린 후, 곡선 집게를 사용하여 수직으로 머리를 잡아. 종 곡선 집게의 또 다른 세트를 사용하여 머리 꼭대기에 피부를 꼬집어, 미세 해부 가위를 사용하여 절개를. 목 근처에 남아있는 피부, 다시 길이 방향으로 미세 해부 가위를 잘라.
- 미세 해부 가위를 사용하여 피부 플랩을 두개골을 공개하고 제거하기 위해 양쪽에 미세 집게를 사용하여 바깥 방향으로 피부를 당겨. 척추 개방에 미세 해부 가위를 놓고 연단쪽으로 두개골을 따라 절개를합니다.
- 미세 집게를 사용하여 바깥 방향으로 두개골의 양쪽 부분을 잡아 당깁니다. 두개골 세그먼트를 제거하기 위해 잘라.
15. 조직 처리 및 균질화
- 멸균 PBS를 포함하는 튜브에 생존 횟수 또는 DNA 추출, 장소 조직을 필요로하는 실험. 즉시 단기 20 % 글리세롤과 -20 ° C에서 시리얼 PBS에 희석과 맥 콘키 배지 플레이트에 도금, 또는 상점에서 가능한 박테리아의 수를 결정합니다. DNA 추출, -20 ° C에서 저장 조직 용.
- RNA 추출, RNAlater 솔루션의 적절한 볼륨으로 장소 조직 (1 MG 조직 당 10 μL)을 필요로하는 실험을 위해, 다음 단기 또는 -80 ° C 장기 기억에서 -20 ° C에 바로 저장할 수 있습니다.
- 10 ml의 용액에 Methacarn 촬상이 필요한 실험 도시 조직 (60 % 메탄올, 30 %의 클로로포름, 10 % 아세트산)의 경우, 다음을 저장할T RT - 최대 3 주 (20 ~ 25 ° C에서).
- 전 조직의 첨가 한 후 튜브의 무게를 비교하여 조직의 무게를 계산합니다. 균질기를 사용하여 조직을 균질화. 각 시료의 균질화 사이에 멸균 PBS에 한 번 70 % 에탄올에 두 번 균질을 씻으십시오.
NOTE : Methacarn 고정술 뮤신 관련 점막 방어 구조를 보존하기 위해 장내 샘플의 고정을 위해 바람직하다; 포르말린 고정 전신 조직에 사용될 수있다.
Representative Results
E. 여기에 설명 된 대장균 K1 전신 감염 모델은 인간의 자연 감염의 대부분의 기능을 복제합니다. 박테리아, GI 관 정착 뇌 (24)의 연관된 염증 기관 특이 질병을 확립하기 전에 장간막 림프절 통해 혈액 구획으로 이동시키다, 섭취. 중요한 것은, 모형은 나이 강한 의존성을 표시; 도 3에 도시 된 바와 같이, 두 일령 (P2) 래트 새끼 침습성 질병에 매우 취약하지만, 칠일 동안 동물 감염 점차적 내화되어 있지만 요로 집락 17 GI하지. 혈액 구획에 GI 식민지의 사이트에서 통과 한 후, 박테리아는 맥락막 총 25 주로 중추 신경계에 들어가기 전에 형광 현미경 (그림 4)에서 혈액 샘플을 시각화 할 수 있습니다. 일부 동물과 같은 다른 주요 장기의 광범위한 침해가폐, 비장, 신장 25.
조직에서 세균 수는 각각 새끼 25 만 사이에 실질적으로 다를 수 있습니다 바이오 버든은 현재 또는 기관 침공과 관련하여 재현성 높은 수준의가없는 하나의 점수를 때. 단일 테스트 코호트로서 12 새끼 깔짚, G * 전원 Software를 사용하여 전력 계산이 샘플 크기가 여섯 코호트 동물 및 모든 경우> 99 %의 확률을 이용하여 생존에 기초하여 영향을 찾는 98.6 %의 확률로 동일시 판단 열두 고려된다. 모델은 특별히 신생아 세균 감염의 치료를위한 맞춤형 신규 제제의 평가에 적합하다 선택적 박테리아 표면 24-26에서 K1 캡슐을 제거 EndoE depolymerase 캡슐의 치료 가능성을 평가하는 절차에 사용되어왔다. 그것은 또한 호스트 박테리아 상호 작용을 확실에 그 영향을 조사하기 위해 사용될 수있다E.의 hogenesis 대장균 neuropathogens; 이 맥락에서 그것은 E.의 연구에 이용되고있다 대장균 A192PP 정착 및 보급. 그것은 것이 증명되었다 E. 대장균 A192PP 세포는 많은 수의 P2, P5 및 P9 새끼의 위장관에 계속; 이들 세 그룹에 집락의 시간적 양태 (도 5)와 매우 유사 하였다 복제 및 소화관 내 인구 밀도를 유지하는 박테리아의 능력을 반영한다.
