Introduction
Повреждение эндотелия накладки кровеносных сосудов является исправлено с помощью гемостаза ответ, или образования сгустка крови. Когда кровь проникает во внеклеточный матрикс, факторы ткани активации тромбоцитов в крови, которые способствуют инициации каскада свертывания. Ключ механический компонент этого процесса исцеления фибрина матрица, состоящая из фибрина волокон, которые являются весьма эластичен, и может выдержать большие силы 1-4. Многие исследователи изучали структуру формирования и функции фибрина широко в последние десятилетия 5-13.
Пациенты с такими заболеваниями, как сахарный диабет и серповидно-клеточная имеют повышенный риск развития тромботических осложнений, таких как инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, и гладит 14-19. Более 2 миллионов человек только что поставили диагноз сахарный диабет каждый год в Соединенных Штатах. Есть два типа сахарного диабета: тип I, гдеорганизм не может производить достаточное количество инсулина, и типа II, где тело становится резистентным к инсулину. Среди больных сахарным диабетом, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются причиной 80% заболеваемости и смертности, связанной с заболеванием 20,21.
Серп клеточная болезнь (SCD) является генетическое заболевание крови, что влияет на более чем 100000 человек в Соединенных Штатах 22. ВСС является заболеванием, точка-мутации, что вызывает красные кровяные клетки, чтобы стать в форме полумесяца, что затрудняет клетки проходить через сосудистую крови 23. Оба этих болезненных состояний увеличить шансы развития атеротромбоза условия в организме. Одной из причин этого является то, результат измененной структурой фибрина и функции в болезненные состояния, 14,24-26.
В обоих диабетом и серповидно-клеточной анемией, есть гиперкоагуляция и hypofibrinolysis деятельность, которая вызывает атеротромбоза и сердечно-сосудистых заболеваний (CВ.Д.) по сравнению со здоровыми пациентами 17,27,28. Известно, что hypofibrinolysis способствует развитию атеросклероза и порождает повторных ишемических событий для пациентов с преждевременной ишемической болезни сердца 29. В текущем рукописи, мы исследовали роль фибрина физических свойств в данном обстановке. Сгусток фибрина структуры в не-больных пациентов состоят из тонких волокон, крупных пор и в целом менее плотной 14,24. Увеличение пористости и менее плотные сгустки фибрина у здоровых пациентов были обнаружены чтобы облегчить фибринолиз 16. В hyperthrombotic условий, таких как диабетическая и серповидно-клеточной анемии, происходит увеличение производства фибриногена, в результате чего концентрация фибриногена, чтобы увеличить от нормальных уровней 2,5 мг / мл у здоровых пациентов 30-33. Сгустков фибрина, образованные у больных сахарным диабетом были найдены, чтобы быть менее пористым, более жесткой, больше точки ветвления, и плотнее, по сравнению с здоровых, не диаметромBetic пациентов 14,24,33-35. Изменена структура фибрина является результатом гликирования механизмов, которые происходят в белках, участвующих в тромба. Неэнзиматической (необратимое) гликирование происходит, когда молекулы глюкозы связываются с остатками лизина в молекуле фибриногена, который ингибирует человеческий фактор XIIIa (FXIIIa) от правильно сшивающих глютамина и лизина 33,36,37.
