Summary
Her blir en fremgangsmåte beskrevet for etablering av systemisk infeksjon i den neonatale rotte med kulturer av Escherichia coli K 1. Denne ikke-invasiv prosedyre tillater kolonisering av mage-tarmkanalen, translokasjon av organismen til den systemiske sirkulasjon, og invasjon av sentralnervesystemet ved den choroid plexus.
Abstract
Gransking av samspillet mellom dyr vert og bakteriell patogen er bare meningsfull hvis infeksjonen modellen ansatt replikerer de viktigste funksjonene i naturlig infeksjon. Denne protokollen beskriver prosedyrer for etablering og evaluering av systemisk infeksjon som skyldes neuropathogenic Escherichia coli K1 i nyfødt rotte. Kolonisering av mage-tarmkanalen fører til spredning av patogenet langs tarmen-lymfe-blod-hjerne løpet av infeksjon og modellen viser sterk avhengighet alder. En stamme av E. coli O18: K1 med forbedret virulens for neonatal rotte produserer eksepsjonelt høy forekomst av kolonisering, translokasjon til blodrommet og invasjon av hjernehinnene etter transitt gjennom årehinnen plexus. Som i den humane vert, er penetreringen av det sentrale nervesystemet ledsaget av lokal inflammasjon og en alltid dødelig utfall. Modellen er påvist av verktøy for studier av mekanismenav patogenesen, for evaluering av terapeutiske intervensjoner og for vurdering av bakteriell virulens.
Introduction
Systemiske bakterielle infeksjoner er en stor trussel mot trivsel og overlevelse av nyfødte; premature barn er spesielt sårbare. Neonatal bakteriell meningitt (NBM), ofte assosiert med bakteriell sepsis, fortsetter å være en betydelig kilde til dødelighet og sykelighet i løpet av de første ukene av livet, og problemet forsterkes av den kontinuerlige utviklingen av resistens mot frontline antibakterielle legemidler 1,2. Et tilfelle av NBM er et medisinsk nødstilfelle som bærer en høy medisinsk, sosial og økonomisk byrde 3; derfor er det et presserende behov for nye behandlingsformer og særlig romanen profylaktiske strategier for å redusere byrden av infeksjon. Noen funksjoner i NBM er uvanlig: i den utviklede verden, Escherichia coli og Gruppe B streptokokker er ansvarlig for det store flertallet av tilfellene, og kapasiteten på disse stammene å lokke fram NBM er nesten alltid forbundet med tilstedeværelse av en beskyttende polysakkarid capsule som gjør at patogenet å unngå immun anerkjennelse behandler fire. En meget høy andel (80 - 85%) av neuroinvasive E. coli uttrykke K1 kapsel 5,6, en α-2,8-bundet polysialic syre polymer som er strukturelt identisk med vert modulatorer av neuronal plastisitet 7.
Evalueringen av nye behandlingsformer og profylaktiske for NBM og tilhørende bakteriemi og sepsis ville klart dra nytte av en robust dyremodell av infeksjon som etterligner de viktigste funksjonene i sykdommen i den menneskelige nyfødte, spesielt den sterke alders avhengighet og den naturlige veien for infeksjon . Et bredt spekter av modeller for Gram-positive og Gram-negative bakterie hjernehinnebetennelse er tilgjengelig 8,9 og disse har betydelig utvidet vår kunnskap om patogenese, patofysiologi og behandlingstilbud i disse infeksjonene. Således har eksperimentelle infeksjoner hos rotter, mus, kaniner og aper blitt brukt til å studere meningitt i både neonate og den voksne. Men mange av disse modellene benytter direkte intracisternal eller subkutan injeksjon av bakterier for igangsetting av infeksjon, noe som skaper en kunstig patogenesen ved å omgå naturlige prosesser for formidling fra stedet til kolonisering. I noen tilfeller er disse metodene for inokulasjon førte til betydelige endringer i patologi; for eksempel, subkutan administrasjon av E. coli-stammer K1 avskaffet alders-avhengighet forbundet med den naturlig infeksjon, produsere bakteriemi og invasjon av det sentrale nervesystemet (CNS) i begge nyfødte og voksne 10. Predisposisjon for E. coli NBM er kritisk avhengig av vertikal overføring av den utløsende agent fra mor til barn ved eller like etter fødselen 11. Matern-avledet E. coli K1 bakterier kolonisere neonatal gastrointestinal (GI) tarmkanalen 11-13, som er steril ved fødselen, men raskt får en kompleks microbiota 14. I kolonis nyfødte, E. coliK1 bakterier har kapasitet til å translocate fra tarmlumen i den systemiske sirkulasjon før de går inn i CNS på tvers av blod-hjerne-blod eller spinalfluid barrierer 9,15. Utformingen av robuste modeller av eksperimentell infeksjon bør ta disse detaljene i betraktning.
