Summary
Här är en procedur som beskrivs för inrättandet av systemisk infektion i nyfödda råttor med kulturer av Escherichia coli K1. Denna icke-invasiv förfarande möjliggör kolonisering av mag-tarmkanalen, translokation av patogenen till systemcirkulationen, och invasionen av det centrala nervsystemet hos choroid plexus.
Abstract
Undersökning av samspelet mellan djurvård och bakteriell patogen är bara meningsfullt om infektionen modellen som används replikerar de viktigaste inslagen i naturlig infektion. Detta protokoll beskriver rutiner för upprättande och utvärdering av systemisk infektion på grund av neuropathogenic Escherichia coli K1 i nyfödda råttor. Koloniseringen av magtarmkanalen leder till spridning av patogenen längs tarm lymfa-blod-hjärninfektionsförloppet och modellen visar starkt åldersberoende. En stam av E. coli O18: K1 med ökad virulens för nyfödda råttor producerar exceptionellt höga kolonisering, translokation till blodfacket och invasion av mening efter transitering genom choroid plexus. Liksom i den mänskliga värden, är penetration av det centrala nervsystemet tillsammans med lokal inflammation och en alltid dödlig utgång. Modellen är beprövad verktyg för studier av mekanismenav patogenes, för utvärdering av terapeutiska interventioner och för bedömning av bakteriell virulens.
Introduction
System bakteriella infektioner är ett stort hot mot den välfärd och överlevnad hos nyfödda; för tidigt födda barn är särskilt utsatta. Neonatal bakteriell meningit (NBM), som ofta förknippas med bakteriell sepsis, fortsätter att vara en betydande källa till dödlighet och sjuklighet under de första veckorna i livet och problemet förvärras av den fortsatta utvecklingen av resistens mot frontlinjen antibakteriella läkemedel 1,2. Ett fall av NBM är en medicinsk nödsituation som innebär en hög medicinsk, social och ekonomisk börda 3; Följaktligen finns det ett stort behov av nya läkemedel och, i synnerhet, nya profylaktiska strategier för att minska bördan för infektion. Vissa funktioner i NBM är ovanliga: i den utvecklade världen, Escherichia coli och grupp B-streptokocker är ansvariga för den stora majoriteten av fallen och kapaciteten hos dessa stammar att framkalla NBM är nästan alltid förknippat med närvaron av en skyddande polysackarid capsule som gör patogenen att undgå immunigenkänning processer 4. En mycket hög andel (80-85%) av neuroinvasive E. coli uttrycker K1 kapseln 5,6, en α-2,8-bunden polysialinsyra polymer som är strukturellt identisk med värd modulatorer av neuronal plasticitet 7.
Utvärderingen av nya läkemedel och profylax för NBM och tillhörande bakteremi och sepsis skulle klart gynnas av en robust djurmodell av infektion som efterliknar de viktigaste funktionerna i sjukdomen i människo nyfödda, särskilt den starka åldersberoende och den naturliga vägen för infektion . Ett brett utbud av modeller för grampositiva och gramnegativa bakteriella meningit finns 8,9 och dessa har betydligt utökat vår kunskap om patogenes, patofysiologi och behandling alternativ i dessa infektioner. Således har experimentella infektioner hos råttor, möss, kaniner och apor använts för att studera meningit i både neonate och vuxna. Men många av dessa modeller använder direkt intracisternal eller subkutan injektion av bakterier för initiering av infektion, skapa en artificiell patogenes genom att kringgå naturliga processer för spridning från platsen för kolonisering. I vissa fall kan dessa metoder för ympning lett till betydande förändringar i patologi; till exempel, subkutan administrering av E. coli K1 stammar upphävde åldersberoende associerad med naturlig infektion, producerar bakteriemi och invasion av det centrala nervsystemet (CNS) hos både nyfödda barn och vuxna 10. Predisposition för E. coli NBM är kritiskt beroende av vertikal överföring av smittämnen från moder till barn vid eller strax efter födseln 11. Maternell E. coli K1 bakterier koloniserar neonatal gastrointestinal (GI) tarmkanalen 11-13, som är steril vid födseln men snabbt får en komplex mikroorganismer 14. I koloniserade nyfödda, E. coliK1 bakterier har förmågan att translokera från tarmlumen in i den systemiska cirkulationen innan CNS över blod-hjärnan eller blod cerebrospinalvätska barriärer 9,15. Utformningen av robusta modeller av experimentell infektion ska ta dessa uppgifter med i beräkningen.