Структурный анализ фибрина сетей была изучена в последнее время. В частности, исследователи использовали электронную микроскопию и 3D-реконструкция фибрина сетей 38, исследованных как оба внутрисосудистых (эндотелиальные) клетки и внесосудистые (фибробласты и гладкие мышцы) клетки влияют фибрина структуру 39, используемых вязкоупругих и спектральный анализ анализировать фибрина структуры 40, и развитые корреляции между структурой фибрина и механических свойств с помощью экспериментальных и расчетных подходов 41 в пробирке фибриногена гликирование. Для имитации серповидно-клеточной анемией условия свертывания, повышение концентрации фибриногена смешивают с серповидно-клеточной гематокрита, полученной от больных, как это сделано ранее в нашей группе 42. Эти методы были использованы для изучения структуры и функций, участвующих в образовании сгустка фибрина и фибринолиза при болезненных состояниях, а также механизмы, которые вызывают ССЗ. На основании текущей информации об этих заболеваний, гликозилированного фибринового сгустка структуры были плотнее с меньшим Аой мелкие поры. Фибрина сгустки с красных кровяных клеток из серпа больных клеток (эритроцитов) также плотнее и отображается агрегацию эритроцитов и агломерированные фибрина кластеров. Это хорошо установлено, что явление было определено ранее 43. Было также высказано предположение, что скорость фибринолиза будет значительно ниже в гликированного сгустков фибрина с и без плазмина пониженном по сравнению со здоровыми, нормального фибрина. Результаты показали, что для гликированного сгустков фибрина, значительно отличающиеся результаты скорости лизиса были обнаружены только в условиях пониженной концентрации плазмина. Этот экспериментальный методика с использованием конфокальной микроскопии обеспечивает значительные преимущества по сравнению с другими методами обработки изображений, потому что клетки и белки остаются в их нативном состоянии, что позволяет захват видео в реальном времени от активность по свертыванию. Этот метод синтетически, индуцирующих свертывание и дешевле, и больше времени эффективным, чем получение образцов пациентов и фильтрации человекабелков и ферментов. Кроме того, с помощью разделенных белков и ферментов для синтеза сгустки, тромбы были стандартизированы так, чтобы не было вариабельность между образцами, в результате других белков в плазме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол придерживается руководящих принципов, установленных ведомственного комитета (IRB) в Джорджии.
1. Сбор крови и красных кровяных Порядок Выделение клеток
- Сбор 40-120 мл крови от доноров в 10 мл гепаринизированные Vacutainer трубы. Начните РВМС (периферическая кровь Мононуклеированные клеток) изоляции, в 4 часа сбора. В течение этого времени держать кровь при комнатной температуре.
Примечание: O / N для хранения крови в РТ или в 4 ° С не рекомендуется, поскольку это приведет к снижению выхода РВМС. - Развести всю кровь 1: 1 в ледяной (4 ° С) стерильного PBS.
- Пипетка 10 мл охлажденного льдом гидрофильного полисахарида в пустую, стерильную 50 мл коническую трубку. Осторожно передавать разбавленный цельной крови в верхней части гидрофильного полисахарида.
- Использование пипетки 25 мл в медленном установки и пипетки крови вдоль стороны трубки очень медленно. Убедитесь, что кровь не смешивается с сахаридом до Centrifugation потому гидрофильный полисахарид является токсичным для клеток и иным образом, выход РВМС будет ниже.
- Образцы крови Центрифуга течение 30 мин при 400 х г при 4 ° С. Если возможно, снизить скорость тормоза центрифуги половине максимума для лучшего разделения после центрифугирования.
- Аспирируйте от плазмы / тромбоцитов фракции пробы крови центрифугируют. Тщательно аспирата от гидрофильных полисахаридных слой непосредственно над упакованного слоя РБК.
- Собирают 8-10 мл эритроцитарной массы и разбавленной 1: 1 с нестерильной 0,9% NaCl раствором.
2. конфокальной микроскопии Оценка гликированного Сгусток сооружения (Имитация Диабетическая сгустки)
- Размораживание фибриноген человека и флуоресцентно меченый конъюгат фибриногена человека при 37 ° С.
- Внесите следующее в 0,5 мл окончил микроцентрифужную трубку.
- Для здоровых, нормальных фибриногена сгустков, смешать фибриноген человека с 10% флуоресцентно-меченного фибриногена человекаконъюгат в 50 мМ Трис / 100 мМ NaCl буфера в концентрации 5 мг / мл.
- Для искусственно гликозилированного фибриногена (для имитации диабетических сгустки), инкубировать фибриноген человека и 10% флуоресцентно меченных фибриногена конъюгата в 5 мМ раствора глюкозы, растворенной в 50 мМ Трис / 100 мМ NaCl в течение результате концентрации 6,8 мг / мл.
- Обложка микро-центрифужные пробирки с помощью непрозрачного материала, чтобы избежать попадания света. Инкубировать пробирки в водяную баню при 37 ° в течение 48 ч.
- Сделайте камеру на предметное стекло микроскопа, путем проставления тонкий клей на 2 сторонах слайда.
- После 48 ч периода инкубации, подготовить реагенты для образования фибрина путем размораживания FXIIIa, альфа тромбина при комнатной температуре.
