Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Eksperimentelle og billedteknikker for behandlingen fibrinkoagel Structures i Normal og sygdomstilstande

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

Skade på et blodkar er endothelbeklædning repareres gennem den hæmostatiske respons, eller dannelse af en blodprop. Når blodet trænger ind den ekstracellulære matrix aktiverer vævsfaktorer blodplader i blodet, som letter indledningen af ​​koagulationskaskaden. Nøglen mekaniske del af denne helingsproces er fibrinmatrixen sammensat af fibrin fibre, der er meget elastisk og kan opretholde store kræfter 1-4. Mange forskere har undersøgt dannelsen struktur og funktion af fibrin i udstrakt grad i de seneste årtier 5-13.

Patienter med sygdomme, såsom diabetes mellitus og seglcelle har en øget risiko for at udvikle thrombotiske komplikationer såsom myokardieinfarkter, iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde 14-19. Over 2 millioner mennesker er nyligt diagnosticeret med diabetes mellitus hvert år i USA. Der er to typer af diabetes: Type I, hvorkrop ikke producerer tilstrækkelige mængder af insulin, og type II, hvor kroppen bliver resistent over for insulin. Blandt diabetespatienter, hjerte-kar-sygdom (CVD) er årsag til 80% af sygelighed og dødelighed forbundet med sygdommen 20,21.

Seglcelle sygdom (SCD) er en genetisk blodsygdom, der påvirker mere end 100.000 mennesker i USA 22. SCD er et punkt-mutation sygdom, der forårsager røde blodlegemer at blive halvmåne-formet, hvilket gør det vanskeligt for celler at passere gennem blod vaskulatur 23. Begge disse sygdomstilstande øge chancerne for at udvikle aterotrombotiske betingelser i kroppen. En af grundene til dette er et resultat af ændret fibrin struktur og funktion i sygdomstilstande 14,24-26.

I både diabetes og seglcelleanæmi, er der hyperkoagulation og hypofibrinolysis aktivitet, der inducerer aterotrombose og hjerte-kar-sygdom (CVD) sammenlignet med raske patienter 17,27,28. Det er kendt, at hypofibrinolysis fremmer åreforkalkning progression og skaber tilbagevendende iskæmiske hændelser hos patienter med tidlig koronararteriesygdom 29. I den nuværende manuskript, undersøgte vi rollen af ​​fibrin fysiske egenskaber i denne indstilling. Fibrinkoagel strukturer i ikke-syge patienter er sammensat af tynde fibre, større porer, og generelt mindre tætte 14,24. Den øgede porøsitet og mindre tætte fibrinklumper i raske patienter har vist sig at lette fibrinolyse 16. I hyperthrombotic tilstande, såsom diabetisk og seglcelleanæmi, er der en stigning i fibrinogen produktion, forårsager fibrinogenkoncentration at stige fra normale niveauer på 2,5 mg / ml i raske patienter 30-33. Fibrinkoagulater dannet i diabetiske patienter har vist sig at være mindre porøse, mere stiv, har flere forgreningspunkter, og tættere i forhold til sunde, ikke-diaBetic patienter 14,24,33-35. Den ændrede fibrin struktur er et resultat af glycosyleringsassays mekanismer, der forekommer i de involverede i koageldannelse proteiner. Ikke-enzymatisk (irreversibel) glykering opstår, når glukose molekyler binder til lysinrester på fibrinogen molekyle, som hæmmer menneskelige faktor Xllla (FXIIIa) fra korrekt cross-linking glutamin og lysinrester 33,36,37.