Även möss har ofta använts för studier av vissa former av bakteriell meningit 8, de är olämpliga för studier av neonatal infektion: de är överväldigade av systemisk infektion och inte visar den starka försörjnings karakteristisk för spädbarn 16. Vidare, α-defensiner, nyckel peptider av mag-tarmkanalen som ger skydd mot systemisk invasion av E. coli K1 17, är starkt uttryckt i Paneth celler och neutrofiler hos människor och råttor men inte hos möss 18. Det är en anmärkningsvärd grad av dubbelarbete, redundans och ojämnhet i mus defensin och relaterade cryptidin gener som inte finns i andra enDJUR 19. Den nyfödda råttor ursprungligen användes av Moxon och medarbetare 20 för att undersöka patogenesen av Haemophilus influenzae hjärnhinneinflammation efter intranasal inokulering, replikerar den naturliga platsen för kolonisering av denna neonatal patogen i människan, och därefter anpassat för åldersberoende E. coli K1 bakteremi och meningit. Bortolussi et al. 21 anställda intraperitoneal injektion av bakterieinokulat att initiera infektion men det viktigaste studien av Glode och medarbetare 22 begagnad oral sondmatning till parallell naturliga smittväg efter GI kolonisering. Som magsond kan skada slemhinneytorna ades förfarandet förfinats till att omfatta utfodring av ympen till nyfödda 23. Här, där metoden för magtarmområdet kolonisering och förfaranden för spårning av infektionen hos mottagliga råttungar beskrivs; dessutom är terapeutiska och förebyggande tillämpningar av modellen diskuteras.
Protocol
Alla djurförsök som utförs i denna studie överensstämde med nationell och europeisk lagstiftning och har godkänts av den etiska kommittén för UCL School of Pharmacy och det brittiska inrikesministeriet (HO). Alla djurarbete utfördes under HO-projektet licensierar PPL 80/2243 och PPL 70/7773.
1. Rat Framställning
- Utför alla experiment in vivo med hjälp patogenfria Wistar neonatala råttor.
- Behåll alla rått kullar (12 nyfödda per koloni) i enskilda burar med deras ammande mammor (9-11 veckor gamla honor), under optimala förhållanden (19-21 ° C, 45 - 55% luftfuktighet, 15 - 20 luftväxlingar / h och 12 timmar ljus / mörker-cykel).
2. Bakteriecellberedning
- Affär E. coli K1 lager i 20% (vol / vol) glycerol vid -80 ° C. För varje experiment plätera ut stock bakterierna på Mueller-Hinton (MH) agarplattor, och inkubera vid 37 ° CO / N.
- Dagen före utfodring, inocusena 10 ml MH buljong med en enda E. coli K1 koloni och kultur O / N vid 37 ° C, 200 rpm. Som en kontroll för medel kontamination, förbereda 10 ml av icke inokulerad MH buljong och inkubera vid 37 ° C vid 200 rpm.
- Transfer 100 ul av O / N-bakteriesuspension till 9,9 ml av MH-buljong (1: 100 v / v), och inkubera vid 37 ° C, 200 varv per minut, fram till mitten av exponentiell fas uppnås, vilket motsvarar en optisk densitet av 0,6 mätt vid en våglängd av 600 nm (OD 600).