- Развести FXIIIa 80 ЕД / мл в 5 мМ CaCl 2 буфера.
- Развести тромбина 4 ед / мл в 5 мМ CaCl 2 буфера.
- Для нормальных сгустков, убедитесь, что конечные концентрации фибриногена, FXIIIa, и тромбина до 2,5 мг / мл, 20 ед / мл, и 1 ед / мл, соответственно, при объеме 50 мкл.
- Для гликированного сгустков, гарантировать, что конечные концентрации фибриногена, FXIIIa, и тромбина являются 3,4 мг / мл, 20 ед / мл, и 1 ед / мл, соответственно, при объеме 50 мкл.
- Сразу пипетки 30 мкл раствора фибрина в камере, образованной адгезивом.
- Поместите 22 мм х 22 мм покровным стеклом толщиной 0,15 мм в верхней части 2 слоев клея. Печать открытые стороны с клейкой предотвращения сгусток фибрина от высыхания. Убедитесь, что клей не взаимодействует с фибринового сгустка.
- Дайте сгустков фибрина для полимеризации в 21-23 ° С в течение 2 ч до конфокальной микроскопии.
- Возьмите конфокальной микроскопии изображения тромбов с помощью конфокальной микроскопии с 40X / 1.30 Нефть M27 объектив с 488 нм аргонового лазера.
3. конфокальной микроскопии Оценка сгустков фибрина, содержащих эритроциты от серповидно-клеточная пациентов
- Размораживание фибриноген человека и флуоресцентно меченый конъюгат фибриногена человека при 37 ° С.
- Внесите следующее в 0,5 мл окончил микроцентрифужную трубку.
- Для здорового, нормального фибринового сгустка, смешать фибриноген человека с 10% флуоресцентно меченого конъюгата человеческого фибриногена в 50 мМ Трис / 100 мМ NaCl буфера в концентрации 5 мг / мл.
- Для сгустков, содержащих SCD БС, смешать фибриноген человека и 10% флуоресцентно меченого человеческого фибриногена конъюгата в таких 50 мМ Трис / 100 мМ NaCl, что в результате концентрация фибриногена составляет 10 мг / мл.
- Этикетка изолированных эритроцитов (как нормальные, так и те, у пациентов с серповидно-клеток, полученных из протокола изоляции РБК), используя решение ячейки-маркировки.
- Приостановка клетки при плотности 1 х 10 6 на мл в любой выбранной бессывороточной культуральной среде.
- Добавить 5 мкл / мл клеточной суспензии в клеточной маркировки раствора. Все хорошо перемешать, осторожно пипеткой осторожно.
- Центрифуга меченых подвески труб на 1500 оборотах в минуту в течение 5 мин при 37 ° С.
- Удалить супернатант и мягко повторно приостанавливать клетки в 37 ° C среды.
- Повторите процедуру промывания (3.3.4 и 3.3.5) еще два раза.
- Развести FXIIIa 80 ЕД / мл в 5 мМ CaCl 2 буфера.
- Развести тромбина 4 ед / мл в 5 мМ CaCl 2 буфера.
- Для обычных сгустков, гарантировать, что конечные концентрации фибриногена, FXIIIa, и тромбина в 2,5 мг / мл, 20 ед / мл, и 1 ед / мл, соответственно, при объеме 50 мкл.
- Для сгустков, содержащих SCD БС, обеспечить, чтобы конечные концентрации фибриногена, FXIIIa, и тромбина 5 мг / мл, 20 ед / мл, и 1 ед / мл, соответственно, при объеме 50 мкл.
- Пипетка 10 мкл меченых эритроцитов в растворе фибрина. Пипетка 30 мкл фибрина с БС на предметное стекло (см скользить подготовку к GLycated сгустки).
- Дайте фибрина для полимеризации в 21-23 ° С в течение 2 ч до конфокальной микроскопии.
- Возьмите конфокальной изображения тромбов с помощью конфокальной микроскопии, а также использовать лазеры возбуждения с длинами волн 488 нм и 633 нм для возбуждения флуоресцентно меченный фибрин и эритроциты.