Selv om mus har vært mye brukt for å studere noen former for bakteriell meningitt 8, de er uegnet for studier av neonatal infeksjon: de er overveldet av systemisk infeksjon og ikke viser den sterke alder avhengighet karakteristisk for menneske spedbarn 16. Videre α-defensiner, nøkkel peptider i GI-trakten som gir beskyttelse mot systemisk invasjon av E. coli K1 17, er sterkt uttrykt i Paneth celler og neutrofiler i mennesker og rotter, men ikke i mus 18. Det er en bemerkelsesverdig grad av dobbeltarbeid, redundans og heterogenitet i muse defensin og relaterte cryptidin gener som ikke finnes i andre enimals 19. Neonatal rotte ble opprinnelig brukt av Moxon og kolleger 20 for å undersøke patogenesen av Haemophilus influenzae hjernehinnebetennelse etter intranasal vaksine, replikere den naturlige stedet for kolonisering av dette neonatal patogen i det menneskelige, og senere tilpasset for aldersavhengig E. coli K1 bakteriemi og meningitt. BORTOLUSSI et al. 21 ansatt intraperitoneal injeksjon av bakterieinokulum å initiere infeksjon, men nøkkelen studie av Glode og kollegaer 22 brukte oral mage fôring til parallell den naturlige ruten for infeksjon etter GI kolonisering. Som magesonde kan skade slimhinneoverflater, ble prosedyren raffinert til å omfatte foring av inokulumet til de nyfødte 23. Her er fremgangsmåten for mage-tarmkanalen kolonisering og prosedyrer for sporing av infeksjon hos følsomme rotteunger er beskrevet; I tillegg er terapeutiske og forebyggende anvendelser av modellen diskutert.
Protocol
Alle dyreforsøk utført i denne studien dannet nasjonal og europeisk lovgivning, og ble godkjent av etisk komité i UCL School of Pharmacy og Storbritannia Home Office (HO). Alle dyr arbeidet ble utført under HO prosjektet lisenser PPL 80/2243 og PPL 70/7773.
1. Rat Forberedelse
- Utføre alle in vivo eksperimenter med patogenfrie Wistar nyfødte rotter.
- Behold alle rotte kull (12 nyfødte per koloni) i enkeltmerder med sine ammende mødre (9 - 11 uker gamle kvinner), under optimale forhold (19-21 ° C, 45 - 55% luftfuktighet, 15-20 luftskifter / time og 12 timers lys / mørke syklus).
2. Bakteriell Cell Forberedelse
- Butikken E. coli K1 bestanden i 20% (v / v) glyserol ved -80 ° C. For hvert forsøk, plate ut aksje bakterier bort på Mueller-Hinton (MH) agar plater, og inkuberes ved 37 ° CO / N.
- Dagen før fôring, inocusene 10 ml MH buljong med en enkelt E. K1 coli koloni og kulturen O / N ved 37 ° C, 200 rpm. Som en kontroll for kontaminering medium, fremstille 10 ml av ikke-inokulert MH buljong og inkuber ved 37 ° C ved 200 rpm.
