对于检查纤维蛋白凝块结构在正常和疾病状态的实验和成像技术

Introduction

伤到血管的内皮细胞衬里穿过止血反应，或血液凝块的形成修复。当血液渗透到细胞外基质，组织因子激活在血流中血小板，以促进凝血级联的引发。这个愈合过程中的关键机械部件是纤维蛋白基质中，血纤维蛋白纤维是高弹性的组成，并可以承受较大的力^1-4。许多研究人员广泛，在过去几十年的研究^5-13形成结构纤维蛋白和功能。

患者的疾病，如糖 ​​尿病和镰状细胞具有显影血栓性并发症，如心肌梗塞，缺血性心脏疾病的危险性增加，和笔画^14-19。超过200万人新近每年在美国诊断为糖尿病。有两种类型的糖尿病：I型，其中身体不能产生胰岛素，和II型，其中身体变得耐胰岛素的足量的。糖尿病患者中，心血管疾病（CVD）是原因的80％与疾病^20,21相关的发病率和死亡率的。

镰状细胞病（SCD）是一种遗传性血液疾病，影响超过10万人在美国^22。 SCD是一个点突变的疾病，导致红血细胞成为月牙形，使其难以使细胞通过血液脉管系统^23。这两种疾病状态增加显影在体内动脉粥样硬化病症的几率。其中的一个原因为，这是改变的血纤维蛋白的结构和功能在疾病状态^14,24-26的结果。

在糖尿病和镰状细胞病，有高凝和诱导动脉粥样硬化和心血管疾病的低纤溶活性（℃VD）相比，患者的健康^17,27,28。已知的是低纤溶促进动脉粥样硬化的进展和滋生患者过早冠状动脉疾病²⁹复发缺血事件。在当前的手稿，我们研究在这个特定设置中的血纤维蛋白的​​物理性质的作用。纤维蛋白凝块的结构在非患病患者是由细纤维，毛孔变大，并且通常较少稠密^14,24的。在健康患者增加的孔隙率和密度较小的纤维蛋白凝块已发现，以促进纤维蛋白溶解^16。在hyperthrombotic条件如糖尿病和镰状细胞病，有一个增加纤维蛋白原的生产，导致纤维蛋白原浓度从2.5毫克/毫升的正常水平在健康患者^30-33增加。形成在糖尿病患者的血纤维蛋白凝块已被发现是不太多孔的，更硬，有更多的分支点，并且较密时相比健康的，非直径betic患者^{14,24,33-35。}改变的血纤维蛋白结构是发生在涉及凝块形成的蛋白质糖基化机制的结果。当葡萄糖分子结合，以赖氨酸残基上的纤维蛋白原分子，其抑制从适当交联的谷氨酰胺和赖氨酸残基^33,36,37人类XIIIa因子（FXIIIA）发生非酶（不可逆的）糖基化。

血纤维蛋白网的结构分析已被广泛研究最近。特别是，研究人员利用电子显微镜和三维重建纤维网^38，这两个调查血管（内皮细胞）细胞和血管外（成纤维细胞和平滑肌细胞）如何影响纤维蛋白结构^39，利用粘弹性和频谱分析来分析纤维结构^40，和使用纤维蛋白的结构和机械性能之间发达的相关性的实验和计算方法⁴¹ 体外纤维蛋白原糖化。为了模拟镰状细胞病凝血条件，增加纤维蛋白原浓度与从患者收集以前我们组做⁴²镰状细胞比容。这些方法被用来研究的结构和病变的条件下参与纤维蛋白凝块形成和纤维蛋白溶解功能，以及诱导CVD法的机制。基于关于这些疾病的最新信息，糖化血纤维蛋白凝块的结构是致密的具有较少一第二毛孔变小。纤维蛋白凝块与红血细胞从镰状细胞的患者（红细胞）也更致密并显示在红细胞的聚集和凝聚的纤维蛋白簇。这是一个公认的现象，即先前已⁴³确定。也有人推测，纤维蛋白溶解率会在糖化血纤蛋白凝块有和没有减少纤溶酶相比健康，正常的血纤维蛋白显著降低。结果表明，对于糖化血纤维蛋白凝块，显著不同的裂解率的结果，观察只减少纤溶酶浓度的条件下进行。使用共焦显微镜的这种实验技术提供显著优于其它成像方法，因为细胞和蛋白质保持在它们的天然状态，这使的凝血活性的实时视频捕捉。合成诱导凝血的这种方法也更便宜，更有效的时间比获得患者样品并过滤掉个别蛋白质和酶。此外，通过使用分离的蛋白质和酶的合成凝块，该凝块被标准化，以便有没有样品之间的变异如在血浆中的其它蛋白质的结果。