4. конфокальной микроскопии Оценка фибринолиза Цены в гликированного Сгусток структур
- Повторите конфокальной микроскопии протокол гликированного сгустков (Протокол шаг 2) для оценки скорости фибринолиза в гликированными сгустков.
- Не закрывать концы камеры с чистой клея. Дайте сгустков фибрина дл полимеризации в течение 1,5 ч при 21-23 ° С в герметичном корпусе, содержащем 250 мл воды, чтобы предотвратить обезвоживание.
- После полимеризации получить изображения сгустков с помощью конфокальной микроскопии.
- Пипетка плазмина в открытый конец камеры и диспергирования плазмин через сгустка через капиллярного действия.
- Длянормальные и гликированного эксперименты фибринолиза с нормальной концентрацией, пипетки 25 мкл на 200 мкг / мл плазмин в отверстие камеры.
- Для гликированного сгустков с сокращением концентрации, пипетки 25 мкл в 50 мкг / мл в отверстие камеры.
- Используйте функцию временного ряда (рисунок 1) в конфокальной программного обеспечения микроскопа, чтобы захватить видео в реальном времени кадры плазмина лизирующим сгусток.
- Нажмите режиме сбора, а затем выберите "временных рядов." Выберите количество циклов и интервал времени записи.
5. Расчет фибринолиза цены
- Определить скорость лизиса, установив область (2500 мкм 2) и расчета прошедшее время, необходимое для растворения фиксированные области сгустка. Рассчитайте коэффициент лизиса, используя следующее уравнение (рисунок 2):
6. Статистический анализ фибринолиза Цены
- Анализ данных лизиса с помощью программного обеспечения статистического анализа. Выполните одну сторону ANOVA и пост специальную Тьюки-Крамера теста 44,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конфокальной микроскопии анализ гликозилированного фибринового сгустка структур
В конфокальной микроскопии изображения нормальных и гликозилированного сгустков представлены на фиг.3. Конфокальной микроскопии анализ нормальных и гликозилированного сгустков показывает, что гликозилированного сгустки плотнее с меньшими порами, чем нормальный сгустков с и без добавления FXIIIa во сгустка полимеризации. На фиг.3А и 3В, есть более низкая концентрация фибрина, который создал менее плотную структуру, чем гликированного сгустков с более высокой концентрацией фибрина (рис 3С и 3D).
Большая плотность наблюдается (количество волокон на единицу площади) в гликированными сгустков результате увеличения концентрации фибриногена, что происходит у людей с диабетом. В нормальных сгустков, фибрина волокна были более линейна и формируется более длинные волокна при полимеризации с FXIIIa, которыйвероятно результат FXIIIa образовывать поперечные связи между волокнами. В случае гликозилированного сгустков, волокна оказались короче, даже с добавлением FXIIIa. Это, вероятно, является результатом процесса полимеризации, что было изменено в связи с наличием гликированного областей на молекуле фибриногена. Кроме того, из анализа рис 3, то, скорее всего, в том, что толщина волокна также была снижена в результате гликозилирования, которая, вероятно, почему флуоресценции от гликированного волокон по-видимому, имеют более низкую интенсивность.
Конфокальной микроскопии Анализ сгустков фибрина, содержащих эритроциты от серповидно-клеточная пациентов
Конфокальной микроскопии изображения сгусток фибрина структуры сгустков с нормальной и эритроцитов у пациентов с серповидно-клеточных представлены на рисунке 4. Как и предсказывалось, софокусные образы сгустков фибрина, содержащих эритроциты у пациентов с серповидно-клеточных было более плотные структуры, чем у здоровых фибрина смного. 4А показывает равномерное распределение фибрина и нормальных эритроцитов. Тем не менее, на рисунке 4В есть сгустки фибрина и пустот, где нет фибрина сеть не сформирована. Эритроцитов у пациентов с серповидно-клеточных не равномерно рассеяны, а были включены в фибрин сгустки. Увеличение плотности (количество волокон на единицу площади) было результатом повышенной концентрации фибриногена, которое происходит в результате гиперкоагуляции у больных SCD. Кроме того, естественная тенденция эритроцитов у пациентов с серповидно-клеточных образовывать агрегаты породили сгустки эритроцитов, которые стали вплетены в фибрин сети. Это привело к образованию аберрантных сгусток структур, которые значительно отличаются по морфологии, чем в нормальных пациентов. Из фиг.4В, следует отметить, что эритроциты от пациентов серповидно-клеточная вызвало большую неоднородность в образце фибрина, а также вызвало широкое пространственное распределение эритроцитов в образце фибрина, при комсравнению со здоровыми сгустков фибрина с нормальными эритроцитами. В отличие от этого, здоровые сгустков фибрина с нормальных эритроцитов отображается более однородную дисперсию по всей клеток фибрина сети.