- Overfør 100 ul av O / N bakteriesuspensjon i 9.9 ml MH buljong (1: 100 volum / volum), og inkuberes ved 37 ° C, 200 opm, til midten av eksponensiell fase er nådd, tilsvarende til en optisk tetthet på 0,6 målt ved en bølgelengde på 600 nm (OD 600).
3. Mating av nyfødte rotter med E. coli K1
- Hold forsiktig dyret vertikalt i den ene hånden fra nakkeskinnet, slik at munnen til å åpne. Langsomt inn steril pipettespissen inn i munnen på dyret, og 20 ul pipette av inokulum (~ 37 ° C) inn i munnen på dyret over en 30 sek tidsperiode. Returner dyret til sin mor umiddelbart etter fôring.
- Kontroller at 4-8 x 10 6 bakterier har blitt matet to hver pup ved seriell fortynning av inokulumet i PBS og flekkdannelse på MH agarplater.
4. Vurdering av Colonization av E. coli K1
- Hold forsiktig dyret i den ene hånden fra nakkeskinnet. Fukt en steril bomullspinne i steril PBS, og deretter tørk forsiktig av perianal området. Returner dyret til sin mor umiddelbart etter pensling.
- Sett pinnen spissen inn i et rør som inneholder 300 mikroliter sterilt PBS og lagre på is.
- Bestem antall levedyktige bakterier ved serie fortynning i PBS og platekledning på MacConkey agar plater.
- Bestem levedyktig E. coli K1 ved bakteriofag resistenstesting. Plukk en individuell koloni hjelp av en steril mikrobiologisk loop, dyppet i 200 mL sterilt PBS, deretter gjenstand for vortex blanding.
- Ved hjelp av en steril mikrobiologisk sløyfe, sub-kultur på agar MH i en rett linje. Tillate platen å tørke i 30 sek, og deretter pipettere 10 ul av bacteriophage K1E (10 9 plakkdannende enheter / ml (PFU / ml)) på midten av linjen. Inkuber platen O / N ved 37 ° C.
- Neste dag, undersøke plate for bakteriofag-mediert lysis.
5. Vurdering av sykdommens alvorlighetsgrad
- Vurdere alvorligheten av sykdommen hvert dyr 4-5 ganger daglig ved hjelp av syv-punktet poengsystem som er beskrevet i tabell 1.
- Hvis et dyr score ≥3 ut av 7, umiddelbart innhente dyret for å minimere lidelse. Ta opp dyret som død.
6. Euthanization av nyfødte rotter og Blodprøvetaking
- Hold forsiktig dyret i den ene hånden, utsette hode og nakke. Desinfiser halsen på dyret ved å tørke med en spritserviett. Desinfisere en stor saks ved hjelp av 70% etanol, før skylling i steril PBS for å fjerne spor av etanol.
- Hold forsiktig dyret rett over en petriskål. Halshogge den nyfødte ved bruk av skarpe Surgical saks, noe som sikrer at blodet drypper inn i petriskål. Unngå kontakt med hodet for å hindre forurensning av blod med hud flora.
- Umiddelbart samle blod ved anvendelse av en steril pipette og bland med heparin-natriumsalt i en konsentrasjon på 20 - 50 enheter / ml i en 0,5 ml mikrosentrifuge-rør.
- Bestem antall levedyktige bakterier ved serie fortynning i PBS og platekledning på MacConkey agar plater. Finn ut hvor mange levedyktige E. coli K1 ved å teste mottakeligheten av levedyktige bakterier til bakteriofag K1E.
7. Dissection
- Etter halshogging av neonatal rotte, bruker aseptiske forhold til avgiftsdirektoratet og samle vev av interesse. Vask alle instrumenter (vist i figur 1) i 70% etanol og sterilt PBS.
- Rengjør disseksjon styret og fukte magen helt med 70% etanol. Plasser liket på ryggen og fest til disseksjon brettet ved (i) låsing venstre bakbenet tiloperasjonsbordet med en steril nål, (ii) strekker liket og låsing høyre forben til operasjonsbordet, (iii) feste det høyre bakben og venstre forben til operasjonsbordet.
