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सामान्य और रोगग्रस्त राज्य अमेरिका में आतंच थक्का संरचनाएं की जांच के लिए प्रायोगिक और इमेजिंग तकनीक

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

एक रक्त वाहिका के endothelial अस्तर को चोट hemostatic प्रतिक्रिया, या खून का थक्का के गठन के माध्यम से मरम्मत की है। रक्त बाह्य मैट्रिक्स में व्याप्त है, जब ऊतक कारकों जमावट झरना की दीक्षा की सुविधा है कि रक्त प्रवाह में प्लेटलेट्स को सक्रिय करें। इस उपचार प्रक्रिया की कुंजी मैकेनिकल घटक अत्यधिक लोचदार हैं कि आतंच फाइबर से बना आतंच मैट्रिक्स, है, और बड़े बलों 1-4 बनाए रख सकते हैं। कई शोधकर्ताओं ने बड़े पैमाने पर पिछले दशकों 13/05 में आतंच के गठन की संरचना, और समारोह का अध्ययन किया है।

इस तरह के मधुमेह और सिकल सेल के रूप में बीमारियों के साथ रोगियों में इस तरह के दौरे infarctions, इस्कीमिक हृदय रोग के रूप में थ्रोम्बोटिक जटिलताओं के विकसित होने का खतरा बढ़ जाता है, और 14-19 स्ट्रोक। 2 लाख से अधिक लोगों को नव संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल मधुमेह के साथ का निदान कर रहे हैं। प्रकार मैं जहां,: मधुमेह के दो प्रकार के होते हैंशरीर शरीर में इंसुलिन के लिए प्रतिरोधी हो जाता है, जहां इंसुलिन, और प्रकार द्वितीय, की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन करने में विफल रहता है। मधुमेह के रोगियों के अलावा, हृदय रोग (सीवीडी) रोग 20,21 के साथ जुड़े रुग्णता और मृत्यु दर के 80% के लिए कारण है।

सिकल सेल रोग (एससीडी) संयुक्त राज्य अमेरिका के 22 में 100,000 से अधिक लोगों को प्रभावित करता है कि एक आनुवंशिक रक्त विकार है। एससीडी यह मुश्किल कोशिकाओं को रक्त वाहिका 23 के माध्यम से पारित करने के लिए कर रही है, चंद्राकार बनने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं का कारण बनता है कि एक बिंदु उत्परिवर्तन की बीमारी है। इन रोग राज्यों के दोनों के शरीर में atherothrombotic शर्तों के विकास की संभावना में वृद्धि। इस के लिए कारणों में से एक रोगग्रस्त राज्यों 14,24-26 में बदल आतंच संरचना और समारोह का परिणाम है।

दोनों मधुमेह और सिकल सेल रोग में, hypercoagulation और atherothrombosis और हृदय रोग लाती है कि hypofibrinolysis गतिविधि (सी नहीं हैवी डी) स्वस्थ रोगियों 17,27,28 की तुलना में। यह hypofibrinolysis atherosclerosis के प्रगति को बढ़ावा देता है और समय से पहले कोरोनरी धमनी की बीमारी 29 के रोगियों के लिए बारम्बार इस्कीमिक घटनाओं engenders कि जाना जाता है। वर्तमान पांडुलिपि में, हम यह विशेष रूप से स्थापित करने में आतंच भौतिक गुणों की भूमिका की जांच की। गैर रोगग्रस्त रोगियों में आतंच थक्का संरचनाओं पतली फाइबर, बड़ा है pores, और आम तौर पर कम घने 14,24 से बना रहे हैं। स्वस्थ रोगियों में वृद्धि की porosity और कम घने आतंच थक्के फाइब्रिनोलयन 16 की सुविधा के लिए पाया गया है। इस तरह के मधुमेह और सिकल सेल रोग के रूप में hyperthrombotic परिस्थितियों में, स्वस्थ रोगियों 30-33 में 2.5 मिलीग्राम / एमएल के सामान्य स्तर से बढ़ाने के लिए फाइब्रिनोजेन एकाग्रता के कारण फाइब्रिनोजेन उत्पादन में वृद्धि हुई है, वहाँ है। स्वस्थ, गैर व्यास की तुलना में जब मधुमेह के रोगियों में गठित आतंच थक्के अधिक शाखा अंक है, और सघन, अधिक कठोर, कम असुरक्षित होना पाया गया हैbetic रोगियों 14,24,33-35। बदल आतंच संरचना का थक्का गठन में शामिल प्रोटीन में पाए जाते हैं कि ग्लिकेशन तंत्र का परिणाम है। ग्लूकोज के अणुओं को ठीक से पार जोड़ने glutamine और लाइसिन अवशेषों 33,36,37 से मानवीय पहलू XIIIa (FXIIIa) को रोकता है जो फाइब्रिनोजेन अणु, पर लाइसिन अवशेषों के लिए बाध्य जब Nonenzymatic (अपरिवर्तनीय) ग्लिकेशन होता है।