3. Matning av neonatala råttor med E. coli K1
- Håll försiktigt djuret vertikalt i ena handen från nackskinnet, vilket gör att munnen öppnas. För långsamt in steril pipettspets i munnen på djuret, och pipettera 20 ul av inokulatet (~ 37 ° C) i munnen på djuret under en 30 sek tidsperiod. Tillbaka djuret till sin mamma direkt efter utfodring.
- Kontrollera att 4-8 x 10 6 bakterier har matats to varje pup genom serieutspädning av inokulatet i PBS och spotting på MH-agar-plattor.
4. Bedömning av Colonization av E. coli K1
- Håll försiktigt djuret i ena handen från nackskinnet. Fukta en steril bomullspinne i steril PBS, och sedan torka försiktigt rent perianala området. Tillbaka djuret till sin mamma direkt efter badda.
- Placera pinnen spets i ett rör innehållande 300 | il av steril PBS och förvara på is.
- Bestäm antalet livskraftiga bakterier genom seriespädning i PBS och plätering på MacConkey agarplattor.
- Bestämma viabla E. coli K1 från bakteriofag resistensbestämning. Välj en enskild koloni med en steril mikrobiologisk ögla, doppad i 200 l steril PBS, därefter föremål för virvelblandning.
- Använd en steril mikrobiologisk ögla, subkultur på MH agar i en rak linje. Låt plattan torka under 30 sek, och sedan pipettera 10 ul av bacteriophage K1E (10 9 plackbildande enheter / ml (PFU / ml)) på mitten av linjen. Inkubera plattan O / N vid 37 ° C.
- Nästa dag, undersöks plattan för bakteriofag medierad lys.
5. Bedömning av sjukdomens svårighetsgrad
- Bedöma sjukdomens svårighetsgrad för varje djur 4 - 5 gånger per dag med hjälp av sju punkter poängsystem beskrivs i tabell 1.
- Om ett djur får ≥3 av 7, omedelbart slakta djuret för att minimera lidandet. Spela djuret som död.
6. eutanasi av neonatala råttor och blodsamling
- Håll försiktigt djuret i ena handen, utsätta huvudet och halsen. Desinficera halsen av djuret genom att torka med en spritsudd. Desinficera en stor sax som använder 70% etanol, innan sköljning i sterilt PBS för att avlägsna spår etanol.
- Håll försiktigt djuret direkt ovanför en petriskål. Halshugga det nyfödda barnet med hjälp av skarpa Surgical sax, som ser till att blodet droppar in i petriskål. Undvik kontakt med huvudet för att förhindra kontaminering av blod med hudfloran.
- Omedelbart samla upp blod genom användning av en steril pipett och blanda med heparin-natriumsalt i en koncentration av 20 till 50 enheter / ml i en 0,5 ml mikrocentrifugrör.
- Bestäm antalet livskraftiga bakterier genom seriespädning i PBS och plätering på MacConkey agarplattor. Bestäm antalet livskraftiga E. coli K1 genom att testa känsligheten hos levande bakterier till bakteriofag K1E.
7. Dissektion
- Efter halshuggningen av nyfödda råttor, använd aseptiska förhållanden för att skära och samla vävnader av intresse. Tvätta alla instrument (som visas i figur 1) i 70% etanol och steril PBS.
- Rengör dissektion styrelse och väta buken fullständigt med 70% etanol. Placera liket på rygg och fixa till dissektion kortet genom (i) sätter vänster bakben tilloperationsbordet med en steril nål, (ii) sträcker liket och nålning höger framben till operationsbordet, (iii) pinning höger bakben och vänster framben på operationsbordet.
- Dra huden längs den vänstra sidan av nedre delen av magen med hjälp av pincett, klipp sedan längs den vänstra sidan av liket från nedre delen av magen till bröstbenet med hjälp av små dissektion sax.