- Trekk huden langs venstre side av nedre del av magen ved hjelp av tang, så kutt langs venstre side av liket fra nedre del av magen til brystbenet ved hjelp av små disseksjon saks.
- Forleng excision over sternum, og deretter ned til høyre side av liket fra sternum til nedre del av magen ved hjelp av pinsett og små disseksjon saks, slik at ingen av de underliggende strukturer er skadet.
- Til slutt, dra forsiktig ned huden klaff fra sternum til nedre del av magen ved hjelp av iris buede disseksjon tang for å avsløre bukhinnen.
- Forsiktig heve peritoneum med pinsett og kuttet vertikalt for å eksponere de indre organer, som sikrer at ingen av de underliggende organer er skadet.
8. CollectingGI Tract
- Identifiser mage, tynntarm, coecum, kolon og mesenteriske lymfesystemet.
- Ta av magen ved å forsiktig transecting på hver side, og deretter legge det i en bijou inneholdende 1,6 ml steril PBS hjelp steril tang.
- Transektet kolon ved endetarmen. Trekk forsiktig hele tarm masse fra liket ved hjelp av disseksjon pinsett og plasser i en steril petriskål. Sørg for at dette gjøres forsiktig slik at tarm struktur og tarmens lymfatiske konstruksjoner ikke skille.
9. Separering av GI-systemet, og den mesenteriske lymfesystemet (Figur 2)
- Hell 30 ml steril PBS i petriskålen, noe som sikrer GI-systemet er fullstendig neddykket.
- Identifiser sentrale massen av mesenteriske lymfesystemet, og klemme hjelp av gode disseksjon tang. Identifisere de mest proksimale delen av tynntarmen, og klemme hjelp av gode disseksjon tang.
- Trekke centra saktel massen av mesenteriske lymfesystemet og den distale tynntarm i motsatte retninger, inntil de to vev er fullstendig adskilt fra hverandre. Utfør denne prosessen med forsiktighet for å sikre at tynntarmen ikke er strukket, da dette hindrer reproduserbar samling av proksimale, midtre og distale regioner. Plasser mesenteriske lymfesystemet i 300-500 mL sterilt PBS og legg på is.
10. seksjonering av GI-systemet
- Tversgående mage-tarmkanalen ved cecum å separere tynntarmen fra tykktarmen.
- Plasser kolon i 300-500 mL sterilt PBS og legg på is.
- Samle representative vev fra proksimale, midtre og distale deler av tynntarmen. Rett tynntarmen fra midtpunktet.
- Deretter, (i) å samle inn de siste 2 cm vev før caecum som den distale tynntarm, (ii) samle vevet 5-7 cm over midtpunktet i den proksimale tynntarm, og(Iii) samle vevet 3-5 cm under midtpunkt som midttynntarmen.
11. Samle leveren
- Identifiser de tre fliker av rottelever etter fjerning av magen.
- Trekk lapper borte fra bukhulen hjelp av gode disseksjon tang.
- Fjern leveren ved å kutte noen fester leddbånd med lekkert saks. Plasser lever i 300-500 mL sterilt PBS og legg på is.
12. Samle Spleen
- Identifiser milten.
- Trekk milt bort fra magen og bruke gode saks til å klippe gastrosplenic ligament.
- Plasser milt i 300-500 mL sterilt PBS og legg på is.
13. Samle nyrer
- Identifiser nyrene som vil bli synlig på baksiden av bukhulen ved fjerning av mage-tarmkanalen og andre organer.
- Cut urinledere og eventuelle feste leddbånd usynger fint disseksjon saks og fjerne nyrene ved hjelp fin pinsett. Fjern binyrene og eventuelle fatty materiale (hvis fortsatt festet) med fin pinsett og disseksjon saks.
- Plasser begge nyrene i 300-500 mL sterilt PBS og legg på is.
14. Samle hjernen
- Etter halshogging, holde hodet i oppreist stilling ved hjelp av buet tang. Knip huden på toppen av hodet lengderetningen ved hjelp av et annet sett med buede tang, og gjøre et snitt hjelp av gode disseksjon saks. Skjær resten av huden i nærheten halsen, igjen på langs med fine disseksjon saks.