आतंच नेटवर्क के संरचनात्मक विश्लेषण हाल ही में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से, शोधकर्ताओं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और intravascular (endothelial सेल) और extravascular (fibroblasts और चिकनी मांसपेशी) दोनों कोशिकाओं आतंच संरचनाओं 40 विश्लेषण करने के लिए आतंच संरचना 39, उपयोग किया viscoelastic और वर्णक्रम विश्लेषण कैसे प्रभावित जांच आतंच नेटवर्क 38, के 3 डी पुनर्निर्माण, और का उपयोग किया है आतंच संरचना और यांत्रिक गुणों के बीच विकसित सहसंबंध प्रयोगात्मक का उपयोग करने और कम्प्यूटेशनल 41 दृष्टिकोण में इन विट्रो फाइब्रिनोजेन ग्लिकेशन प्रेरित करने के लिए ग्लूकोज समाधान में incubated किया गया था। सिकल सेल रोग के थक्के शर्तों अनुकरण करने के लिए, वृद्धि हुई फाइब्रिनोजेन सांद्रता हमारे समूह में 42 से पहले किया के रूप में रोगियों से एकत्र सिकल सेल हेमाटोक्रिट के साथ मिलाया गया। इन विधियों संरचना और रोगग्रस्त शर्तों के तहत आतंच थक्का बनने और फाइब्रिनोलयन में शामिल काम करता है, और साथ ही सीवीडी प्रेरित तंत्र है कि जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इन बीमारियों के बारे में वर्तमान जानकारी के आधार पर, Glycated आतंच थक्का संरचनाओं कम एक साथ सघन थेएन डी छोटे pores के। सिकल सेल रोगियों (लाल रक्त कोशिकाओं) से लाल रक्त कोशिकाओं के साथ आतंच थक्के भी सघन थे और लाल रक्त कोशिकाओं के एकत्रीकरण और Agglomerated आतंच समूहों का प्रदर्शन किया। यह पहले 43 निर्धारित किया गया है कि एक अच्छी तरह से स्थापित घटना है। यह भी फाइब्रिनोलयन दर के साथ और स्वस्थ, सामान्य आतंच की तुलना में कम plasmin बिना Glycated आतंच के थक्के में काफी कम होगा धारणा है कि गया था। परिणाम Glycated आतंच के थक्के के लिए, काफी अलग सेल दर परिणाम केवल कम plasmin एकाग्रता की शर्तों के तहत मनाया गया है कि पता चला है। कोशिकाओं और प्रोटीन के थक्के गतिविधि का वास्तविक समय वीडियो का कब्जा सक्षम बनाता है जो उनके मूल राज्य में रहते हैं क्योंकि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का यह प्रयोगात्मक तकनीक अन्य तरीकों इमेजिंग अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। Synthetically का उत्प्रेरण के थक्के का यह तरीका रोगी के नमूने प्राप्त करने और व्यक्ति को छान से भी सस्ता और अधिक समय कुशल हैप्रोटीन और एंजाइम। नमूने के बीच परिवर्तनशीलता प्लाज्मा में अन्य प्रोटीन का एक परिणाम के रूप में वहाँ नहीं था कि इतने इसके अलावा, थक्के synthesize करने के लिए अलग कर दिया प्रोटीन और एंजाइम का उपयोग करके, थक्के मानकीकृत किया गया।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल जॉर्जिया टेक में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों का पालन करता है।

1. रक्त संग्रह और लाल रक्त कोशिका अलगाव की प्रक्रिया

  1. 10 एमएल heparinized vacutainer ट्यूबों में दाताओं से रक्त की 40-120 मिलीग्राम ले लीजिए। संग्रह के 4 घंटा के भीतर PBMC (परिधीय रक्त mononucleated सेल) अलगाव शुरू करो। इस समय के दौरान, आरटी पर खून रहते हैं।
    नोट: इस कम PBMC उपज में परिणाम देगा के रूप में आर टी में या 4 डिग्री सेल्सियस में खून की हे / एन भंडारण नहीं की सिफारिश की है।
  2. पूरे रक्त एक पतला: एक ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) बाँझ पीबीएस में।
  3. पिपेट एक खाली, बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ ठंड हाइड्रोफिलिक पोलीसेकेराइड के 10 मिलीलीटर। धीरे हाइड्रोफिलिक पोलीसेकेराइड के शीर्ष पर पतला पूरे रक्त हस्तांतरण।
  4. बहुत धीरे धीरे ट्यूब के पक्ष के साथ धीमी गति से सेटिंग और पिपेट रक्त में एक 25 एमएल पिपेट का प्रयोग करें। रक्त CENTRI करने से पहले सैक्राइड के साथ मिश्रित नहीं दी जाएहाइड्रोफिलिक पोलीसेकेराइड अन्यथा कोशिकाओं और के लिए विषाक्त है fugation, क्योंकि PBMC उपज कम हो जाएगा।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 XG पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र रक्त के नमूनों। यदि उपलब्ध है, centrifugation के बाद बेहतर जुदाई के लिए अधिकतम के आधे के सेंट्रीफ्यूज का ब्रेक गति को कम।
  6. Centrifuged रक्त के नमूने की प्लाज्मा / प्लेटलेट अंश बंद महाप्राण। ध्यान से सीधे पैक आरबीसी परत के ऊपर हाइड्रोफिलिक पोलीसेकेराइड परत बंद aspirate।
  7. पैक लाल रक्त कोशिकाओं की 8-10 मिलीलीटर लीजिए और एक पतला: unsterile 0.9% सोडियम क्लोराइड नमक के साथ एक।