Protocol

注：以下协议遵循由机构审查委员会（IRB）在佐治亚理工学院设置指引。

1.采血车和红血细胞分离过程

1. 收集40-120毫升血液捐赠者在10毫升肝素真空采血管。 4小时内收集的开始PBMC（外周血单核细胞）分离。在这段时间内，保持血液在RT。
   注：O / N储存血RT还是在4℃下不建议，因为这将导致较低的PBMC产量。
2. 在冰冷的（4℃）无菌PBS 1：稀释全血1。
3. 移取10毫升的冰冷的亲水性多糖的到一个空的，无菌的50ml锥形管中。轻轻转移的亲水性多糖顶部稀释全血。
4. 用25毫升移液管在缓凝和吸管血液沿管的侧面非常缓慢。保证血液不与以CENTRI之前糖混合fugation因为亲水性多糖是有毒的细胞和否则，PBMC收率将会更低。
5. 离心血液样品30分钟，在400×g离心在4℃下。如果有的话，减少离心机的制动速度的一半最大的用于离心后更好的分离。
6. 抽吸掉离心血样的血浆/血小板组分。小心吸脱亲水性多糖层填充红细胞层的正上方。
7. 收集8-10毫升填充红细胞和稀释1：1与未消毒0.9％NaCl的盐水。

糖化共聚焦显微镜评价2.血块结构（模拟糖尿病凝块）

1. 除霜人纤维蛋白原和荧光标记的人纤维蛋白原结合物在37℃。
2. 吸取以下到0.5毫升刻度离心管中。
   1. 对于健康的，正常的纤维蛋白原血栓，混合人纤维蛋白原与10％的荧光标记的人纤维蛋白原缀合物在50mM的Tris / 100mM NaCl的缓冲液以5毫克/毫升的浓度。
   2. 对于人工糖化血纤维蛋白原（以模拟糖尿病凝块），孵育人纤维蛋白原和10％荧光标记的纤维蛋白原结合物中的葡萄糖溶解在50mM Tris / 100mM NaCl的要得到的6.8毫克/毫升浓度5mM溶液。
3. 盖采用不透明的材料，以避免暴露在光线下微离心管。孵育在37℃的水浴的管子48小时。
4. 使在玻璃显微镜载片的腔室由固定用的薄粘合剂在滑动的2边。
5. 在48小时温育期后，通过除霜FXIIIA和人α-凝血酶在RT制备试剂的血纤维蛋白的​​形成。
6. 稀释FXIIIA 80 U / ml的5毫米氯化钙₂缓冲区。
7. 凝血酶稀释到4 U / ml于5毫米氯化钙₂缓冲区。
   1. 对于正常的凝块，确保最终的浓度纤维蛋白原，FXIIIA和凝血酶是2.5米微克/毫升，20单位/毫升，和1单位/毫升，分别以50微升的体积。
   2. 为糖化凝块，确保最终的浓度纤维蛋白原，FXIIIA和凝血酶的是3.4毫克/毫升，20单位/毫升，和1单位/毫升，分别以50微升的体积。
8. 立即吸取30微升的血纤维蛋白溶液到由粘合剂形成的腔室。
9. 放置22毫米×22毫米的玻璃盖玻片为0.15毫米的2层的粘合剂的顶部的厚度。密封该开口侧用透明的粘合剂，以防止纤维蛋白凝块干燥。确保该粘合剂不与血纤蛋白凝块交互。
10. 允许纤维蛋白凝块聚合在21-23℃下进行共焦成像前2小时。
11. 采取利用共聚焦显微镜用40X / 1.30石油M27镜头采用了488纳米氩激光的凝块共聚焦显微镜图像。