- Trekk huden i en retning utover bruker fine tang på begge sider for å avsløre skallen og fjerne hud flaps med lekkert disseksjon saks. Plasser fin disseksjon saks i rygg åpning og lage et snitt langs skallen mot talerstolen.
- Trekk begge deler av hodeskallen i en retning utover ved hjelp av fin pinsett. Klipp for å fjerne skallen segmenter.
15. Tissue Processing og homogenisering
- For eksperimenter som krever levedyktighet teller eller DNA-ekstraksjon, sted vev i rør som inneholder sterilt PBS. Umiddelbart bestemme antall levedyktige bakterier ved serie fortynning i PBS og platekledning på MacConkey agar-plater, eller oppbevar ved -20 ° C med 20% glyserol for kort sikt. For DNA-ekstraksjon, lagre vev ved -20 ° C.
- For eksperimentene som krever RNA-ekstraksjon, place vev inn i hensiktsmessige volumer av RNAlater-løsning (10 ul per 1 mg vev), og deretter lagre umiddelbart ved -20 ° C i kort sikt eller ved -80 ° C langtidslagring.
- For eksperimentene som krever avbildning, sted vev i 10 ml Methacarn oppløsning (60% metanol, 30% kloroform og 10% eddiksyre), og deretter lagre ent RT (20 - 25 ° C) i opptil 3 uker.
- Beregn vekten vev ved sammenligning av vekten av rør før og etter tilsetning av vev. Homogen vev ved hjelp av en homogenisator. Vask en gang homogenisator i 70% etanol og to ganger i steril PBS i mellom homogenisering av hver prøve.
MERK: Methacarn fiksering er ønskelig for fiksering av tarmprøver for å bevare mucin relaterte slimhinneforsvarsstrukturer; formalinfiksering kan anvendes for systemisk vev.
Representative Results
E. coli K1 systemisk infeksjon modellen beskrevet her gjentak mange av funksjonene i naturlig infeksjon hos mennesker. Bakteriene er inntatt, kolonisere mage-tarmkanalen, translocate i blodet rommet via mesenteriets lymfeknuter før etablering av organspesifikk sykdom med tilhørende betennelse i hjernen 24. Viktigere, viser modellen sterk alder avhengighet; som vist i figur 3, to-dager gamle (P2) rotteunger er svært utsatt for invasiv sykdom, men over en syv dagers periode dyrene blir progressivt mer motstandsdyktige overfor infeksjon, men ikke til mage-tarmkanalen 17. kolonisering. Etter transitt fra stedet av GI kolonisering til blodet rommet, kan bakteriene bli visualisert i blodprøver ved fluorescens mikroskopi (figur 4) før vi går i CNS hovedsakelig på årehinnen plexus 25. I noen dyr, er det en utstrakt invasjon av andre viktige organer som f.ekslunge, milt og nyre-25.
Bakterielt antall i vev kan variere betydelig mellom de enkelte unger 25, men når biobyrde scores som enten tilstede eller fraværende det er en høy grad av reproduserbarhet med hensyn til organ invasjon. Med et kull på 12 valper som en enkelt test årsklasse, kraft beregninger ved hjelp av G * Strøm programvare fastslått at dette utvalgsstørrelsen tilsvarer en 98,6% sannsynlighet for å finne en effekt basert på overlevelse ved hjelp av seks dyr fra kohorten og> 99% sannsynlighet hvis alt tolv blir tatt hensyn til. Modellen er derfor egnet for evaluering av nye midler som er tilpasset spesielt for behandling av bakterieinfeksjoner hos nyfødte, og har vært brukt i fremgangsmåten for å evaluere det terapeutiske potensial av kapselen depolymerase EndoE som selektivt fjerner K1 kapselen fra det bakterielle overflate 24-26. Det kan også brukes til å undersøke verts-bakterier interaksjoner som påvirker pathogenesis av E. coli neuropathogens; innenfor denne konteksten det har blitt ansatt for studier av E. coli A192PP kolonisering og formidling. Det har blitt demonstrert at E. coli A192PP celler vedvare i mage-tarmkanalen av P2, P5 og P9 valper i stort antall; tidsmessige aspekter ved kolonisering i disse tre gruppene var meget lik (figur 5) og reflekterer kapasiteten av bakteriene til å replikere og opprettholde befolkningstettheten i tarmen.