2. confocal माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन Glycated का थक्का संरचनाएं (नकली मधुमेह के थक्के)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर मानव फाइब्रिनोजेन और fluorescently लेबल मानव फाइब्रिनोजेन एकत्रित Defrost।
  2. पिपेट एक 0.5 मिलीलीटर में निम्नलिखित microcentrifuge ट्यूब स्नातक किया।
    1. स्वस्थ, सामान्य फाइब्रिनोजेन के थक्के के लिए, 10% fluorescently लेबल मानव फाइब्रिनोजेन के साथ मानव फाइब्रिनोजेन मिश्रण5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में एक 50 मिमी Tris / 100 मिमी NaCl बफर में एकत्रित।
    2. कृत्रिम रूप से Glycated फाइब्रिनोजेन के लिए, (मधुमेह के थक्के अनुकरण करने के लिए) 6.8 मिलीग्राम / एमएल की जिसके परिणामस्वरूप एकाग्रता के लिए 50 मिमी Tris / 100 मिमी NaCl में भंग ग्लूकोज की एक 5 मिमी समाधान में मानव फाइब्रिनोजेन और 10% fluorescently लेबल फाइब्रिनोजेन एकत्रित सेते हैं।
  3. प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए एक अपारदर्शी सामग्री का उपयोग सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब को कवर किया। 48 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब सेते हैं।
  4. स्लाइड के दो पक्षों पर एक पतली चिपकने वाला affixing द्वारा एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर एक कक्ष बनाओ।
  5. 48 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, आरटी पर FXIIIa और मानव अल्फा थ्रोम्बिन defrosting द्वारा आतंच गठन के लिए अभिकर्मकों तैयार करते हैं।
  6. 5 मिमी 2 CaCl बफर में 80 यू / मिलीलीटर FXIIIa पतला।
  7. 5 मिमी 2 CaCl बफर में 4 यू / एमएल थ्रोम्बिन पतला।
    1. सामान्य थक्के के लिए, फाइब्रिनोजेन, FXIIIa, और थ्रोम्बिन के अंतिम सांद्रता में 2.5 मीटर कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करेंजी / एमएल, 20 यू / एमएल, और क्रमशः 50 μl की एक मात्रा में एक यू / एमएल,।
    2. Glycated के थक्के के लिए, फाइब्रिनोजेन, FXIIIa, और थ्रोम्बिन के अंतिम सांद्रता क्रमशः 50 μl की एक मात्रा में, 3.4 मिलीग्राम / एमएल, 20 यू / एमएल, और एक यू / मिलीलीटर हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
  8. इसके तत्काल बाद चिपकने द्वारा गठित चेंबर में आतंच समाधान के 30 μl विंदुक।
  9. चिपकने के दो परतों के शीर्ष पर 0.15 मिमी की मोटाई के साथ एक 22 मिमी x 22 मिमी गिलास को कवर पर्ची रखें। बाहर सुखाने से आतंच थक्का को रोकने के लिए स्पष्ट चिपकने के साथ खुला पक्षों सील। चिपकने वाला आतंच थक्का के साथ बातचीत नहीं कर रहा है सुनिश्चित करें।
  10. आतंच थक्के confocal इमेजिंग से पहले दो घंटे के लिए 21-23 डिग्री सेल्सियस पर भाजन करने की अनुमति दें।
  11. एक 488 एनएम आर्गन लेजर के साथ एक 40x / 1.30 तेल M27 के लेंस के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के थक्के के confocal माइक्रोस्कोपी छवियों ले लो।

सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त आतंच के थक्के के 3. confocal माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर मानव फाइब्रिनोजेन और fluorescently लेबल मानव फाइब्रिनोजेन एकत्रित Defrost।
  2. पिपेट एक 0.5 मिलीलीटर में निम्नलिखित microcentrifuge ट्यूब स्नातक किया।
    1. स्वस्थ, सामान्य आतंच थक्का के लिए, 5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में एक 50 मिमी Tris / 100 मिमी NaCl बफर में 10% fluorescently लेबल मानव फाइब्रिनोजेन साधना के साथ मानव फाइब्रिनोजेन मिश्रण।
    2. एससीडी लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त थक्के के लिए, फाइब्रिनोजेन के परिणामस्वरूप एकाग्रता 10 मिलीग्राम / एमएल है कि एक 50 मिमी Tris / 100 मिमी NaCl ऐसे में मानव फाइब्रिनोजेन और 10% fluorescently लेबल मानव फाइब्रिनोजेन एकत्रित मिश्रण।
  3. एक सेल लेबलिंग समाधान का उपयोग कर पृथक लाल रक्त कोशिकाओं (सामान्य और आरबीसी अलगाव प्रोटोकॉल से प्राप्त सिकल सेल रोगियों से उन दोनों) लेबल।
    1. किसी भी चुना सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम में मिलीलीटर प्रति 1 एक्स 10 6 के घनत्व पर कोशिकाओं निलंबित।
    2. सेल-लेबलिंग समाधान करने के लिए सेल निलंबन के 5 μl / मिलीलीटर जोड़ें। कोमल pipetting द्वारा अच्छी तरह से धीरे मिलाएं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर लेबल वाले निलंबन ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित धीरे सतह पर तैरनेवाला निकालें और।
    5. धोने प्रक्रिया (3.3.4 और 3.3.5) दो बार दोहराएँ।
  4. 5 मिमी 2 CaCl बफर में 80 यू / मिलीलीटर FXIIIa पतला।
  5. 5 मिमी 2 CaCl बफर में 4 यू / एमएल थ्रोम्बिन पतला।
    1. सामान्य थक्के के लिए, फाइब्रिनोजेन, FXIIIa, और थ्रोम्बिन के अंतिम सांद्रता क्रमशः 50 μl की एक मात्रा में, 2.5 मिलीग्राम / एमएल, 20 यू / एमएल, और एक यू / मिलीलीटर हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
    2. एससीडी लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त थक्के के लिए, फाइब्रिनोजेन, FXIIIa, और थ्रोम्बिन के अंतिम सांद्रता क्रमशः 50 μl की एक मात्रा में, 5 मिलीग्राम / एमएल, 20 यू / एमएल, और एक यू / मिलीलीटर हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
  6. पिपेट आतंच समाधान में से लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के 10 μl। पिपेट माइक्रोस्कोप कांच पर लाल रक्त कोशिकाओं के साथ आतंच के 30 μl (जीएल के लिए तैयार करने के लिए स्लाइड करने के लिए देखेंycated थक्के)।
  7. आतंच confocal इमेजिंग से पहले दो घंटे के लिए 21-23 डिग्री सेल्सियस पर भाजन करने की अनुमति दें।
  8. Confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के थक्के के confocal छवियों ले लो, और fluorescently लेबल आतंच और लाल रक्त कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए 488 एनएम और 633 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजना लेसरों का उपयोग।

Glycated थक्का संरचनाएं में फाइब्रिनोलयन दरें 4. confocal माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन

  1. Glycated थक्के में फाइब्रिनोलयन दर मूल्यांकन के लिए Glycated थक्के (प्रोटोकॉल चरण 2) के confocal माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल दोहराएँ।
  2. स्पष्ट चिपकने के साथ चैंबर के सिरों मुहर न करें। आतंच थक्के निर्जलीकरण को रोकने के लिए पानी की 250 मिलीलीटर युक्त एक मोहरबंद बाड़े में 21-23 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए भाजन करने की अनुमति दें।
  3. Polymerization के बाद, confocal खुर्दबीन का उपयोग कर के थक्के की छवियों को प्राप्त करते हैं।
  4. पिपेट चैंबर के खुले अंत में plasmin और केशिका क्रिया के माध्यम से थक्का के माध्यम से plasmin फैलाने के।
    1. लिएसामान्य सांद्रता, पिपेट कक्ष के उद्घाटन में plasmin के 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल पर 25 μl के साथ सामान्य और Glycated फाइब्रिनोलयन प्रयोगों।
    2. कम सांद्रता, पिपेट कक्ष के उद्घाटन में 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल पर 25 μl के साथ Glycated के थक्के के लिए।
  5. थक्का lysing plasmin की वास्तविक समय वीडियो फुटेज पर कब्जा करने के लिए confocal खुर्दबीन सॉफ्टवेयर में समय श्रृंखला सुविधा (1 चित्र देखें) का प्रयोग करें।
    1. अधिग्रहण मोड पर क्लिक करें और फिर चुनें "समय श्रृंखला।" चक्रों की संख्या और रिकॉर्डिंग समय अंतराल चुनें।

5. फाइब्रिनोलयन दरों की गणना

  1. थक्का की एक निश्चित क्षेत्र को भंग करने के लिए आवश्यक बीता हुआ समय एक क्षेत्र (2500 माइक्रोन 2) स्थापित करने और गणना के द्वारा सेल दर निर्धारित करते हैं। निम्न समीकरण (चित्रा 2) का उपयोग सेल दर की गणना:
    1 समीकरण

फाइब्रिनोलयन दरों की 6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल डेटा का विश्लेषण। एक तरह से एनोवा और हॉक Tukey-क्रेमर परीक्षण 44,45 एक के बाद प्रदर्शन करते हैं।

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Representative Results

Glycated आतंच थक्का संरचनाएं के confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

सामान्य और Glycated थक्के के confocal माइक्रोस्कोपी छवियों। चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं सामान्य और Glycated के थक्के के confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण Glycated थक्के सघन साथ और थक्का polymerization के दौरान FXIIIa के अलावा बिना दोनों सामान्य थक्के की तुलना में छोटे pores के साथ कर रहे हैं कि पता चलता है। चित्रा 3 ए और 3 बी में, उच्च आतंच एकाग्रता (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के साथ Glycated के थक्के की तुलना में एक कम घने संरचना बनाई गई है, जो एक कम आतंच एकाग्रता है।