- Utöka excision över bröstbenet och sedan ner den högra sidan av liket från bröstbenet till nedre delen av buken med hjälp av pincett och små dissektion sax, se till att ingen av de underliggande strukturerna är skadade.
- Slutligen försiktigt dra ner huden fliken från bröstbenet till nedre delen av buken med hjälp av iris böjda dissektion pincett för att exponera bukhinnan.
- Höja försiktigt bukhinnan med pincett och skär vertikalt för att exponera de inre organen, se till att ingen av de underliggande organen är skadade.
8. InsamlingGI Tract
- Identifiera magsäcken, tunntarmen, blindtarmen, kolon och mesenterial lymfsystemet.
- Ta bort magsäcken genom att försiktigt transecting på vardera sidan, sedan placera in i en bijou innehållande 1,6 ml steril PBS med hjälp av steril pincett.
- Transekt tjocktarmen vid rektum. Dra försiktigt hela tarmmassan från liket med hjälp av dissektion pincett och placera det i en steril petriskål. Se till att detta görs varsamt så att tarmstruktur och kröslymfk- lymfatiska strukturer inte separerar.
9. Separation av GI Tract och Mesenteric lymfsystemet (figur 2)
- Häll 30 ml av steril PBS i en petriskål, vilket säkerställer Gl-kanalen är helt nedsänkt.
- Identifiera den centrala massan av mesenteriala lymfsystemet, och nyp med fina dissektion pincett. Identifiera den mest proximala delen av tunntarmen, och nyp med fina dissektion pincett.
- Dra sakta central massa av mesenteriala lymfatiska systemet och den distala tunntarmen i motsatta riktningar tills de två vävnaderna är helt separerade från varandra. Utför denna process med omsorg för att se till att de små tarmarna inte sträcks, eftersom detta förhindrar reproducerbar samling av proximala, mellersta och distala regionerna. Placera mesenteriska lymfsystemet i 300-500 l steril PBS och placera på is.
10. Sektione av GI Tract
- Transekt Gl-kanalen vid blindtarmen för att separera den tunntarmen från kolon.
- Placera kolon i 300-500 l steril PBS och placera på is.
- Samla in representativa vävnader från proximala, mellersta och distala regionerna av tunntarmen. Rikta tunntarmen från mittpunkten.
- Sedan, (i) samla in de sista 2 cm av vävnaden före caecum som den distala tunntarmen, (ii) uppsamling av vävnad 5-7 cm ovanför mittpunkten som den proximala tunntarmen, och(Iii) samla vävnaden 3-5 cm under mittpunkten som mitten tunntarmen.
11. Samla levern
- Identifiera de tre lober i råttlever efter avlägsnande av magsäcken.
- Dra lober från bukhålan med fina dissektion pincett.
- Ta levern genom att skära alla knutna ligament som använder fina saxar. Placera lever i 300-500 l steril PBS och lägg på is.
12. Insamling av Spleen
- Identifiera mjälten.
- Dra mjälten bort från magen och använda fina sax för att klippa gastrosplenic ligament.
- Placera mjälte i 300-500 l steril PBS och lägg på is.
13. Samla njurarna
- Identifiera njurarna som kommer att bli synliga på baksidan av bukhålan vid avlägsnande av mag-tarmkanalen och andra organ.
- Cut urinledare och alla knutna ligament usjunger fina dissektion sax och ta bort njurar med fin pincett. Ta bort binjurarna och eventuella fettmaterial (om fortfarande sitter) med fin pincett och dissektion sax.
- Placera båda njurarna i 300-500 l steril PBS och placera på is.
14. Samla hjärnan
- Efter halshuggning, hålla huvudet upprätt med hjälp av böjda pincett. Nyp huden på toppen av huvudet på längden med en annan uppsättning av böjda pincett, och göra ett snitt med fina dissektion sax. Skär resterande huden nära halsen, återigen i längsled med fina dissektion sax.