Den strukturelle analyse af fibrin-net er blevet undersøgt i udstrakt grad for nylig. Især har forskere udnyttet elektronmikroskopi og 3D rekonstruktion af fibrin-net 38, undersøgte hvordan både intravaskulære (endotelceller) celler og ekstravaskulære (fibroblaster og glatte muskelceller) celler påvirker fibrin struktur 39, anvendt viskoelastiske og spektral analyse til at analysere fibrin strukturer 40, og udviklede korrelationer mellem fibrin struktur og mekaniske egenskaber ved hjælp af eksperimentelle og beregningsmæssige metoder 41 in vitro fibrinogen glycosylering. For at simulere Seglcellesygdom størkning betingelser ledsagedes øgede fibrinogenkoncentrationer blandet med seglcelle hæmatokrit indsamlet fra patienter som udført tidligere af vores gruppe 42. Disse metoder blev anvendt til at undersøge struktur og funktioner, der er involveret i fibrinklumpdannelse og fibrinolyse under sygdomstilstande samt de mekanismer, der inducerer CVD. Baseret på aktuelle oplysninger om disse sygdomme, de glycerede fibrinkoagel strukturer var tættere med færre and mindre porer. De fibrinkoagulater med røde blodlegemer fra seglcellepatienter (RBC) var også tættere og vises aggregering af de røde blodlegemer og agglomereret fibrin klynger. Dette er et veletableret fænomen der er blevet bestemt tidligere 43. Det blev også en hypotese, at den fibrinolyse sats ville være betydeligt lavere i glycerede fibrinklumper med og uden nedsat plasmin sammenlignet med raske, normale fibrin. Resultaterne viste, at af glykosyleret fibrinklumper, var signifikant forskellige lysis prisresultaterne kun observeret under betingelser med reduceret plasmin koncentration. Denne eksperimentelle teknik med at bruge konfokal mikroskopi giver betydelige fordele i forhold til andre billeddiagnostiske metoder, fordi cellerne og proteiner forbliver i deres oprindelige tilstand, som gør det muligt registrering af real-time video af koagulation aktivitet. Denne metode til syntetisk inducerende størkning er også billigere og mere tid effektivt end at få patientprøver og bortfiltrere individuelproteiner og enzymer. Endvidere, ved anvendelse af separerede proteiner og enzymer til at syntetisere blodpropper blev blodpropper standardiseret, således at der ikke var variabilitet mellem prøver som følge af andre proteiner i plasma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Følgende protokol følger retningslinjerne fastsat af Institutional Review Board (IRB) ved Georgia Tech.

1. Blodprøvetagning og røde blodlegemer isoleringsprocedure

  1. Saml 40-120 ml blod fra donorer i 10 ml hepariniserede vakuumbeholderrør. Start PBMC (perifert blod mononukleære celler) isolation inden 4 timer efter prøvetagning. I løbet af denne tid, holde blod ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: O / N opbevaring af blod i RT eller 4 ° C anbefales ikke, da dette vil resultere i lavere PBMC udbytte.
  2. Fortynd fuldblod 1: 1 i iskold (4 ° C) sterilt PBS.
  3. Afpipetteres 10 ml iskold hydrofilt polysaccharid ind i en tom, steril 50 ml konisk rør. Overføre forsigtigt fortyndet fuldblod på toppen af ​​den hydrofile polysaccharid.
  4. Brug en 25 ml pipette i langsom indstilling og pipette blod langs siden af ​​røret meget langsomt. Kontroller, at blodet ikke blandes med saccharidet før Centrifugation fordi den hydrofile polysaccharid er giftigt for celler og Ellers vil PBMC udbytte være lavere.
  5. Centrifugér blodprøver til 30 minutter ved 400 xg ved 4 ° C. Hvis der foreligger reducere bremse hastigheden af ​​centrifugen til halvdelen af ​​maksimum for bedre adskillelse efter centrifugering.
  6. Aspirer fra plasma / blodplade brøkdel af den centrifugerede blodprøve. Aspireres forsigtigt det hydrofile polysaccharid lag direkte over det pakkede RBC lag.
  7. Saml 8-10 ml pakkede røde blodlegemer og fortyndes 1: 1 med usterilt 0,9% NaCl saltvand.

2. konfokalmikroskopi Evaluering af Glykeret Clot Structures (simuleret Diabetiske Clots)