Glycated थक्के में मनाया अधिक से अधिक घनत्व (प्रति इकाई क्षेत्र फाइबर की संख्या) मधुमेह के साथ लोगों में पाया जाता है कि वृद्धि की फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का परिणाम है। सामान्य थक्के में, आतंच फाइबर अधिक रैखिक थे और FXIIIa, साथ polymerization पर लंबे समय तक तंतुओं का गठन किया है, जोसंभावना फाइबर के बीच क्रॉस-लिंक के गठन FXIIIa का परिणाम है। Glycated के थक्के के मामले में फाइबर भी FXIIIa के अलावा के साथ, कम होना को दिखाई दिया। इस संभावना के कारण फाइब्रिनोजेन अणु पर Glycated क्षेत्रों की उपस्थिति के लिए बदल दिया गया था कि polymerization की प्रक्रिया का परिणाम है। इसके अलावा, चित्रा 3 का विश्लेषण करने से, यह संभावना फाइबर मोटाई भी Glycated रेशों से प्रतिदीप्ति एक कम तीव्रता है प्रकट क्यों होने की संभावना है जो ग्लिकेशन का एक परिणाम के रूप में कम हो गया था कि है।

सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त आतंच के थक्के के confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

सिकल सेल रोगियों से सामान्य के साथ थक्के और लाल रक्त कोशिकाओं की आतंच थक्का संरचना की confocal खुर्दबीन छवियों चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं। जैसा कि भविष्यवाणी की, सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त आतंच के थक्के के confocal छवियों स्वस्थ आतंच सी की तुलना में सघन संरचनाओं थाबहुत सारे। चित्रा -4 ए आतंच और सामान्य लाल रक्त कोशिकाओं की एक समरूप वितरण से पता चलता है। हालांकि, 4B चित्रा में कोई आतंच नेटवर्क का गठन किया है, जहां आतंच और रिक्तियों के clumps कर रहे हैं। सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं homogenously छितरी नहीं थे, बल्कि आतंच clumps में एम्बेडेड थे। बढ़ी हुई घनत्व (प्रति इकाई क्षेत्र फाइबर की संख्या) एससीडी रोगियों में hypercoagulation का एक परिणाम के रूप में होता है कि वृद्धि की फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का परिणाम था। इसके अलावा, समुच्चय के लिए फार्म सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं की स्वाभाविक प्रवृत्ति आतंच नेटवर्क में interwoven हो गया है कि लाल रक्त कोशिकाओं के clumps engendered। यह सामान्य रोगियों में उन लोगों की तुलना आकृति विज्ञान में स्पष्ट रूप से अलग कर रहे हैं कि न्यायपालिका का थक्का संरचनाओं के गठन में हुई। 4B चित्रा से, यह सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं आतंच नमूने में अधिक से अधिक विविधता के कारण होता है और यह भी आतंच नमूना, में लाल रक्त कोशिकाओं की एक व्यापक स्थानिक वितरण के कारण होता देखा गया है कि जब कॉमसामान्य लाल रक्त कोशिकाओं के साथ स्वस्थ आतंच के थक्के को मुकाबले। इसके विपरीत, सामान्य लाल रक्त कोशिकाओं के साथ स्वस्थ आतंच थक्के आतंच नेटवर्क भर में कोशिकाओं के एक अधिक समरूप फैलाव का प्रदर्शन किया।

ज्यादा HbS (दरांती हीमोग्लोबिन) सिकल सेल रोगियों से एरिथ्रोसाइट्स में polymerized किया गया था और नमूने में निहित है कि कैसे यह अज्ञात है। क्या जाना जाता है, तथापि, HbS के किसी भी राशि की उपस्थिति सामान्य एचवीए अणुओं बनाम मात्रा प्रति इकाई HbS के अणुओं की संख्या में कोशिकाओं का अधिक से अधिक एकत्रीकरण का कारण बनता है। पान एट अल। 46 ऑक्सी HbS और ऑक्सी सामान्य वयस्क हीमोग्लोबिन, एचवीए की तुलना के लिए, वे डिओक्सी-HbS का एकत्रीकरण / क्लस्टरिंग प्रभाव की तुलना में जहां एक अध्ययन में इस घटना का प्रदर्शन किया है, और है। समाधान तैयार करने और उनके आकार और संख्या के बाद कुछ ही सेकंड के भीतर गठित समूहों 3 घंटा अप करने के लिए अपेक्षाकृत स्थिर बने रहे। अध्ययन से निष्कर्ष के दोनों ऑक्सी HbS और deoxy-HbS के अणुओं एक उच्च संख्या मांद में क्लस्टर कि थातापमान के एक समारोह के रूप में ऑक्सी एचवीए (सामान्य) के अणुओं से चर्चाएं। वर्तमान अध्ययन से संबंधित है, इस सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं को एक साथ क्लस्टर के लिए की संभावना थे, और यह फाइब्रिनोजेन अग्रदूत से polymerized किया जा रहा था के रूप में आतंच फंस कि इसका मतलब है।