- Dra huden i en utåtriktning med fin pincett på båda sidor för att avslöja skallen och ta bort hud flikar som använder fina dissektion sax. Placera fina dissektion sax i spinal öppning och gör ett snitt längs skallen mot talarstolen.
- Dra båda delar av skallen i en utåtriktning med fin pincett. Klipp för att ta bort skallen segment.
15. Vävnadsbearbetning och Homogenisering
- För experiment som kräver lönsamhets räknas eller DNA-extraktion, placera vävnader i rör innehållande steril PBS. Omedelbart bestämma antalet livskraftiga bakterier genom seriespädning i PBS och plätering på MacConkey agarplattor, eller förvara vid -20 ° C med 20% glycerol för kort sikt. För DNA-extraktion, lagra vävnader vid -20 ° C.
- För experiment som kräver RNA-extraktion, placera vävnader i lämpliga volymer av RNAlater-lösning (10 ^ per 1 mg vävnad), sedan lagra omedelbart vid -20 ° C för kort sikt eller vid -80 ° C långtidslagring.
- För experiment som kräver avbildning, ställe vävnader i 10 ml Methacarn-lösning (60% metanol, 30% kloroform och 10% ättiksyra), sedan lagra ent RT (20-25 ° C) i upp till 3 veckor.
- Beräkna vävnad vikt genom jämförelse av vikten av rör före och efter tillsats av vävnader. Homogenisera vävnad med användning av en homogenisator. Tvätta homogenisatorn en gång i 70% etanol och två gånger i steril PBS i mellan homogenisering av varje prov.
OBSERVERA: Methacarn fixering är önskvärt för fixering av tarmprover i syfte att bevara mucin relaterade mukosala försvarsstrukturerna; formalin fixering kan användas för systemiska vävnader.
Representative Results
E. coli K1 systemisk infektion modell som beskrivs här replikerar många av de funktioner i naturlig infektion hos människa. Bakterierna har förtärts, kolonisera mag-tarmkanalen, translokera i blodutrymmet via kröslymfknutor innan upprättandet organspecifik sjukdom med tillhörande hjärninflammation 24. Viktigt visar modellen starkt åldersberoende; som visas i figur 3, två dagar gamla (P2) råttungar är mycket mottagliga för invasiv sjukdom, men under en period om sju dagar djuren blivit allt mer refraktär mot infektioner, men inte till mag-tarmkanalen kolonisering 17. Efter transit från platsen för GI kolonisering till blodutrymmet, kan bakterierna visualiseras i blodprov genom fluorescensmikroskopi (Figur 4) innan CNS huvudsakligen vid åderhinnan plexus 25. I vissa djur, det finns en omfattande invasion av andra viktiga organ, t.ex.lunga, mjälte och njure 25.
Bakteriella nummer i vävnader kan variera kraftigt mellan enskilda valpar 25 men när biologiska belastningen görs antingen närvarande eller frånvarande det finns en hög grad av reproducerbarhet med avseende på organ invasion. Med en kull på 12 valpar som ett enda test kohort, effektberäkningar med G * Power Software fastställt att denna urvalsstorlek motsvarar en 98,6% sannolikhet att hitta en effekt baserad på överlevnad med sex djur från kohorten och> 99% sannolikhet om allt tolv beaktas. Modellen är därför lämplig för utvärdering av nya medel som särskilt anpassade för behandling av neonatala bakterieinfektioner och har använts i förfarandet för att utvärdera den terapeutiska potentialen hos kapseln depolymerase EndoE som selektivt avlägsnar K1 kapsel från bakterieytan 24-26. Det kan också användas för att undersöka värdbakterieinteraktioner som påverkar den pathogenesis av E. coli neuropathogens; i detta sammanhang har varit anställd för studier av E. coli A192PP kolonisation och spridning. Det har visats att E. coli A192PP celler kvar i mag-tarmkanalen i P2, P5 och P9 valpar i stort antal; temporala aspekter av kolonisation i dessa tre grupper var mycket lika (Figur 5) och speglar förmågan hos bakterierna att replikera och bibehålla befolkningstäthet i tarmen.