  1. Optø humant fibrinogen og fluorescensmærket humant fibrinogen-konjugat ved 37 ° C.
  2. Pipette følgende i en 0,5 ml gradueret mikrocentrifugerør.
    1. For den sunde, normale fibrinogen blodpropper, bland human fibrinogen med 10% fluorescensmærket humant fibrinogenkonjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCI-buffer ved en koncentration på 5 mg / ml.
    2. For kunstigt glykeret fibrinogen (for at simulere diabetiske blodpropper), inkuberes human fibrinogen og 10% fluorescensmærket fibrinogen konjugat i en 5 mM opløsning af glucose opløst i 50 mM Tris / 100 mM NaCI i en resulterende koncentration på 6,8 mg / ml.
  3. Dæk mikro-centrifugerør under anvendelse af et uigennemsigtigt materiale for at undgå udsættelse for lys. Inkuber rørene i et 37 ° C vandbad i 48 timer.
  4. Lav et kammer på et objektglas ved at anbringe en tynd lim på 2 sider af dias.
  5. Efter 48 timers inkubationsperiode forberede reagenser til fibrindannelse ved afrimning FXIIIa og humane alfa thrombin ved stuetemperatur.
  6. Fortynd FXIIIa til 80 U / ml i 5 mM CaCl2 puffer.
  7. Fortynd thrombin til 4 U / ml i 5 mM CaCl2 puffer.
    1. For normale blodpropper, sikre, at de endelige koncentrationer af fibrinogen, FXIIIa, og thrombin er 2,5 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml ved et volumen på 50 pi.
    2. For de glycerede blodpropper sikre, at de endelige koncentrationer af fibrinogen, FXIIIa og thrombin er 3,4 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml i et volumen på 50 pi.
  8. Umiddelbart pipette 30 pi af fibrin opløsning ind i kammeret dannet af klæbemidlet.
  9. Anbring en 22 mm x 22 mm dækglas med en tykkelse på 0,15 mm på toppen af ​​de 2 lag af klæbemiddel. Forsegl åbne sider med klart klæbemiddel for at forhindre fibrinkoagel tørrer ud. Kontroller, at klæbemidlet ikke interagerer med fibrinkoagulatet.
  10. Lad fibrinkoagulater at polymerisere ved 21-23 ° C i 2 timer før konfokal billeddannelse.
  11. Tag konfokal mikroskopi billeder af blodpropper ved hjælp af en konfokal mikroskop med et 40X / 1,30 Oil M27 linse med en 488 nm Argon laser.

3. konfokal mikroskopi Evaluering af fibrinkoagulater indhold RBC'er fra seglcellepatienter

  1. Optø humant fibrinogen og fluorescensmærket humant fibrinogen-konjugat ved 37 ° C.
  2. Pipette følgende i en 0,5 ml gradueret mikrocentrifugerør.
    1. For en sund, normal fibrinkoagel, bland human fibrinogen med 10% fluorescensmærket humant fibrinogen konjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCI-buffer ved en koncentration på 5 mg / ml.
    2. For blodpropper indeholdende SCD RBC'er, bland humant fibrinogen og 10% fluorescensmærket humant fibrinogen konjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCI, således at den resulterende koncentration af fibrinogen er 10 mg / ml.
  3. Mærk de isolerede RBC (både normale og de fra seglcellepatienter opnået fra RBC isolation protokol) ved hjælp af en celle-mærkning løsning.
    1. Suspend celler ved en densitet på 1 x 10 6 per ml i en valgt serumfrit dyrkningsmedium.
    2. Tilsæt 5 ul / ml af cellesuspensionen til cellen mærkning opløsning. Bland godt ved forsigtig pipettering forsigtigt.
    3. Centrifuger mærkede ophængsrør ved 1.500 rpm i 5 minutter ved 37 ° C.
    4. Fjern supernatanten og forsigtigt genopslæmmes cellerne i 37 ° C medium.
    5. Gentag vaskeproceduren (3.3.4 og 3.3.5) to gange mere.
  4. Fortynd FXIIIa til 80 U / ml i 5 mM CaCl2 puffer.
  5. Fortynd thrombin til 4 U / ml i 5 mM CaCl2 puffer.
    1. For normale blodpropper sikre, at de endelige koncentrationer af fibrinogen, FXIIIa og thrombin er 2,5 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml i et volumen på 50 pi.
    2. For blodpropper indeholdende SCD RBC'er sikre, at de endelige koncentrationer af fibrinogen, FXIIIa og thrombin er 5 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml i et volumen på 50 pi.
  6. Afpipetteres 10 pi af de mærkede RBC til fibrin opløsning. Pipette 30 pi af fibrin med RBC onto mikroskop glas (se præparatglaspræpareringsprotokol for glycated blodpropper).
  7. Lad fibrin til at polymerisere ved 21-23 ° C i 2 timer før konfokal billeddannelse.
  8. Tag konfokale billeder af blodpropper ved hjælp af konfokal mikroskop, og udnytte excitation lasere med bølgelængder på 488 nm og 633 nm til at excitere fluorescerende mærkede fibrin og røde blodlegemer.