सामान्य और Glycated थक्के के confocal माइक्रोस्कोपी Lysis दर विश्लेषण

यह फाइब्रिनोलयन दरों plasmin एकाग्रता में कमी आई साथ Glycated आतंच के थक्के की तुलना में सामान्य आतंच के थक्के के लिए अधिक से अधिक होगा धारणा है कि गया था। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी plasmin के अलावा के साथ आतंच के थक्के के lysis दरों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। औसत (मतलब है) plasmin के 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के अलावा के साथ सामान्य आतंच के lysis दरों 43.2 ± 2 / सेकंड और plasmin के 200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के अलावा के साथ Glycated आतंच की औसत (मतलब है) सेल दरों माइक्रोन 26.5 था 29.7 ± 11.2 माइक्रोन 2 / सेक। साथ lysed Glycated आतंच थक्का के लिएPlasmin के 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, औसत सेल दर 12.8 ± 3.1 माइक्रोन 2 / एसई था। 10 नमूने प्रत्येक (30 नमूने) के कुल औसत और मानक विचलन मूल्यों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। ये मान चित्रा 5 में प्रस्तुत कर रहे हैं। 0.05 की एक पी मूल्य स्वतंत्र प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्व को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। फाइब्रिनोलयन दरों का विश्लेषण plasmin काफी अलग थे कमी आई के साथ सामान्य के थक्के के लिए मूल्य Glycated (नकली मधुमेह) के थक्के की तुलना में है कि प्रदर्शन किया।

चित्र 1
वास्तविक समय प्राप्त करने के लिए विधि का ब्यौरा confocal खुर्दबीन सॉफ्टवेयर से चित्रा 1. नमूना स्क्रीनशॉट, आतंच थक्का सेल के निरंतर इमेजिंग। थी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।

चित्र 2
आतंच थक्का नमूना के lysis दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल निश्चित क्षेत्र के साथ चित्रा 2. उदाहरण confocal छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3। स्वस्थ और Glycated (मधुमेह) आतंच के थक्के के Confocal छवियों। हरी प्रतिदीप्ति आतंच नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है। Glycated आतंच मधुमेह के रोगियों में गठन के थक्के का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि unglycated आतंच, स्वस्थ रोगियों में गठन के थक्के का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) FXIIIa के अलावा बिना Unglycated आतंच। (बी) FXIIIa साथ Unglycated आतंच। (सी (डी) FXIIIa साथ Glycated आतंच बिना मजबूत>) Glycated आतंच। लाल पैमाने बार 50 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं के साथ सामान्य लाल रक्त कोशिकाओं और आतंच के थक्के के साथ स्वस्थ आतंच के थक्के के 4. Confocal छवियों। हरी प्रतिदीप्ति आतंच नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है और मैजंटा सिकल सेल रोगियों से स्वस्थ और लाल रक्त कोशिकाओं में लेबल का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) FXIIIa के साथ सामान्य आतंच एकाग्रता और एक सिकल सेल मरीज ​​से FXIIIa और लाल रक्त कोशिकाओं के साथ (बी) में वृद्धि आतंच में स्वस्थ लाल रक्त कोशिकाओं। सफेद पैमाने बार 50 माइक्रोन इंगित करता है। छवि (बी) में सफेद हलकों पहचानने योग्य sickled लाल रक्त कोशिकाओं का संकेत मिलता है।

चित्रा 5
चित्रा Glycated (मधुमेह) आतंच के थक्के और कम plasmin एकाग्रता के साथ Glycated के थक्के की तुलना में सामान्य आतंच के थक्के के 5. फाइब्रिनोलयन दरों। सांख्यिकीय महत्व एक तरह से एनोवा और एक के बाद हॉक Tukey-क्रेमर एकाधिक तुलना परीक्षण के आधार पर निर्धारित किया गया था। एनोवा विश्लेषण सेल दर का मतलब है के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर था कि पता चला है। Tukey-क्रेमर परीक्षण एपी <0.05 के साथ कम plasmin के साथ सामान्य के थक्के और थक्के के बीच अर्थ में एक महत्वपूर्ण अंतर था कि पता चला है। * सामान्य थक्के से एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है।

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Discussion

रोग राज्यों में थक्के तंत्र की संरचना के बारे में सार्थक डेटा प्राप्त करने के लिए, यह इन परिस्थितियों में प्रोटीन और कोशिकाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के थक्के में शामिल कारकों को अलग-थलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में मधुमेह और एससीडी राज्यों में आतंच थक्का की संरचना की जांच के प्रयोजनों के लिए विकसित किया गया था।