Virulens den kliniska isolat A192 förstärktes av seriepassage hos neonatala råttor för att se till liten eller ingen redundans av djur. E. coli A192 koloniserat P2 neonatala råttor med 100% effektivitet, framkallade bakteriemi hos 35% av djuren och producerade en dödlig effekt på 25% 27. Den passe derivatet A192PP koloniserar mag-tarmkanalen, producerar bakteriemi och orsakar dödlighet i alla P2 valpar. Således kan modellen användas för att undersöka den virulens different K1 stammar med avseende på deras förmåga att invadera CNS och andra organsystem från platsen för kolonisering. I detta sammanhang Pluschke och medarbetare 23 använde en neonatal råttinfektionsmodell för att bestämma kapacitet på 95 E. coli K1 stammar av humant ursprung för att orsaka bakteriemi efter gut kolonisering; De observerade stora variationer i effektivitet både kolonisering och invasiv förmåga, ligger till grund för klon natur E. coli K1 neuropathogens.
Figur 1. Material för vävnadssamling: (A) våg, (B) förvägda rör som innehåller nödvändiga medier, (C) operationsbordet, linjal och nålar att hålla fast djuret, (D) 70% (v / v) etanol och PBS för att sterilisera vävnad samling utrustning,
Figur 2. Separation av mag-tarmkanalen och mesenteriska lymfsystemet. (A) Ta tag i centrala massan av mesenteriala lymfsystemet med fina dissektion pincett. (B) Ta tag i proximala delen av tunntarmen, och dra åt olika håll. (C) I mag-tarmkanalen och mesenteriska lymfsystemet kommer helt Separate. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Överlevnad av neonatala råttungar åldrarna två dagar (P2) till nio dagar (P9) efter oral administrering av E. coli A192PP, visar starka åldersberoende systemisk infektion. Varje grupp motsvarar 24 nyfödda.
Figur 4. Fluorescens bilder av E. coli A192PP celler i ett blodutstryk från en P2 pup smittad efter oral administrering av bakterier. Den lipopolysackarid O-antigen på bakterieytan var stained med kanin-anti-O18 polyklonal antikropp och Alexa546-konjugerad get-anti-kanin andra antikropp. K1 kapsel visualiserades med EndoE-GFP-reagens. Praktiskt taget alla bakterier som upptäcktes i blodprov visade skydds K1 kapseln. Bilder fångades av Dr Andrea Zelmer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. E. coli A192PP intestinal kolonisering efter administrering av det bakteriella inokulatet. DNA extraherades från hela tarmen och E. coli K1 kolonibildande enheter / g (CFU / g) vävnad bestämdes genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) med målsättning att polysialyltransferase (Neus) -genen som beskrivits på annat ställe 17
| Feature | Friska | Ohälsosam |
| Färgen på huden | Rosa | Pale / Gul |
| Agility (upprätningsreflex) | Pup vänder omedelbart på bakåt placering | Svårigheter att vända bakåt placering (> 3 sek) eller inte kan uppnå |
| Lätt tryck på buken | Inget ljud | Sound of agitation |
| Mage / mjölkledningen | Synlig och vit | Visas inte |
| Temperatur | Varm | Relativt kallt * |
| Vikt | Gain 1,5-2 g per dag | Ingen viktökning eller viktminskning |
| Beteende när den placeras i bur | Rör sig mot mor och startar feeding | Det går inte att gå mot mor och visar svårigheter utfodring |
Tabell 1. Sju-poängsystem: De första tre poängen som räknas är vanligtvis de första tecknen observerats. * Nyfödda med systemisk infektion erfarenhet förhöjd kroppstemperatur (> 2 ° C). Men på grund av bristen på agility av djuren för att nå sin mor för att upprätthålla kroppstemperaturen, kan ohälsosamma djur skiljas från kullen och fryser till bara handen.