Virulensen av den kliniske isolat A192 ble forbedret ved seriell passasje i neonatale rotter for å sikre at liten eller ingen redundans av animalsk bruk. E. coli A192 kolonis P2 neonatale rotter med 100% effektivitet, fremkalte bakteriemi i 35% av dyr og produsert en dødelig effekt på 25% 27. Den passaged derivat A192PP koloniserer mage-tarmkanalen, produserer bakteriemi og forårsaker dødelighet i alle P2 valper. Således kan modellen benyttes for å undersøke virulensen av different K1 stammer med hensyn til deres evne til å invadere CNS og andre organsystemer fra stedet til kolonisering. I denne sammenheng Pluschke og kolleger 23 brukte et neonatal rotteinfeksjonsmodell for å bestemme kapasiteten til 95 E. coli K1 stammer fra mennesker til å forårsake bakteriemi etter gut kolonisering; de observerte store variasjoner i effektiviteten av både kolonisering og invasiv evne, underbygger den klonal natur E. coli K1 neuropathogens.
Figur 1. Materialer for vev samling: (a) vektskål, (B) ferdig veide rør som inneholder nødvendige media, (C) operasjonsbordet, linjal og nåler å peke ut dyret, (D) 70% (v / v) etanol og PBS å sterilisere vevet oppsamlingsutstyr,
Figur 2. Separering av GI-systemet, og den mesenteriske lymfesystemet. (A) Grip den sentrale massen av mesenteriske lymfesystemet med fine disseksjon tang. (B) Grip den proksimale delen av tynntarmen, og trekker i motsatt retning. (C) Den mage-tarmkanalen og mesenteriske lymfesystemet vil helt separate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Survival of nyfødte rotteunger i alderen fra to dager (P2) til ni dager (P9) etter oral administrering av E. coli A192PP, illustrerer den sterke alder avhengighet av systemisk infeksjon. Hver gruppe representerer 24 nyfødte.
Figur 4. Fluorescens bilder av E. A192PP coli-celler i et blodutstryk fra en P2 pup infiserte etter oral administrasjon av bakterier. Den lipopolysakkarid O-antigenet på bakterieoverflaten var stained med kanin-anti-O18 polyklonalt antistoff og Alexa546-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff. K1 kapsel ble visualisert med EndoE-GFP reagent. Nesten alle bakterier påvist i blodprøver vises beskyttelses K1 kapsel. Bilder ble tatt til fange av Dr. Andrea Zelmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. E. coli A192PP tarmkolonisering etter administrering av det bakterielle inokulat. DNA ble ekstrahert fra hele tarmen og E. coli K1 kolonidannende enheter / g (CFU / g) vev bestemt ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) rettet mot den polysialyltransferase (neus) -genet som beskrevet andre steder 17
| Feature | Sunn | Usunn |
| Fargen på huden | Rosa | Pale / Yellow |
| Agility (stabilitetsrefleks) | Pup reverserer umiddelbart bakover plassering | Vanskeligheter med å rygge bakover plassering (> 3 sek) eller ikke kan oppnå |
| Milde press på magen | Ingen lyd | Sound of agitasjon |
| Magen / melk linje | Synlig og hvitt | Ikke synlig |
| Temperatur | Varm | Relativt kaldt * |
| Vekt | Gevinst på 1,5-2 g per dag | Ingen vektøkning eller vekttap |
| Adferd når den plasseres i bur | Beveger seg mot mor og begynner å feeding | Kan ikke bevege seg mot mor og viser vanskelighetsgrad fôring |
Tabell 1. Syvpunkts scoring system: De tre første score oppført er vanligvis de første tegn observert. * Nyfødte med systemisk infeksjon erfaring forhøyet kroppstemperatur (> 2 ° C). Men på grunn av mangel på smidighet av dyrene for å nå deres mor til å opprettholde kroppstemperaturen, kan usunn dyr blir skilt fra kullet og føler kaldt til en naken hånd.