यह बदल शर्तों hypercoagulation, atherothrombosis, और सीवीडी के कारण के बाद से रोग राज्यों में आतंच गठन और फाइब्रिनोलयन में शामिल तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है। इस प्रयोग में प्राप्त confocal छवियों से, यह hypercoagulation गतिविधि एक बढ़ा फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का कारण बनता है, जो मधुमेह और एससीडी राज्यों में होता है कि स्पष्ट है। नेटवर्क भर में अधिक शाखा अंक और छोटे pores के साथ एक denser आतंच नेटवर्क में एक वृद्धि की फाइब्रिनोजेन एकाग्रता का परिणाम है। एससीडी रोगियों के आतंच नेटवर्क में, अधिक आतंच वर्तमान, बू वहां है ही नहींयह समूहों में आतंच entraps के रूप में भी नेटवर्क की संरचना में परिवर्तन सिकल सेल रोगियों से एरिथ्रोसाइट्स की कुल प्रकृति टी। सिकल सेल रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं का समूह भी नेटवर्क में आतंच समूहों के porosity कम कर देता है, लेकिन कुल मिलाकर नेटवर्क में शून्य एकाग्रता बढ़ाने के लिए प्रकट होता है। Glycated थक्के के फाइब्रिनोलयन विश्लेषण के परिणामों स्वस्थ, सामान्य के थक्के की तुलना में कम plasmin के साथ कम किया जा रहा है Glycated थक्के में सेल दर की परिकल्पना का समर्थन किया। लेकिन, परिणाम plasmin के सामान्य सांद्रता के साथ Glycated के थक्के के lysis दरों के बारे में निर्णायक सबूत नहीं प्रदान की थी। इस प्रकार यह सामान्य plasmin एकाग्रता के साथ मधुमेह के रोगियों के लिए, एक कुशल तरीके से आतंच थक्के नीचा करने के लिए पर्याप्त फाइब्रिनोलयन गतिविधि नहीं हो सकता है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है।

इस शोध अध्ययन में प्रदर्शन प्रयोगों के लिए, पृथक प्रोटीन और लाल रक्त कोशिकाओं के बजाय पूरे रक्त और प्लाज्मा की, इस्तेमाल किया गया। का उपयोग करकेअलग कर दिया प्रोटीन आतंच थक्के synthesize करने के लिए, रोगग्रस्त थक्के बनाम सामान्य के बीच बदल संरचनाओं के लिए कारणों में निर्धारित किया जा सकता है। यह बहुत अन्य प्लाज्मा प्रोटीन आतंच के थक्के की संरचना और आकृति विज्ञान के साथ हस्तक्षेप होने की संभावना कम हो। वे कोशिका मृत्यु और प्रोटीन गिरावट की चपेट में हैं लेकिन, जैसा कि पृथक प्रोटीन का उपयोग करके, यह दुकान और ठीक से कोशिकाओं और प्रोटीन संभाल करने के लिए महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन के लिए चुना confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तकनीक कोशिकाओं और प्रोटीन की प्राकृतिक थ्रोम्बोटिक गुण को बनाए रखना है, जबकि आतंच थक्का संरचनाओं के चित्र प्राप्त करने की क्षमता की वजह से था। Confocal माइक्रोस्कोपी भी सुधार विपरीत और पारंपरिक प्रकाश microcopy की तुलना में कम शोर के साथ नमूना के ऑप्टिकल संकल्प देने के लिए दिखाया गया है। लेजर प्रकाश में प्रवेश करने से ब्लॉक कि अनफोकस्ड प्रकाश एक पिनहोल में निर्देश दिया है। Confocal माइक्रोस्कोपी के उपयोग के लिए की जरूरत नहीं रहीलगानेवाला रसायनों के अलावा; इस प्रकार की कोशिकाओं और प्रोटीन आतंच के थक्के के गठन के अपने प्राकृतिक प्रोटीन गतिविधि को बनाए रखने में सक्षम थे। एक परिणाम के रूप में कोशिकाओं, प्रोटीन, और एंजाइमों वास्तविक समय गतिविधि के चित्र और वीडियो पर कब्जा करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी के उपयोग की अनुमति, उनके मूल राज्य में कार्य किया। Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ, आतंच के थक्के के 3 डी छवियों पर कब्जा कर लिया गया है और आतंच के थक्के के plasmin पाचन के वीडियो वास्तविक समय में प्राप्त किया गया। थक्का सेल की प्रक्रिया का एक समय श्रृंखला वीडियो पर कब्जा करने का थक्का करने plasmin जोड़ने, यह homogenously आतंच मैट्रिक्स के माध्यम से एंजाइम को तितर-बितर करने के लिए plasmin के माध्यम से केशिका क्रिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण था। इस जोड़े की plasmin एकाग्रता सटीक था और plasmin जोड़ा गया है कि स्थानीय क्षेत्र के विपरीत, पूरे थक्का lyse एंजाइम की अनुमति दी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था।

विधि और इस अध्ययन में प्राप्त परिणामों कि थक्का सेल पाया जो डन एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन के समान थेदरों नियंत्रण विषयों में 25 से मधुमेह विषयों में काफी कम थे। दोनों अध्ययनों में, मधुमेह (Glycated) के थक्के के सेल की दरों में महत्वपूर्ण मतभेद थे; हालांकि, मौजूदा प्रोटोकॉल सही रूप क्योंकि कम plasmin के स्तर के मधुमेह राज्यों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। साथ ही, इस शोध अध्ययन फाइब्रिनोलयन में विभिन्न समय अंतरालों पर असतत वर्गों का विश्लेषण करने के लिए इसके विपरीत, confocal खुर्दबीन का उपयोग वास्तविक समय में लगातार कब्जा कर लिया था। Wooton एट अल। 47 आतंच थक्का सेल की जांच की और थक्के के लिए सेल की दर की जांच के लिए एक सेल सामने वेग (सेमी / एस) कार्यरत है। वे सामने वेग निर्धारित करने के लिए अपने अध्ययन में confocal छवि विश्लेषण का इस्तेमाल किया। वर्तमान अध्ययन में, बजाय एक सेल सामने वेग से, एक सेल क्षेत्र वेग (क्योंकि छवि confocal पर विश्लेषण किया गया था जिस तरह से) का इस्तेमाल किया गया था। आगे हमारे अध्ययन में विकसित विधि मान्य करने के लिए, 48 में लेखकों का एक गणितीय मॉडल का वर्णन किया है वे फाइब्रिनोलयन की प्रभावी दर निरंतर के एक समारोह के रूप में सेल सामने वेग लिख जिसमें plasmin द्वारा आतंच थक्का सेल। समीकरण के रूप में दिया जाता है:
2 समीकरण