4. konfokal mikroskopi Evaluering af Fibrinolysis priser i glycerede Clot Structures

  1. Gentag konfokal mikroskopi-protokollen af ​​glycerede blodpropper (Protokol trin 2) for fibrinolyse rate evaluering glycerede blodpropper.
  2. Ikke forsegle enderne af kammeret med klart klæbemiddel. Lad fibrinkoagulater at polymerisere i 1,5 timer ved 21-23 ° C i et forseglet indelukke, der indeholder 250 ml vand for at forhindre dehydrering.
  3. Efter polymerisering opnå billeder af blodpropper ved hjælp af konfokal mikroskop.
  4. Pipette plasmin i den åbne ende af kammeret og dispergere plasmin gennem blodproppen via kapillarvirkning.
    1. Forde normale og glycerede fibrinolyse forsøg med normale koncentrationer, anbringes med pipette 25 pi på 200 ug / ml plasmin i åbningen af ​​kammeret.
    2. For de glycerede blodpropper med reducerede koncentrationer, pipettespidser 25 pi ved 50 ug / ml i åbningen af ​​kammeret.
  5. Brug den tid serien funktionen (se figur 1) i det konfokale mikroskop software til at indfange video i realtid optagelser af plasmin lysere blodproppen.
    1. Klik erhvervelse tilstand og derefter vælge "Time Series." Vælg antallet af cykler og optagetiden interval.

5. Beregning Fibrinolysis priser

  1. Bestem lysis sats ved at sætte et område (2.500 um 2), og beregne den forløbne tid, der kræves for at opløse en fast del af blodprop. Beregn lysis sats ved hjælp af følgende ligning (figur 2):
    Ligning 1

6. Statistisk analyse af fibrinolyse priser

  1. Analyser lysis data ved hjælp af statistisk analyse software. Udfør en envejs ANOVA og en post hoc Tukey-Kramer test 44,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konfokal mikroskopi Analyse af glykeret fibrinkoagel Structures

De konfokal mikroskopi billeder af normale og glycerede blodpropper er præsenteret i figur 3. Konfokal mikroskopi-analyse af de normale og glycerede blodpropper afslører, at glycerede blodpropper er tættere med mindre porer end det normale blodpropper både med og uden tilsætning af FXIIIa under blodprop polymerisation. I figur 3A og 3B, er der en lavere fibrin koncentration, som skabte en mindre tæt struktur end de glycerede blodpropper med højere koncentration fibrin (figurerne 3C og 3D).

Den større tæthed observeret (antal af fibre per arealenhed) i de glycerede blodpropper er et resultat af den øgede fibrinogen koncentration, der forekommer i mennesker med diabetes. I de normale blodpropper de fibrin fibre var mere lineær og dannes længere fibre ved polymerisation med FXIIIa, somer sandsynligvis et resultat af FXIIIa danne tværbindinger mellem fibrene. I tilfælde af de glycerede blodpropper fibrene syntes at være kortere, selv med tilsætning af FXIIIa. Dette er sandsynligvis et resultat af polymeriseringsprocessen, der blev ændret på grund af tilstedeværelsen af ​​glycerede regioner på fibrinogen molekyle. Desuden fra at analysere figur 3, er det sandsynligt, at fibertykkelse også blev reduceret som et resultat af glycosylering, hvilket sandsynligvis hvorfor fluorescens fra glycerede fibre synes at have en lavere intensitet.

Konfokal mikroskopi Analyse af fibrinkoagulater indhold RBC'er fra seglcellepatienter

Det konfokale mikroskop billeder af fibrinkoagel struktur af blodpropper med normal og RBC'er fra seglcellepatienter er vist i figur 4 Som forudsagt det konfokale billeder af fibrinkoagulater indeholdende RBC'er fra seglcellepatienter havde tættere strukturer end sunde fibrin C.partier. Figur 4A viser en homogen fordeling af fibrin og normale RBC. Men i figur 4B er der klumper af fibrin og hulrum, hvor ingen fibrin netværk dannes. De røde blodlegemer fra seglcellepatienter var ikke homogent spredt, men snarere blev indlejret i fibrin klumper. Den øgede tæthed (antal af fibre per arealenhed) var et resultat af den øgede fibrinogenkoncentration, der opstår som et resultat af hyperkoagulation i SCD-patienter. Desuden den naturlige tendens af de røde blodlegemer fra seglcellepatienter at danne aggregater skabt klumper af RBC der blev sammenvævet i fibrinnetværket. Dette resulterede i dannelsen af ​​afvigende clot strukturer, der er markant forskellige i morfologi end i normale patienter. Fra figur 4B, er det observeret, at RBC'er fra seglcelle patienter forårsaget større heterogenitet i fibrin prøven og også forårsaget en bredere rumlig fordeling af RBC'er i fibrin prøven, når comforhold til de sunde fibrinklumper med normale røde blodlegemer. I modsætning hertil sunde fibrinkoagulater med normale RBC udviste en mere homogen fordeling af celler i hele fibrin netværk.