임상 분리 A192의 독성은 동물의 사용을 거의 또는 전혀 중복을 보장하기 위해 신생아 쥐의 시리얼 통과에 의해 강화되었다. E. 콜라이 A192은, 100 %의 효율로 P2 신생아 래트 집락 동물의 35 %에서 균혈증을 유발하고 25 % 27에 치명적인 효과를 생성했다. 계대 파생 A192PP는 위장관을 식민지화 균혈증을 생산하고 모든 P2 새끼에서 치사가 발생합니다. 따라서, 모델의 디 독성을 조사하기 위해 사용될 수있다fferent K1은 식민지의 사이트에서 중추 신경계 및 다른 기관의 시스템에 침입하는 능력에 대한 균주. 이러한 맥락에서, Pluschke와 동료 23 95 E.의 용량을 결정하는 신생아 감염 쥐 모델을 사용하고 대장균 K1은 장내 정착 후 균혈증의 원인이 인간의 기원 균주; 그들은 E.의 클론 본질을 뒷받침하는, 식민지와 침략 능력 모두의 효율성에 다양한 변화를 관찰 대장균 K1은 neuropathogens.
그림 조직 수집 1. 재료 : (A) 무게 규모, (B) 필요한 미디어를 포함 미리 무게 튜브, (C) 작업 테이블, 눈금자 및 동물을 고정하는 바늘, (D) 70 % (V / V) 에탄올 및 PBS는, 조직 수집 장비를 살균
그림 2. 위장관의 분리 및 장간막 림프 시스템. (A) 그립 미세 해부 집게로 장간막 림프 시스템의 중심 질량. (B) 그립 소장의 근위부와 반대 방향으로 잡아 당깁니다. (C) 위장관 및 장간막 림프 시스템을 완전히 separat 것전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
E. 경구 투여 한 다음 구일 (P9)에 이일 (P2)에서 세 신생아 쥐 새끼의 그림 3. 생존 대장균 A192PP는 전신 감염의 강력한 인구 부양을 설명. 각 그룹은 24 신생아를 나타냅니다.
E. 그림 4. 형광 이미지 P2 강아지에서 혈액 도말 검사에서 대장균 A192PP 세포가 박테리아의 경구 투여를 다음 감염된. 박테리아 표면에서 리포 다당류 O 항원 성이었다토끼 항 Ø18 폴리 클로 날 항체와 Alexa546 결합 염소 안티 - 토끼 두 번째 항체 ained. K1 캡슐은 EndoE-GFP 시약 가시화 하였다. 사실상 혈액 샘플에서 검출 된 모든 세균 보호 K1 캡슐을 표시. 이미지가 박사 안드레아 Zelmer에 의해 포착되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. E. 세균 접종. DNA의 대장균 A192PP 장 식민지 다음과 같은 관리는 전체 소장하고 E.에서 추출 하였다 polysialyltransferase (네우스) 유전자를 표적 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)에 의해 결정 대장균 K1 콜로니 형성 단위 / g (CFU / g)은 다른 조직 (17)을 기술 된 바와 같이
| 기능 | 건강한 | 건강에 해로운 |
| 피부의 색 | 핑크 | 노란색 / 창백한 |
| 민첩성 (바로 잡고 반사) | 강아지는 즉시 뒤로 배치에 반대 | 뒤로 배치 (> 3 초) 역에서 어려움 또는 달성 할 수 |
| 복부에 약간 힘 | 아무 소리도 나지 않는 경우 | 교반의 소리 |
| 위 / 우유 라인 | 볼과 흰색 | 표시하지 않음 |
| 온도 | 따뜻한 | 상대적으로 추운 * |
| 무게 | 하루에 1.5 g의 이득 | 어떤 체중 증가하거나 체중 감소 |
| 케이지에 배치 동작 | 어머니를 향해 이동하고 F를 시작합니다eeding | 어머니를 향해 이동하고 어려움 먹이를 표시 할 수 없습니다 |
표 1. 7 점의 점수 체계 : 나열된 처음 세 개의 점수는 일반적으로 관찰되는 초기 징후이다. * 전신 감염 경험 상승 체온 (> 2 ° C)와 신생아. 그러나, 동물의 민첩성의 부족으로 체온을 유지하기 위해 자신의 어머니에 도달하기 위해, 건강에 해로운 동물은 쓰레기에서 분리되고 맨손에 차가운 느낄 수 있습니다.