Discussion
Dyret modellen beskrevet her bygger på tidligere arbeid som mål å gjengi de viktigste funksjonene i naturlig forekommende infeksjoner hos mennesker. Neonatale rotter ble i utgangspunktet ansatt for å studere baby hjernehinnebetennelse grunn H. influenzae type b som arter fornøyd de viktigste kriteriene for en robust modell for infeksjon. Således bør portal for oppføring av det aktuelle patogen gjenspeiler den for det naturlige human-infeksjon og reproduserbart gi opphav til lignende patologi av tilstrekkelig varighet til å tillate for terapeutisk intervensjon. Teknikkene som brukes bør ikke begrense anvendbarheten av fremgangsmåten og må ikke bidra til sykdoms utfall 20. Modellen av H. influenzae hjernehinnebetennelse i baby rotter utviklet av Moxon og kolleger tilfredsstiller disse kriteriene 20; den naturlig infeksjon oppstår etter kolonisering av de mukosale membraner i de øvre luftveier, og dette viktig trekk ble replikert i rotteunger med ikke-traumatic instillasjon av bakteriene på membraner av nesegangene. Viktigere var det aldersavhengig arten av infeksjonen replikert i modellen.
Den samme gruppen var også de første til å utvikle en ikke-invasiv modell av E. coli K1 NBM i nyfødt rotte 22. Patogenfrie Sprague-Dawley valpene ble kolonisert av fôring 10 august til 10 oktober bakterier gjennom en muntlig gastrisk tube; inokulumet var derfor betydelig høyere enn den som anvendes av oss. Kolonisering med de tre K1-stammer undersøkt, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) og LH (O75: K1: H3), forekom i en relativt høy andel (48-74%) av K1-matet dyrene, men forekomst av bakteriemi, meningitt og dødelighet var variabel og betydelig lavere enn tallene for kolonisering. Den klonal natur E. coli K1 eksperimentell infeksjon ble etablert senere 23 og det er nå klart at kun O18: K1 og, i mindre grad, O7: K1 serotyper er i standå konsekvent forårsake systemisk infeksjon. Av denne grunn er disse undersøkelser av patogenesen av neuropathogenic E. coli K1 var basert på bruk av virulens-forbedrede O18: K1 belastning A192PP. En sammenligning av E. coli K1 mating av nyfødte rotter gjennom en magesonde, som brukes av Glode og kolleger 22, og en dråpe fôring metode som ansatt i Achtman gruppe 23 avslørt dreven tall for dødsfall ved bruk av den tidligere metoden, nesten helt sikkert på grunn av skade på slimhinneoverflater ved magesonde. Som tallene for kolonisering er sammenlignbare med disse to metodene, er det anbefalt å bruke mindre invasiv metode for å fôre bakteriene ved hjelp av en pipette med en steril spiss, som beskrevet i denne kommunikasjonen.