纤维蛋白凝块的镰状细胞患者红细胞含有3.共聚焦显微镜评价

1. 除霜人纤维蛋白原和荧光标记的人纤维蛋白原结合物在37℃。
2. 吸取以下到0.5毫升刻度离心管中。
   1. 为健康，正常的血纤维蛋白凝块，混合人纤维蛋白原与在50mM的Tris / 100mM NaCl的缓冲液的10％荧光标记的人纤维蛋白原结合物以5毫克/毫升的浓度。
   2. 为含有红细胞的SCD的凝块，混合人纤维蛋白原和10％的荧光标记的人纤维蛋白原结合物在50mM的Tris / 100mM NaCl的，​​使得所得的纤维蛋白原的浓度为10毫克/毫升。
3. 标签使用细胞标记溶液的分离的红细胞（正常的和那些从红细胞分离协议获得镰状细胞的患者）。
   1. 暂停细胞以1×10 ⁶每毫升中任何选择的无血清培养基中的密度。
   2. 添加5微升/毫升的细胞悬浮液至细胞标记溶液。轻柔吹打拌匀平缓。
   3. 离心标记悬浮液的管在1,500rpm离心5分钟，在37℃。
   4. 除去上清液，并轻轻重悬浮细胞在37℃的介质。
   5. 重复清洗过程（3.3.4和3.3.5）两次以上。
4. 稀释FXIIIA 80 U / ml的5毫米氯化钙₂缓冲区。
5. 凝血酶稀释到4 U / ml于5毫米氯化钙₂缓冲区。
   1. 对于正常的凝块，确保最终的浓度纤维蛋白原，FXIIIA和凝血酶的是2.5毫克/毫升，20单位/毫升，和1单位/毫升，分别以50微升的体积。
   2. 为含有红细胞的SCD的凝块，确保最终的浓度纤维蛋白原，FXIIIA和凝血酶的是5毫克/毫升，20单位/毫升，和1单位/毫升，分别以50微升的体积。
6. 吸管将10μl标记的RBCs入血纤维蛋白溶液。吸管30微升与红细胞上的显微镜玻璃纤维蛋白（参照滑动准备GLycated血块）。
7. 允许纤维蛋白聚合，在21-23℃下进行共焦成像前2小时。
8. 取使用共焦显微镜的凝块的共聚焦图像，并利用激发激光器的488纳米和633纳米的波长，以激发荧光标记的血纤维蛋白和红细胞。

纤溶价格在糖化血块结构4.共聚焦显微镜评价

1. 重复糖化血凝块（协议第2步）在糖化血栓纤维蛋白溶解率评价的共聚焦显微镜协议。
2. 不要封明确胶粘剂室的两端。允许纤维蛋白凝块聚合1.5小时，在21-23℃下在含有250ml水，以防止脱水密封外壳。
3. 聚合后，获得使用共焦显微镜的凝块的图像。
4. 吸管纤溶酶到腔室的开口端，并通过经由毛细管作用凝块分散纤溶酶。
   1. 为正常和糖化纤溶实验正常浓度，吸管25微升在纤溶酶200微克/毫升到腔室的开口。
   2. 为糖化凝块具有减小浓度，吸管25微升，在50微克/毫升到腔室的开口。
5. 使用共焦显微镜软件时间序列的特征（ 见图1）捕获的纤维蛋白溶酶裂解凝血块的实时录像。
   1. 点击捕获模式，然后选择“时间序列”。选择周期的数量和记录时间间隔。

5.计算纤溶价格

1. 通过设置的区域（2500微米^2），并计算溶解血栓的一个固定区域所需的经过时间确定裂解速率。计算使用下面的等式（ 图2）的裂解速率：
   

价格纤溶6.统计分析

1. 分析使用统计分析软件裂解的数据。执行单向ANOVA和事后杜克-克莱默试验^44,45。

Representative Results

糖化纤维蛋白凝块结构共聚焦显微镜分析

的正常和糖化凝块的共焦显微镜图像示于图3中 。在正常和糖化凝块的共聚焦显微镜分析表明，糖化血块与较小孔隙比正常凝块都具有和不具有凝块聚合过程中加入FXIIIA的致密。在图3A和3B中 ，存在其中在一个不太致密的结构比糖化凝块具有较高的血纤维蛋白浓度（ 图3C和3D）的下纤维蛋白浓度。