Discussion
여기에 설명 된 동물 모델은 자연스럽게 인간 감염 발생의 현저한 특징을 재현하는 것을 목표로 이전 작업을 기반으로. 신생아 쥐 처음 H.에 의한 유아 수막염을 연구하기 위해 사용되었다 종은 감염의 강력한 모델에 대한 주요 기준을 만족으로 B 형 인플루엔자. 따라서, 관련 병원체의 항목의 포털은 자연 인간 감염의를 반영해야하고 재현성 치료 개입을 할 수 있도록 충분한 기간의 유사한 병리 상승 제공합니다. 기술 절차의 적용 가능성을 제한해서는 안 사용 질병 결과 (20)에 기여해서는 안된다. H.의 모델 Moxon과 동료들에 의해 개발 된 유아 쥐에 인플루엔자 뇌수막염은이 기준 (20)을 만족; 상부 호흡기와이 중요한 기능의 점막의 식민지가 아닌 외상에 의해 쥐의 새끼에서 복제 된 후 자연 감염 발생비강의 점막 위에 박테리아의 TIC 점안. 중요한 것은, 감염의 나이에 의존하는 특성은 모델에서 복제되었다.
동일한 그룹은 E.의 비 침습 모델을 개발 최초로 신생아 쥐 (22)에서 대장균 K1 NBM. 무균의 Sprague-Dawley 계 새끼는 구두 위 튜브를 통해 10월 8일에서 10월 10일까지 박테리아를 먹이의 식민지가되었다; 접종 그러므로 우리가 고용보다 상당히 높았다. 세 K1 균주를 조사하여 식민지, C94 (O7 : K1 : H-), EC3 (O1 : K1 : H-)와 LH (O75 : K1 : H3)은 상대적으로 높은 비율 (48~74%)의 발생 동물 K1은 먹이하지만, 균혈증, 수막염과 사망률의 빈도는 변수와 식민지의 비율보다 훨씬 낮았다. E.의 클론 본질 대장균 K1 실험 감염 후 23 일에 설립되었으며, 그것은 단지 Ø18 것이 이제 명백하다 : K1이와, 조금 적게, O7 : K1 혈청 형이 할 수 있습니다일관 전신 감염을 야기한다. 이러한 이유로, neuropathogenic E.의 병인의 이러한 수사 K1 스트레인 A192PP : 대장균 K1은 병독성이 향상된 Ø18의 사용을 기반으로했다. E.의 비교 에 의한 점막 표면으로 인한 손상에 거의 확실하게, 이전 방법을 사용하여 죽음의 과도한 숫자를 Achtman의 그룹 (23)에 의해 고용으로 Glode와 동료 (22), 및 액 공급 방법에 의해 사용되는 계시 위 튜브를 통해 신생아 쥐의 대장균 K1 공급 위 튜브. 식민지의 비율이 두 방법과 비교되기 때문에이 통신에 설명 된대로, 그것은, 살균 팁과 피펫을 사용하여 박테리아를 공급 덜 침습적 인 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
우리의 연구에서 사용 된 대장균 균주 A192PP는 Ø18입니다 : K1. 이는 임상 적 균주 E.보다 독성 유도체 인 원래 27 패혈증 환자로부터 회수 된 대장균 A192 (26)를 통해 직렬로 통과 얻었다. 이일 된 동물 (28)에게 투여 할 때 변형은 100 % 균혈증과 사망률, 연령에 따라 질병의 심각도를 이끌어 낸다. 반면 9 일 이전 동물 질병에 완전히 저항하는. K1 특정 용균 박테리오파지는 E.를 구별하는데 사용될 수있다 다른 E.에서 대장균 K1 대장균 29 균주. 본 연구에서는 박테리오파지 K1E에 가능한 세균의 감수성은 E.의 순도를 확인 (I)로 사용되어야한다 대장균 K1 현탁액 동물 먹이로 제조하고, (ⅱ)는 E. 차별화 항문 면봉, 혈액과 조직 샘플에서 가능성을 계산하기 위해 다른 대장균 군에서 대장균 K1. 식민지 E. 경우 대장균 K1, 그것은 박테리오파지 K1E 용해에 민감 할 것이며, 세균 성장은 박테리오파지 접종 부위에서 억제 될 것이다. 식민지 E.없는 경우 대장균 K1, 그것은 ㄴ 것KIE 박테리오파지 용해에 강한 전자, 그리고 박테리오파지 접종의 사이트에있는 박테리아의 성장의 영역이 있어야합니다. 이 동물 모델은 자연적으로 발생하는 질병의 모든 기능을 반영 할 수 있음을 명심해야한다. 현재의 모델은 E. 이외 neuropathogenic 박테리아의 독성 특성을 조사하기 위해 수정 될 수있다 콜라이 A192PP 및 식민지화 균액의 크기 변화는 수용 될 수있다. 기술의 미래의 애플리케이션은 많이 필요한 약물의 평가 상태를 치료하고 집락 조직 내습 숙주 반응의 세부 사항을 밝히기 위해서 포함될 수있다.