Пока неизвестно, сколько HbS (серп гемоглобина) полимеризовали в эритроцитах у пациентов с серповидно-клеточных и содержится в образцах. Известно, однако, является то, что наличие любого количества HbS вызывает большую агрегацию клеток в количестве молекул HbS в единице объема против обычных молекул HbA. Пан и др. 46 показали этот феномен в кабинете, где они по сравнению агрегации / кластеризации эффекты дезокси-HBs, и, для сравнения, кислородно-HBs и кислородно-нормального взрослого гемоглобина, HbA. Кластеры образуются в течение нескольких секунд после приготовления раствора и их размеры и количество остается относительно стабильной до 3 часов. Один из выводов исследования было то, что оба окси-HBs и дезокси-HBs молекулы группируются в более высокий номер денплотность, чем окси HBA-(нормальных) молекул, как функции от температуры. Относится к текущему исследованию, это означает, что эритроциты у пациентов с серповидно-клеточных, скорее всего кластера вместе, и в ловушке фибрин, как это было полимеризоваться с фибриногена предшественника.
Конфокальной микроскопии Lysis Оценить анализ нормальных и гликированного сгустков
Было высказано предположение, что темпы фибринолиза будет больше для нормальных сгустков фибрина по сравнению с гликированного сгустков фибрина с уменьшением концентрации плазмина. Чтобы проверить эту гипотезу, конфокальной микроскопии был использован для оценки скорости лизиса сгустков фибрина с добавлением плазмина. Средняя (средний) лизиса нормальной скорости фибрина с добавлением 200 мкг / мл плазмин был 43,2 ± 26,5 мкм 2 / с, а средние (средний) темпы лизиса фибрина гликозилированного с добавлением 200 мкг / мл плазмин был 29,7 ± 11,2 мкм 2 / с. Для гликированного фибринового сгустка лизированных с50 мкг / мл плазмин, средняя скорость лизиса 12,8 ± 3,1 мкм 2 / SE. Всего 10 образцов каждый (30 образцов) были использованы для определения средних и стандартных значений отклонения. Эти значения представлены на фиг.5. Р-величина 0,05 был использован для определения значения между независимых экспериментальных группах. Анализ скоростей фибринолиза показали, что значение для нормальных сгустков по сравнению с гликированного (моделируемых диабетом) сгустков плазмина с уменьшением значительно отличались.
Рисунок Скриншот 1. Пример из конфокальной программного обеспечения микроскопа способ получения в режиме реального времени, подробно, непрерывная визуализация фибрина тромба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию Тхис Рис.
Рисунок 2. Пример конфокальной изображение с фиксированной площади, используемой для расчета скорости лизиса образца фибринового сгустка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Конфокальные изображения здоровых и гликированного (диабетическая) сгустков фибрина. Зеленый флуоресцентный представляет собой фибрин сети. Unglycated фибрина представляет сгустки образуются в здоровых пациентов, в то время как гликозилированного фибрина представляет сгустки, образованные у больных сахарным диабетом. (А) Unglycated фибрина без добавления FXIIIa. (B) Unglycated фибрина с FXIIIa. (C (D) гликированного фибрина с FXIIIa. Бар красный шкала показывает 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Конфокальные изображения здоровых сгустков фибрина с нормальными эритроцитов и фибрина сгустки с БС у пациентов с серповидно-клеток. Зеленый флуоресцентный представляет собой фибрин сети и пурпурный представляет помечены здоровым и эритроциты у пациентов с серповидно-клеток. (А) Здоровые эритроциты в нормальной концентрации фибрина с FXIIIa и (б) Увеличение фибрина с FXIIIa и эритроцитов из серпа пациента клеток. Масштабная линейка Белый цвет означает 50 мкм. Белые круги в изображении (B) указывают узнаваемые sickled эритроцитов. 