在糖化凝块越大密度观察（每单位面积的纤维的根数）是一种发生在糖尿病患者中增加的纤维蛋白原浓度的结果。在正常的凝块，血纤维蛋白纤维是更线性和聚合时用FXIIIA，形成长纤维的是有可能的FXIIIA形成纤维间的交联的结果。在糖化凝块的情况下，纤维似乎是更短，即使附加FXIIIA的。这是可能的改变引起的糖化区域上的纤维蛋白原分子的存在下聚合过程的结果。另外，从分析图3中 ，它很可能是该纤维的厚度也减少为糖化的结果，这可能是为什么从糖化纤维的荧光似乎具有较低的强度。

纤维蛋白凝块的镰状细胞患者含红细胞的共焦显微镜分析

与正常凝块和红细胞从镰状细胞的患者的血纤维蛋白凝块结构的共焦显微镜图像示于图4中 ，作为预测的，含有选自镰状细胞的患者的红细胞的血纤维蛋白凝块的共焦图象有更致密结构比那些健康的血纤维蛋白Ç拍。 图4A示出了纤维蛋白和正常红细胞的均匀分布。然而，在图4B中有在没有血纤维蛋白网形成纤维蛋白和空隙的团块。从镰状细胞的患者的红细胞没有均匀地分散，而是包埋于纤维蛋白团块。增加的密度（每单位面积的纤维的根数）为发生如高凝在SCD患者的结果增加的纤维蛋白原浓度的结果。此外，从镰状细胞的患者的红细胞的自然趋势，以形成聚集体主义及其，成为交织成的纤维蛋白网状红细胞的团块。这导致异常凝块结构，是在形态比正常患者明显不同的形成。从图4B中 ，可以观察到，从镰状细胞的患者的红细胞的血纤维蛋白样品中造成更大的异质性，也导致红细胞的血纤维蛋白样品，在更广阔的空间分布时COM相比于健康的纤维蛋白凝块正常的红细胞。与此相反，在健康的血纤维蛋白凝块与正常红细胞显示细胞的更均匀的分散在整个纤维蛋白网状。

它是未知的多的HbS（镰刀血红蛋白）如何的聚合从镰状细胞的患者的红细胞和被包含在样品中。什么是已知的，但是，是对的HbS任何量的存在导致细胞的每单位体积的HbS分子与正常的HbA分子数更大的聚集。 Pan 等人⁴⁶已经证明这种现象在一项研究中，他们比较脱氧HBS的聚合/聚类效果，并且，为了比较，氧的HbS及氧-正常成人血红蛋白，糖化的。溶液的制备和它们的大小和数量后几秒钟内形成的簇保持相对稳定长达3小时。一个从研究的结论是，这两个氧哈佛商学院和脱氧哈佛商学院的分子聚集在一个较大的数字书房sity比氧的HbA（正常）分子作为温度的函数。关于目前的研究，这意味着，从镰状细胞的患者的红细胞有可能聚集在一起，并捕获纤维蛋白，因为它是被从纤维蛋白原的前体聚合。

正常和糖化凝块共聚焦显微镜裂解率分析

据推测，所述纤维蛋白溶解率将是更大的对于正常的血纤维蛋白凝块相比糖化血纤维蛋白凝块具有降低纤溶酶的浓度。为了检验这一假设，共聚焦显微镜来评估纤维蛋白凝块的溶解率在添加纤溶酶。平均（平均值）用加入了纤溶酶200微克/毫升正常的血纤维蛋白的溶解率是43.2±26.5微米² /秒，平均（均值）裂解糖化血纤维蛋白的速率通过添加纤溶酶200微克/毫升29.7±11.2微米² /秒。对于糖化纤维蛋白凝块溶解与纤溶酶50微克/毫升，平均裂解率为12.8±3.1微米² /本身。共有各（30个样品）10个样品用于测定的平均值和标准偏差值。这些值在图5中给出。0.05的p值被用来确定独立的实验组之间的显着性。的纤维蛋白溶解率分析表明，对于正常的血块的值相比，所述糖基（模拟糖尿病）凝块具有降低血纤维蛋白溶均显著不同。