E. coli stamme A192PP brukes i våre studier er O18: K1. Det er en mer virulent derivat av den kliniske stammen E. coli A192 som opprinnelig ble utvunnet fra en pasient med sepsis 27 26 neonatale rotter. Belastningen utløser en aldersavhengig sykdommens alvorlighetsgrad, med 100% bakteriemi og dødelighet når det gis til to dager gamle dyr 28. I motsetning til dette, 9 dager gamle dyr er helt motstandsdyktig mot sykdom. K1-spesifikke lytisk bakteriofag kan brukes til å differensiere E. coli K1 fra andre E. coli stammer 29. I denne studien bør mottakelighet av levedyktige bakterier i bakteriofag K1E brukes til (i) å kontrollere renheten av E. coli K1 suspensjoner fremstilt for å bli matet til dyrene, og (ii) å skille E. coli K1 fra andre koliforme bakterier for å beregne levedyktighet i perianal vattpinner, blod og vevsprøver. Hvis kolonien er E. coli K1, vil det være utsatt for bakteriofag K1E lyse, og bakterievekst blir hemmet på stedet av bakteriofag inokulering. Hvis kolonien er ikke E. coli K1, vil det be resistent overfor bakteriofag KIE lyse, og det bør være et område av bakteriell vekst på stedet av bakteriofag inokulering. Det bør tas i betraktning at dyremodeller ikke kan gjenspeile alle funksjonene til naturlig forekommende sykdom. Den nåværende modellen kan bli endret for å undersøke virulens karakteristikker av andre enn E. neuropathogenic bakterier coli A192PP og variasjoner i størrelsen på kolon inoculum kan innkvarteres. Fremtidige anvendelser av teknikken kan omfatte evaluering av høyst tiltrengte medikamenter for å behandle tilstanden, og for å avdekke detaljer av vertsrespons til kolonisering og vevsinvasjon.
Metoden som beskrives her er enkel, men effektiv. Enkelt kull på 10-12 valper ble ansatt som test eller kontrollgrupper, og dette innenfor-kullet tilnærming sikrer en høy grad av reproduserbarhet og statistisk validitet. Det er viktig at valpene blir returnert til sine naturlige mødre så snart som mulig etter en eventuell procedure og kull bør derfor ikke omfatter dyr som gjennomgår ulike intervensjoner. Det er viktig at Fed inoculum bli varmet ellers valpene vil avvise den tilbudte kultur. Valpene raskt utvikle en kompleks microbiota og innen to dager etter fødselen mage-tarmkanalen er kolonisert med et bredt spekter av bakterier fra phyla etablert som de mest tallrike mikrober hos barnet og voksen gut. Valper som ikke har blitt matet E. coli A192PP ikke bære E. coli K1 i mage-tarmkanalen 17 og så fastsettelse av priser av kolonisering er relativt grei. Men Neus -baserte qPCR metode for påvisning av kolon E. coli K1 er langt mer følsom at tradisjonelle kultur metoder og anbefales på det sterkeste 17.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler G0400268 og MR / K018396 / 1 fra Medical Research Council, og ved Handling Medical Research. Ytterligere støtte ble gitt av Statens institutt for helseforskning ved Høgskolen London Hospitals Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) |  Harlan, UK |
||
| E. coli K1 A192PP | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Bacteriophage K1E | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Glycerol | Sigma, UK |
G5516 | |
| Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK |
CM0037 | |
| Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK |
CM0405 | |
| MacConkey Agar | Oxoid, UK |
CM0007 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK |
P4417 | |
| Ethanol 100% | Sigma, UK |
E7023 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma, UK |
84020 | Prepare 20 - 50 units/ml |
| RNAlater Solution | Sigma, UK |
R0901 | 10 μl/mg tissue |
| Acetic Acid | Sigma, UK |
320099 | |
| Chloroform | Sigma, UK |
C2432 | |
| Methanol | Sigma, UK |
322415 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK |
11542483 | |
| Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK |
SWA1000 | |
| Petri dishes | Sigma, UK |
P5856 | |
| 30 ml Universal Tube | AlphaLaboratories, UK |
CW3890 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1405-1500 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1415-1000 | |
| 0.1 μl calibrated loops | StarLab, UK |
E1412-0112 | |
| L-shaped spreaders | StarLab, UK |
E1412-1005 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific, UK |
10594175 | |
| Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK |
12780036 | |
| Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK |
12391369 | |
| Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12740926 | |
| Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12972055 | |
| Laboratory Scissors | VWR, UK |
USBE4251 | |
| 25 G Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd |
N2525 | |
| LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK |
L60000BB | |
| Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
| Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK |
AJ118 | |
| Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke |
0003737000 |
References
- Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
- Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Robbins, J. B., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. Med,, et al. 290 (22), 1216-1220 (1974).
- Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
- Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
- Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
- Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
- Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
- Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
- Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
- Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
- Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
- Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
- Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
- Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
- Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
- Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
- Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
- Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
- Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
- Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
- Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
- Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
- Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
- Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
- Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
- Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).