Discussion
Den djurmodell som beskrivs här bygger på tidigare arbete som syftade till att återge de framträdande dragen i naturligt förekommande infektioner hos människor. Neonatala råttor ursprungligen användes för att studera spädbarn hjärnhinneinflammation på grund av H. influenzae typ b som arten uppfyllde de viktigaste kriterierna för en robust modell för infektion. Därför bör portalen för införande av relevanta patogener återspegla den för det naturliga infektioner och reproducerbart ge upphov till liknande patologi tillräckligt lång för att möjliggöra för terapeutisk intervention. De tekniker som används bör inte begränsa tillämpligheten av förfarandet och bör inte bidra till sjukdoms utfall 20. Modellen med H. influenzae meningit hos spädbarn råttor utvecklade av Moxon och kollegor uppfyller dessa kriterier 20; den naturliga infektionen sker efter koloniseringen av slemhinnor i de övre luftvägarna och denna viktiga funktion har kopierats i råttungar av icke-traumatic instillation av bakterierna på membranen i näsgångarna. Viktigt var den åldersberoende infektionens natur replikeras i modellen.
Samma grupp var också först med att utveckla en icke-invasiv modell av E. coli K1 NBM i nyfödda råttor 22. Patogenfria Sprague-Dawley valpar koloniserades genom att mata 8 oktober-10 oktober bakterier genom en muntlig magsond; ympen var alltså betydligt högre än den som används av oss. Colonization med de tre K1 stammarna undersöktes, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) och LH (Ø75: K1: H3), inträffade i en relativt stor andel (48-74%) av K1-matade djur, men incidensen av bakteriemi, meningit och dödligheten var varierande och betydligt lägre än andelen kolonisering. Den klonala naturen av E. coli K1 experimentell infektion etablerades senare 23 och det är nu klart att endast O18: K1 och, i mindre utsträckning, O7: K1 serotyper kanatt konsekvent orsaka systemisk infektion. Av denna anledning är dessa undersökningar av patogenesen av neuropathogenic E. coli K1 ades på användningen av virulens-förbättrade O18: K1 stam A192PP. En jämförelse av E. coli K1 utfodring av neonatala råttor genom en magsond, som används av Glode och kollegor 22, och en droppmatningsmetod som anställd av Achtman grupp 23 avslöjade höga antalet dödsfall som använder den tidigare metoden, nästan säkert på grund av skada på slemhinneytor från magsond. Eftersom andelen kolonisering är jämförbara med dessa två metoder, är det rekommenderat att använda mindre invasiv metod för att mata bakterierna med hjälp av en pipett med en steril spets, som beskrivs i detta meddelande.
E. coli-stam A192PP används i våra studier är O18: K1. Det är en mer virulent derivat av den kliniska stammen E. coli A192 som ursprungligen utvanns från en patient med blodförgiftning 27 26. Stammen framkallar en åldersberoende sjukdomens svårighetsgrad, med 100% bakteriemi och mortalitet vid administrering till 2 dagar gamla djur 28. Däremot 9 dagar gamla djur är helt resistenta mot sjukdomen. K1 specifik lytisk bakteriofag kan användas för att skilja E. coli K1 från andra E. coli-stammar 29. I denna studie bör mottaglighet av viabla bakterier till bakteriofag K1E användas för att (i) kontrollera renheten av E. coli K1 suspensioner beredda att ges till djuren, och (ii) för att skilja E. coli K1 från andra koliforma bakterier för att beräkna lönsamheten i perianala kompresser, blod och vävnadsprover. Om kolonin är E. coli K1, kommer den att vara känslig för bakteriofag K1E lys, och bakterietillväxt kommer att hämmas vid stället av bakteriofag inokulering. Om kolonin inte E. coli K1, ska det be resistent mot KIE bakteriofag lys, och det bör finnas ett område med bakterietillväxt vid platsen för bakteriofag ympning. Man bör komma ihåg att djurmodeller inte kan spegla alla funktioner i den naturligt förekommande sjukdomen. Den nuvarande modellen kan modifieras för att undersöka virulens egenskaper som andra än E. neuropathogenic bakterier coli A192PP och variationer i storleken på den koloniserande inokulat kan rymmas. Framtida tillämpningar av tekniken skulle kunna inbegripa utvärderingen av välbehövliga läkemedel för att behandla tillståndet och för att avslöja detaljer av värd svar på kolonisering och vävnadsinvasion.