从共聚焦显微镜的软件，详细方法获得的实时图1.样本截图，纤维蛋白凝块溶解的连续影像。 请点击此处查看THI的放大版本。的身影。

图2.示例与用于计算纤维蛋白凝块样品溶解率固定区域共聚焦图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。的健康和糖化（糖尿病）的血纤维蛋白凝块共聚焦图像。绿色荧光代表的纤维蛋白网状。所述unglycated纤维蛋白表示形成在健康患者血栓，而糖化血纤维蛋白表示形成在糖尿病患者中的血块。 （A）不加FXIIIA的Unglycated纤维蛋白。 （B）Unglycated纤维蛋白与FXIIIA。 （C （D）纤维蛋白糖化与FXIIIA。红色的比例尺为50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图健康纤维蛋白凝块与正常红细胞和纤维蛋白凝块与镰状细胞贫血患者的红细胞4.共聚焦图像。绿色荧光代表的纤维蛋白网络和品红色标记代表健康的红细胞，从镰状细胞贫血患者。 （A）在正常纤维蛋白浓度FXIIIA和（B）增加纤维蛋白与FXIIIA和红细胞从镰状细胞贫血患者的健康的红细胞。白色的比例尺为50微米。白色圆圈图像（B）表示辨认镰状红细胞。

图的正常的血纤维蛋白凝块5.纤溶率相比糖化（糖尿病）的纤维蛋白凝块和糖化凝块具有减少纤溶酶的浓度。统计意义的基础上的单向ANOVA和事后杜克-克莱默多重比较试验来确定。方差分析表明，存在的裂解速率装置之间的显著差异。在图基 - 克莱默测试表明，在正常的血块和血块与减少纤溶酶与AP <0.05之间装置的显著差异。 *表示与正常凝块一个显著差异。

Discussion

以获得有关的疾病状态的凝血机制结构有意义的数据，以隔离参与凝血，以确定在这些条件下，蛋白质和细胞的效应的因素是很重要的。这个协议是用于在体外研究了血纤维蛋白凝块的结构在糖尿病和SCD状态的目的而开发的。

有必要了解涉及纤维蛋白形成和纤维蛋白溶解中的疾病状态，因为改变的条件下会引起高凝，动脉粥样硬化，和CVD的机制。从本实验所得到的共焦图像，显而易见的是，高凝活动发生在糖尿病和SCD的状态，这会导致纤维蛋白原浓度的增加。增加的纤维蛋白原浓度的结果在一个致密的纤维蛋白网络与多个分支点和较小的孔在整个网络。在SCD患者的纤维蛋白网络，不仅有更多的纤维蛋白目前，卜吨从镰状细胞的患者也改变了网络的结构，因为它俘获纤维蛋白成簇红细胞的聚集性质。从镰状细胞的患者的红细胞的聚集也减少了纤维蛋白簇在网络中的孔隙率，但似乎增加了总的网络中空隙的浓度。糖化凝块的纤维蛋白溶解分析的结果所支持的裂解速率糖化血块是低级具有比健康，正常凝块减少纤溶酶的假说​​。然而，结果并没有提供有关糖化与血栓纤维蛋白溶酶的正常浓度的溶解率的确凿证据。由此可以得出结论，对于糖尿病患者的正常纤溶酶浓度，可以存在足够纤溶活性降解纤维蛋白凝块以有效的方式。

在此研究中进行的实验，分离的蛋白质和红细胞来代替全血和血浆。通过使用分离的蛋白，合成的纤维蛋白凝块，其原因为正常之间改变的结构与患病凝块可确定。这大大降低了具有其它血浆蛋白干扰血纤维蛋白凝块的结构和形态学的可能性。然而，通过使用分离的蛋白质，这是至关重要的，以存储和妥善处理的细胞和蛋白质，因为它们更容易受到细胞死亡和蛋白质降解。