여기에 설명 된 방법은 간단하지만 효과적이다. (10)의 단일 새끼 - 12 새끼는 테스트 또는 대조군으로 사용 하였다이 내-쓰레기 접근 방법은 재현성 및 통계 유효성의 높은 수준을 보장합니다. 이 새끼가 어떤 procedur 후 가능한 빨리 자연의 어머니에 반환하는 것이 필수적이다전자와 새끼 그러므로 다른 개입을받은 동물을 포함하지 않아야합니다. 그것은 공급 접종 그렇지 않으면 새끼가 제공하는 문화를 거부합니다 따뜻하게하는 것이 중요하다. 새끼는 빠르게 복잡한 미생물을 개발하고 출생 두 일 이내에 위장관은 유아와 성인 장에서 가장 풍부한 미생물로 설립 문 (門)에서 박테리아의 넓은 범위의 식민지가된다. E.을 공급하지 않은 새끼 대장균 A192PP는 E.을 수행하지 않습니다 식민지의 속도의 대장균 K1 위장관에서 17 등 결정은 비교적 간단합니다. 그러나, 네우스는 E.을 식민지화의 검출을위한 qPCR의 방법을 기반 대장균 K1은 전통 문화의 방법이 훨씬 더 민감하고 강하게 (17)를 권장합니다.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 의학 연구위원회 (Medical Research Council)에서 연구 보조금 G0400268 및 MR / K018396 / 1 지원하고, 행동 의학 연구로했다. 또한 지원은 건강 연구 런던 대학 병원 바이오 메디컬 연구 센터의 국립 연구소에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) |  Harlan, UK |
||
| E. coli K1 A192PP | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Bacteriophage K1E | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Glycerol | Sigma, UK |
G5516 | |
| Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK |
CM0037 | |
| Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK |
CM0405 | |
| MacConkey Agar | Oxoid, UK |
CM0007 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK |
P4417 | |
| Ethanol 100% | Sigma, UK |
E7023 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma, UK |
84020 | Prepare 20 - 50 units/ml |
| RNAlater Solution | Sigma, UK |
R0901 | 10 μl/mg tissue |
| Acetic Acid | Sigma, UK |
320099 | |
| Chloroform | Sigma, UK |
C2432 | |
| Methanol | Sigma, UK |
322415 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK |
11542483 | |
| Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK |
SWA1000 | |
| Petri dishes | Sigma, UK |
P5856 | |
| 30 ml Universal Tube | AlphaLaboratories, UK |
CW3890 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1405-1500 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1415-1000 | |
| 0.1 μl calibrated loops | StarLab, UK |
E1412-0112 | |
| L-shaped spreaders | StarLab, UK |
E1412-1005 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific, UK |
10594175 | |
| Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK |
12780036 | |
| Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK |
12391369 | |
| Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12740926 | |
| Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12972055 | |
| Laboratory Scissors | VWR, UK |
USBE4251 | |
| 25 G Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd |
N2525 | |
| LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK |
L60000BB | |
| Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
| Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK |
AJ118 | |
| Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke |
0003737000 |
References
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