Рисунок 5. фибринолиза ставки нормальных сгустков фибрина по сравнению с гликированного (диабетическая) сгустков фибрина и гликированного сгустков с пониженной концентрацией плазмина. Статистическая значимость была определена на основании односторонней ANOVA и постфактум Тьюки-Крамера теста множественного сравнения. Анализ ANOVA показали, что существует значительная разница между средствами скорости лизиса. Тест Тьюки-Крамера показали, что существует значительная разница в средствах между нормальным комков и сгустков с пониженным плазмина с А. П. <0,05. * Указывает на существенное отличие от нормальных сгустков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы получить значимые данные о структуре свертывания механизмов болезненных состояний, важно, чтобы изолировать факторы, участвующие в процессе свертывания, чтобы определить эффекты белков и клеток в этих условиях. Этот протокол был разработан в целях изучения структуры фибринового сгустка у больных сахарным диабетом и SCD государств в пробирке.
Это необходимо понять механизмы, участвующие в формировании фибрина и фибринолиза в болезненных состояний, так как измененные условия вызывают гиперкоагуляция, атеротромбоза и ССЗ. С конфокальных изображений, полученных в этом эксперименте, очевидно, что гиперкоагуляция активность наблюдается в диабетических и SCD состояний, что вызывает повышение концентрации фибриногена. Повышенный результаты концентрации фибриногена в плотной фибрина сети с более точек ветвления и более мелких пор по всей сети. В фибрина сетей пациентов SCD, не только есть еще фибрина присутствует, буТл, объединяющий характер эритроцитов у больных с серповидно-клеточных также изменяет структуру сети, как это захватывает фибрин в кластеры. Конгломерат эритроцитов у пациентов с серповидно-клеточной также уменьшает пористость фибриновых кластеров в сети, но по-видимому, увеличивают концентрацию пустот в общую сеть. Результаты фибринолиза анализа гликированного сгустков в пользу гипотезы о скорости лизиса в гликированными сгустков оказались ниже, с уменьшенным плазмин, чем у здоровых, нормальных сгустков. Тем не менее, результаты не обеспечивают убедительных доказательств о лизиса ставок гликированного сгустков с нормальной концентрацией плазмина. Таким образом, можно сделать вывод, что для пациентов, страдающих диабетом с нормальной концентрации плазмина, могут быть достаточно фибринолиза активность деградировать сгустки фибрина в эффективным образом.
Для экспериментов, проведенных в этом исследовании, были использованы отдельные белки и эритроциты, вместо цельной крови и плазмы. При использованииРазделенные белки синтезировать сгустки фибрина, причины для измененных структур между нормальным против больных сгустков могут быть определены. Это значительно уменьшило возможность иметь другие белки плазмы вмешиваться в структуре и морфологии сгустков фибрина. Однако, используя отдельные белки, важно, чтобы хранить и обрабатывать клетки и белки правильно, так как они более уязвимы к гибели клеток и деградации белка.
Конфокальной микроскопии методом визуализации выбран для этого исследования было связано с возможностью получения изображений фибриновый сгусток структур при сохранении природных тромботических свойства клеток и белков. Конфокальной микроскопии Также было показано, чтобы дать улучшенную контрастность и оптическое разрешение образца с низким уровнем шумов по сравнению с традиционной светлой микроскопии. Лазерный луч направляется в том, что блоки отверстием сфокусировано света от входа. Использование конфокальной микроскопии отпала необходимостьДобавление фиксирующие химических веществ; Таким образом, клетки и белки смогли сохранить свою природную протеиновую активность формирования фибрина сгустки. В результате клетки, белки и ферменты функционируют в родном государстве, что позволяет использовать конфокальной микроскопии для захвата изображений и видео в реальном масштабе времени. С конфокальной микроскопии, 3D изображения фибриновых сгустков были захвачены и видео плазмина пищеварения сгустков фибрина были получены в режиме реального времени. При добавлении плазмина в сгусток, чтобы захватить временных рядов видео процесса лизиса сгустка, это было важно использовать капиллярное действие с помощью плазмина, чтобы равномерно рассеять фермент через фибрина матрицы. Это было сделано для того, чтобы концентрации добавленного плазмина была точной и давали фермент лизировать весь сгусток, в отличие от локальной области, что плазмин был добавлен.