Det er ukendt, hvor meget HbS (segl hæmoglobin) blev polymeriseret i erythrocytterne fra seglcellepatienter og er indeholdt i prøverne. Hvad er kendt, er imidlertid, at tilstedeværelsen af ​​en hvilken som helst mængde af HbS forårsager større aggregering af celler i antal HBs molekyler pr volumen vs. normale HbA molekyler. Pan et al. 46 har vist dette fænomen i en undersøgelse, hvor de sammenlignede sammenlægning / clustering effekter af deoxy-HBs og, til sammenligning, af oxy-HBs og oxy-normal voksen hæmoglobin, HbA. Klyngerne dannet inden for få sekunder, efter løsning forberedelse og deres størrelse og tal forblev relativt stabil i op til 3 timer. En af konklusionerne fra undersøgelsen var, at begge oxy-HBs og deoxy-HBs-molekyler grupperet på et større antal hulefoldighed end oxy-HbA (normale) molekyler som en funktion af temperaturen. Vedrørende den aktuelle undersøgelse, betyder dette, at RBC'erne fra seglcellepatienter var sandsynligvis klynge sammen, og fanget fibrin, som det blev polymeriseret fra fibrinogen precursor.

Konfokalmikroskopi Lysis Rate Analyse af Normal og glykeret Clots

Det blev antaget, at fibrinolyse satser ville være større for normale fibrinklumper forhold til glycerede fibrinklumper med nedsat plasmin koncentration. For at teste denne hypotese blev konfokal mikroskopi anvendes til at vurdere lysis satser fibrinkoagler med tilsætning af plasmin. Den gennemsnitlige (middel) lysis satser normal fibrin med tilsætning af 200 ug / ml plasmin var 43,2 ± 26,5 um 2 / sek, og den gennemsnitlige (middel) lysis satser glyceret fibrin med tilsætning af 200 ug / ml plasmin 29,7 ± 11,2 um 2 / sek. For det glycerede fibrinkoagel lyseret med50 ug / ml plasmin, den gennemsnitlige lysis rate var 12,8 ± 3,1 um 2 / SE. I alt 10 prøver hver (30 prøver) blev anvendt til at bestemme de gennemsnitlige og standardafvigelsesværdier. Disse værdier er præsenteret i figur 5. Blev en p-værdi på 0,05 anvendt til at bestemme signifikans mellem de uafhængige forsøgsgrupper. Analyse af fibrinolyse satser påvist, at værdien for de normale blodpropper sammenlignet med de glycerede (simuleret diabetiske) blodpropper med nedsat plasmin var signifikant forskellige.

Figur 1
Figur 1. Eksempel screenshot fra konfokal mikroskop software detaljering fremgangsmåde til opnåelse af real-time, løbende billeder af fibrinkoagel lysis. Klik her for at se en større version af this figuren.

Figur 2
Figur 2. Eksempel konfokal billede med fast areal, der anvendes til at beregne lysis på fibrinkoagel prøve. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Konfokale billeder af sunde og glycerede (diabetes) fibrinkoagulater. Grøn fluorescens repræsenterer fibrin netværk. Den unglycated fibrin repræsenterer blodpropper dannet i raske patienter, hvorimod glykeret fibrin repræsenterer blodpropper dannet i diabetespatienter. (A) Unglycated fibrin uden tilsætning af FXIIIa. (B) Unglycated fibrin med FXIIIa. (C (D) Glykeret fibrin med FXIIIa. Den røde skala bar angiver 50 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Konfokale billeder af sunde fibrinkoagulater med normale RBC og fibrinklumper med RBC fra seglcellepatienter. Grøn fluorescens repræsenterer fibrin netværk og magenta repræsenterer mærket sunde og RBC'er fra seglcellepatienter. (A) Sunde røde blodlegemer i normal fibrin koncentration med FXIIIa og (B) Øget fibrin med FXIIIa og RBC fra en seglcelle patient. Den hvide Målestokken viser 50 um. De hvide cirkler i billedet (B) angiver genkendelige seglformede røde blodlegemer.