यहां, 3 समीकरण फाइब्रिनोलयन की प्रभावी दर निरंतर का प्रतिनिधित्व करता है, कश्मीर एक सोखना निरंतर सी बजे plasmin एकाग्रता है, और ρ एफ एन आतंच का घनत्व है, है। मापा मात्रा तो समीकरण 4 (वर्तमान अध्ययन में confocal विश्लेषण से मापा जाता है) का उपयोग किया जाता है और श्रृंखला नियम कार्यरत है, इस की ओर जाता है:
5 समीकरण

केवल एक आयाम यह मानते हुए टी "> समय के लिए सुराग प्रति यूनिट से बदल रहा है:

समीकरण 6

समीकरण 7

इस प्रकार के प्रयोग के लिए फाइब्रिनोलयन की प्रभावी दर निरंतर की ओर जाता है:
समीकरण 8

इस संबंध फाइब्रिनोलयन की है कि प्रभावी दर लगातार (infers समीकरण 9 ) Plasmin एकाग्रता (सी बजे) और क्षेत्र सेल दर के एक समारोह है समीकरण 10 ।

इस तकनीक को भी घनास्त्रता के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैएससीडी रोगियों, थोड़ा इस रोग के संबंध में आतंच और थक्के तंत्र के बारे में वहाँ से जाना जाता है के बाद से। आतंच के थक्के की संरचना पर एससीडी के प्रभाव पर आयोजित बहुत कुछ अध्ययन किए गए हैं; इस प्रकार इस अध्ययन से एकत्र confocal छवियों शामिल किया sickled लाल रक्त कोशिकाओं के साथ थक्का संरचना का दुर्लभ दृश्य प्रदान करता है।

समूहों के बीच साधन में मतभेदों की तुलना करने के लिए, एक तरह से एनोवा और एक के बाद हॉक Tukey-क्रेमर परीक्षण का उपयोग करें। एक एक तरह से एनोवा स्वतंत्र समूहों के बीच अर्थ में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल एक सांख्यिकीय परीक्षण है। Tukey-क्रेमर के बाद परीक्षण प्रत्येक स्वतंत्र समूह से साधन तुलना और समूहों 'का अर्थ है एक दूसरे से सांख्यिकीय अलग हैं, जो निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक तरह से एनोवा प्रदर्शन से पहले, परिणाम मान्य हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए मिले किया जाना चाहिए कि छह मान्यताओं कर रहे हैं। छह मान्यताओं हैं: एक सतत निर्भर चर (सेल दर), एक स्वतंत्र Variaएक घटना एक अन्य घटना को प्रभावित नहीं करता होने वाली ऐसी है कि प्रत्येक समूह में डेटा मनाया स्वतंत्र रूप से दो या दो से अधिक स्वतंत्र स्पष्ट समूहों से मिलकर ble (Glycated, सामान्य, और कम plasmin साथ Glycated), और (इस डेटा में कोई ओवरलैप है कि वहाँ का आश्वासन दिया।) , किसी भी महत्वपूर्ण outliers युक्त नहीं डाटासेट, सामान्य रूप से शापिरो-विल्क सांख्यिकीय परीक्षण द्वारा सत्यापित डेटा, और Levene सांख्यिकीय परीक्षण द्वारा सत्यापित डेटा में प्रसरण की एकरूपता वितरित की। इन मान्यताओं मिले थे एक बार, एक तरह से एनोवा और एक के बाद हॉक Tukey-क्रेमर परीक्षण सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए सीमा के रूप में 0.05 के पी मूल्य के साथ प्रदर्शन किया गया। एक तरह से एनोवा और पोस्ट-हॉक Tukey-क्रेमर परीक्षण का एक कठोर विस्तार के लिए, 44,45 के लिए देखें।

कुल मिलाकर, इस विधि का उनके पैतृक राज्यों में सामान्य और (कारण रोगग्रस्त राज्य अमेरिका के लिए) असामान्य आतंच के थक्के के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। विधि के रूप में भी अच्छी तरह से थक्का सेल के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए जानकारी प्रदान करता हैसेल दरों का सांख्यिकीय विश्लेषण के रूप में। थ्रोम्बस उत्पादन किया है और इन विट्रो में imaged किया जा सकता है जिस आसानी से सेलुलर और ऊतक इंजीनियरिंग में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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