Den här beskrivna metoden är enkel men effektiv. Enstaka kullar med 10-12 valpar användes som test eller kontrollgrupper och detta inom-kullen metod säkerställer en hög grad av reproducerbarhet och statistisk validitet. Det är absolut nödvändigt att valparna återförs till sina naturliga mödrar så snart som möjligt efter det att något GÅNGe och kullar bör därför inte omfatta djur som genomgår olika interventioner. Det är viktigt att den matade inokulum värmas annars valparna kommer att avvisa det erbjudna kulturen. Valparna snabbt utveckla en komplex floran och inom två dagar efter födseln magtarmkanalen koloniseras med ett brett spektrum av bakterier från phyla etablerad som de mest förekommande mikroberna i spädbarnet och vuxen gut. Valpar som inte har utfodrats E. coli A192PP bär inte E. coli K1 i mag-tarmkanalen 17 och så bestämning av andelen kolonisering är relativt enkelt. Men Neus baserade qPCR metod för detektion av kolonisera E. coli K1 är mycket känsligare att traditionella odlingsmetoder och rekommenderas starkt 17.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsanslag G0400268 och MR / K018396 / 1 från Vetenskapsrådet, och Action Medical Research. Ytterligare stöd kom från det nationella institutet för hälsoforskning University College London Hospitals Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) |  Harlan, UK |
||
| E. coli K1 A192PP | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Bacteriophage K1E | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Glycerol | Sigma, UK |
G5516 | |
| Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK |
CM0037 | |
| Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK |
CM0405 | |
| MacConkey Agar | Oxoid, UK |
CM0007 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK |
P4417 | |
| Ethanol 100% | Sigma, UK |
E7023 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma, UK |
84020 | Prepare 20 - 50 units/ml |
| RNAlater Solution | Sigma, UK |
R0901 | 10 μl/mg tissue |
| Acetic Acid | Sigma, UK |
320099 | |
| Chloroform | Sigma, UK |
C2432 | |
| Methanol | Sigma, UK |
322415 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK |
11542483 | |
| Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK |
SWA1000 | |
| Petri dishes | Sigma, UK |
P5856 | |
| 30 ml Universal Tube | AlphaLaboratories, UK |
CW3890 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1405-1500 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1415-1000 | |
| 0.1 μl calibrated loops | StarLab, UK |
E1412-0112 | |
| L-shaped spreaders | StarLab, UK |
E1412-1005 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific, UK |
10594175 | |
| Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK |
12780036 | |
| Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK |
12391369 | |
| Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12740926 | |
| Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12972055 | |
| Laboratory Scissors | VWR, UK |
USBE4251 | |
| 25 G Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd |
N2525 | |
| LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK |
L60000BB | |
| Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
| Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK |
AJ118 | |
| Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke |
0003737000 |
References
- Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
- Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Robbins, J. B., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. Med,, et al. 290 (22), 1216-1220 (1974).
- Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
- Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
- Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
- Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
- Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
- Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
- Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
- Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
- Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
- Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
- Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
- Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
- Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
- Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
- Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
- Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
- Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
- Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
- Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
- Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
- Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
- Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
- Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
- Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).