Figur 5
Figur 5. Fibrinolysis satser for normale fibrinklumper sammenlignet med glycosyleret (diabetisk) fibrinklumper og glycerede blodpropper med nedsat plasmin koncentration. Statistisk signifikans blev bestemt ud fra en envejs ANOVA og post hoc Tukey-Kramer multiple sammenligningstest. ANOVA-analysen viste, at der var en signifikant forskel mellem lysis rate midler. Den Tukey-Kramer test viste, at der var en betydelig forskel i midler mellem de normale blodpropper og koaguleret med nedsat plasmin med ap <0,05. * Viser en signifikant forskel fra normale blodpropper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at opnå meningsfulde data om strukturen af ​​clotting mekanismer sygdomstilstande, er det vigtigt at isolere de faktorer involveret i koagulation for at bestemme virkningerne af proteiner og celler i disse betingelser. Denne protokol blev udviklet med henblik på at undersøge strukturen af fibrinkoagel i diabetiske og SCD stater in vitro.

Det er nødvendigt at forstå de mekanismer involveret i fibrindannelse og fibrinolyse i sygdomstilstande siden ændrede betingelser give hyperkoagulation, atherothrombose, og CVD. Fra det konfokale billeder opnået i dette forsøg er det klart, at hyperkoagulation aktivitet forekommer i diabetiske og SCD tilstande, som forårsager en forøget koncentration fibrinogen. En øget fibrinogenkoncentration resulterer i en tættere fibrin netværk med flere forgreningspunkter og mindre porer hele nettet. I fibrin netværk af SCD patienter, der ikke alene er der mere fibrin til stede, but den aggregering karakter erythrocytterne fra seglcellepatienter ændrer også strukturen i netværket, da det indeslutter fibrin i klynger. Den sammenblanding af RBC fra seglcellepatienter reducerer også porøsitet af fibrin klynger i nettet, men synes at øge ugyldig koncentration i det samlede net. Resultaterne af fibrinolyse analyse af de glycerede blodpropper støttede hypotese lysis sats glycerede blodpropper er lavere med reduceret plasmin end raske, normale blodpropper. Men resultaterne ikke afgørende beviser om lysis satser glycerede blodpropper med normale koncentrationer af plasmin. Det kan således konkluderes, at diabetiske patienter med normal plasmin koncentration, kan der være tilstrækkelig fibrinolyse aktivitet til at nedbryde fibrinkoagulater på en effektiv måde.

Til eksperimenterne udført i denne forskningsundersøgelse blev isolerede proteiner og RBC'er anvendes i stedet for fuldblod og plasma. Ved hjælp afadskilte proteiner til at syntetisere fibrinkoagulater kan årsagerne til ændrede strukturer mellem den normale vs. syge blodpropper bestemmes. Dette stærkt reduceret muligheden for at andre plasmaproteiner interfererer med strukturen og morfologien af ​​fibrinklumper. Men ved anvendelse af isolerede proteiner, er det afgørende at opbevare og håndtere celler og proteiner korrekt, da de er mere sårbare over for celledød og proteinnedbrydning.

Den konfokal mikroskopi imaging teknik valgt til denne undersøgelse skyldtes evnen til at opnå billeder af fibrinkoagel strukturer og samtidig bevare de naturlige trombotiske egenskaber af celler og proteiner. Konfokal mikroskopi har også vist sig at give bedre kontrast og optisk opløsning af prøven med reduceret støj sammenlignet med traditionelle lys mikroskopi. Laserlyset er rettet ind i et hul, der blokerer ufokuserede lys ind. Udnyttelse af konfokal mikroskopi undgås behovet fortilsætning af fiksativ kemikalier; således cellerne og proteiner var i stand til at opretholde deres naturlige protein aktivitet danne fibrinklumper. Som et resultat af de celler, proteiner og enzymer fungerede i deres native tilstand, der tillader anvendelse af konfokal mikroskopi til at indfange billeder og video af real-time aktivitet. Med konfokal mikroskopi blev 3D-billeder af fibrinkoagulater fanget og videoer af plasmin fordøjelse af fibrinkoagulater blev opnået i realtid. Ved tilsætning plasmin til blodproppen for at fange en tidsserie video af koagellyse proces, var det vigtigt at anvende kapillarvirkning via plasmin til homogent at dispergere enzymet gennem fibrin matrix. Dette blev gjort for at sikre, at den tilsatte plasmin koncentrationen var nøjagtige og tillod enzymet at lysere hele størkne, i modsætning til det lokale område, at plasmin blev tilsat.