本研究选择的共焦显微镜的成像技术，是由于在保持细胞和蛋白质的天然血栓性质，得到的纤维蛋白凝块的结构的图像的能力。共焦显微镜也已经显示，得到改善的对比度和降低的噪声比传统的光显微术检体的光学拆分。该激光从进入引导到针孔，阻止未聚焦的光。共焦显微镜的利用率免除了对另外的固定剂的化学物质;因此细胞和蛋白质能够维持成形的纤维蛋白凝块的天然蛋白质的活性。其结果是，细胞，蛋白质，和酶发挥作用在其天然状态，允许使用共聚焦显微镜的用于捕获实时活动的图像和视频。用共焦显微镜，在纤维蛋白凝块的三维图像被捕获和纤维蛋白凝块的纤维蛋白溶酶消化的视频进行实时获得的。当添加纤溶酶对血块捕捉凝块溶解过程的时间序列的视频，为使用毛细管作用通过纤溶酶通过血纤蛋白基质，以均匀地分散酶是重要的。这样做是为了确保在添加纤溶酶浓度为准确，并允许所述酶裂解整个凝块，而相比之下，该纤溶酶溶液中加入该地区。

的方法和在本研究中得到的结果是类似于由Dunn 等人 ，谁发现凝块溶解做了研究率分别比对照组²⁵糖尿病患者显著降低。在两项研究中，有对糖尿病（糖化）凝块溶解率显著的差异;然而，目前的协议可以精确地表示，因为减少纤溶酶水平的糖尿病状态。另外，在此研究纤溶连续实时使用共焦显微镜，在对比分析离散部分在不同的时间间隔捕获。伍顿等人 ⁴⁷已经调查纤维蛋白凝块溶解并使用的裂解前速度（厘米/秒），以调查裂解为凝块的速率。他们利用共聚焦图像分析在他们的研究，以确定前的速度。代替裂解前速度在目前的研究中，一个裂解区速度，使用（因为图像上的共聚焦分析的方式）。为了进一步验证我们的研究中开发的方法，在⁴⁸中的作者描述的数学模型纤维蛋白凝块溶解由纤维蛋白溶酶，在其规定的溶解速度前作为纤维蛋白溶解的有效速率常数的功能。的方程给定为：

这里， 表示纤溶的有效速率常数K _a是吸附常数，C _点是纤溶酶浓度_，ρFN是纤维蛋白的密度。如果测得的量 （从在当前的研究中的共焦分析测定）利用和链规则的情况下，这将导致：

T“>假设只有一个维度每单位时间的变化会导致：

因而纤溶用于实验的有效速率常数导致：

这种关系推断纤维蛋白溶解，有效速率常数（ ）为纤溶酶浓度（C _点 ）和区域裂解速率的函数 。

这种技术也用于血栓形成研究中的重要SCD的患者，因为很少有知道关于血纤维蛋白和凝血机制相对于这种疾病。目前已经对SCD对纤维蛋白凝块结构的影响进行了很少的研究;因此，这项研究收集到的共聚焦图像提供了血块结构与整合镰状红细胞罕见的可视化。

为了比较，在群体之间装置的差异，使用单向ANOVA和事后杜克-克莱默测试。单向方差是用于确定在独立组之间的装置的统计学显著差的统计检验。在杜克-克莱默后试验用于比较来自各组独立的手段，并确定哪些组的装置是彼此统计学差异。之前执行一单向ANOVA，存在必须得到满足，以确保该结果是有效的6假设。六个假设是：一个连续的因变量（裂解率），一个独立的杂物竹叶提取由两个或多个独立的分类组（正常，糖化，糖化和具有减少纤溶酶），并独立地各组中观察到的，使得一个事件发生，不影响另一事件数据（这保证了存在于数据没有重叠。）不含有任何显著离群数据集，正态分布由夏皮罗 - 威尔克统计检验验证数据，并且在由列文统计检验验证数据方差的同质性。一旦这些假设都成立，单向ANOVA和事后杜克-克莱默试验进行以0.05的p值作为阈用于确定统计显着性。为单向ANOVA和事后图基-克莱默测试的严格的细节，请参阅^44,45。

总体而言，该方法允许在其天然状态的正常和异常（由于疾病状态）的纤维蛋白凝块成像。该方法还提供了细节凝块溶解的实时成像，以及作为溶解率进行统计分析。与该血栓可以产生并成像在体外容易是大范围的细胞和组织工程应用中是有用的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22