Метод и результаты, полученные в этом исследовании, были похожи на исследовании, проведенном Данн и др, который обнаружил, что лизис сгусткаставки были значительно ниже у пациентов с диабетом, чем у контрольных испытуемых 25. В обоих исследованиях, были существенные различия в лизисном ставок диабетом (гликированного) сгустков; Однако, текущая протокол может точно представлять диабетические состояния из-за снижения уровня плазмина. Кроме того, в данном исследовании фибринолиза был захвачен непрерывно в режиме реального времени с использованием конфокальной микроскопии, в отличие от анализа отдельных разделов с различными интервалами времени. Wooton и др. 47 исследовали фибрина лизис сгустка, а численность лизис скорости фронта (см / с), чтобы исследовать скорость лизиса сгустков. Они использовали конфокальной анализ изображения в своем исследовании для определения скорости фронта. В текущем исследовании, вместо лизис скорости фронта, был использован скорость лизиса площадь (из-за способа изображения анализировали на конфокальной). Для дальнейшей проверки метода, разработанного в нашем исследовании, авторы 48 описали математическую модель фибриновый сгусток лизиса путем плазмина, в котором они предписывают лизис переднюю скорость в зависимости от эффективной константы скорости фибринолиза. Уравнение задается как: 
Вот, 
представляет собой эффективную константу скорости фибринолиза, K является постоянной адсорбции, C вечера является концентрация плазмина и ρ Fn является плотность фибрина. Если измеряемой величины 
(Измеряется от конфокального анализа в данном исследовании) используется и правило цепи используют, это приводит к: 
Таким образом, эффективная константа скорости фибринолиза для эксперимента приводит к: 
Это соотношение делает вывод, что эффективная константа скорости фибринолиза ( 
) Является функцией концентрации плазмина (С вечера) и скорости лизиса области 
,
Этот метод также имеет важное значение для изучения тромбозаПациентов SCD, так как мало известно о фибрина и механизмов свертывания крови по отношению к этой болезни. Там было очень мало исследований, проведенных по вопросу о последствиях SCD о структуре фибриновых сгустков; Таким образом, софокусные изображения, собранные от этого исследования содержит редкую визуализацию структуры сгустка со встроенным sickled эритроцитов.
Для сравнения различий в средствах между группами, использовать одностороннюю ANOVA и пост специальную Тьюки-Крамера тест. В одну сторону ANOVA является статистический тест используется для определения статистически значимой разницы в помощи между независимыми группами. После теста Тьюки-Крамера используется, чтобы сравнить средства от каждой независимой группы и определить, какие средства групп статистически отличаются друг от друга. Перед выполнением односторонний ANOVA, есть шесть предположения, которые должны быть соблюдены, чтобы убедиться, что результаты являются действительными. Шесть предположения: непрерывная переменная (скорость лизиса) зависит, независимая ВаряBLE, состоящая из двух или более независимыми категорных групп (нормальный, гликозилированного и гликозилированного с пониженным плазмин), и независимо наблюдаемых данных в каждой группе таким образом, что одно событие происходит не влияет другое событие (Это гарантирует, что нет перекрытия в данных.) , набор данных, не содержащий каких-либо существенных выбросов, как правило, распределяются данные сверены с помощью тестов Шапиро-Wilk, и однородность дисперсий в данных, подтвержденных статистических испытаний Левин. После того, как эти предположения оправдались, в одну сторону ANOVA и постфактум Тьюки-Крамера тест проводили с использованием р-значения 0,05 в качестве порогового значения для определения статистической значимости. Для строгого детали с односторонним ANOVA и пост-специальной Тьюки-Крамера теста, обратитесь к 44,45.
В целом, этот метод позволяет для работы с изображениями нормальных и аномальных (из-за больных состояний) сгустков фибрина в их собственных государств. Способ также содержит подробную информацию в режиме реального времени визуализации лизис сгустка, а такжев статистическом анализе ставок лизиса. Легкость, с которой тромб может быть произведено и отображается в пробирке полезна для широкого круга применений в клеточной и тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 ml graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
- Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).