Metoden og de ​​opnåede resultater i denne undersøgelse svarede til en undersøgelse udført af Dunn et al, som fandt, at clotlysesatser var signifikant lavere hos diabetikere end kontrolpersoner 25. I begge forsøg var der betydelige forskelle i lysis satserne for diabetiske (glycosyleret) blodpropper; dog kan den nuværende protokol præcist repræsentere diabetiske tilstande på grund af de reducerede plasmin niveauer. Derudover er der i denne forskningsundersøgelse fibrinolyse blev fanget kontinuerligt i realtid ved hjælp af konfokalt mikroskop, i modsætning til analyse af diskrete sektioner med forskellige tidsintervaller. Wooton et al. 47 har undersøgt fibrinkoagel lysis og ansat en lysis foran hastighed (cm / s) for at undersøge graden af lyse for blodpropper. De brugte konfokal billedanalyse i deres undersøgelse for at bestemme den forreste hastighed. I den aktuelle undersøgelse, i stedet for en lysis foran hastighed blev en lysis område hastighed, der anvendes (på grund af den måde, billedet blev analyseret på konfokal). For yderligere at validere metode udviklet i vores undersøgelse, har forfatterne i 48 beskrevet en matematisk model af fibrinkoagel lyse med plasmin, hvor de ordinere den lyse foran hastighed som en funktion af den effektive rente konstant fibrinolyse. Ligningen er givet som:
Ligning 2

Her Ligning 3 repræsenterer den effektive hastighedskonstant for fibrinolyse, K a er adsorption konstant, C pm er plasmin koncentration og ρ Fn er massefylden af fibrin. Hvis den målte mængde Ligning 4 (Målt fra det konfokale analyse i den aktuelle undersøgelse) er udnyttet, og kæden reglen anvendes, fører dette til:
Ligning 5

t "> Under antagelse kun én dimension ændrer per tidsenhed fører til:

Ligning 6

Ligning 7

Således effektiv hastighedskonstant for fibrinolyse til eksperimentet fører til:
Ligning 8

Dette forhold har udledt, at den effektive rente konstant fibrinolyse ( Ligning 9 ) Er en funktion af koncentrationen plasmin (C pm) og området lysis sats Ligning 10 .

Denne teknik er også vigtigt for studiet af trombose iSCD patienter, da der lidt om fibrin og størkne mekanismer med hensyn til denne sygdom. Der har været meget få undersøgelser om virkningerne af SCD struktur af fibrinklumper; Således konfokale billeder indsamlet fra denne undersøgelse giver sjældent visualisering af blodprop struktur med indbygget seglformede røde blodlegemer.

For at sammenligne forskellene i midler mellem grupperne, skal du bruge en envejs ANOVA og post hoc Tukey-Kramer test. En envejs ANOVA er en statistisk test anvendes til at bestemme en statistisk signifikant forskel i midlerne mellem uafhængige grupper. Den Tukey-Kramer post-test bruges til at sammenligne midlerne fra hver selvstændig gruppe og afgøre, hvilke gruppers midler er statistisk forskellige fra hinanden. Før udførelse af en en-vejs ANOVA, der er seks antagelser, der skal opfyldes for at sikre, at resultaterne er gyldige. De seks antagelser er: en kontinuerlig afhængig variabel (lysis rate), en uafhængig variable består af to eller flere uafhængige kategoriske grupper (normal, glyceret og glykeret med reduceret plasmin), og uafhængigt observerede data i hver gruppe, således at en hændelse opstår ikke påvirker en anden begivenhed (Dette sikrer, at der ikke er nogen overlapning i data.) skal dataene ikke indeholder væsentlige outliers, normalfordelte data verificeret af Shapiro-Wilk statistiske test, og varianshomogenitet i dataene verificeret af Levene statistisk test. Når disse forudsætninger er opfyldt, blev en envejs ANOVA og post hoc Tukey-Kramer test udført med en p-værdi på 0,05, da tærsklen til bestemmelse af statistisk signifikans. For en streng detalje af envejs ANOVA og post-hoc Tukey-Kramer test, henvises til 44,45.

Samlet set denne metode giver mulighed for billeddannelse af normale og unormale (på grund af sygdomstilstande) fibrinklumper i deres oprindelige stater. Metoden giver også oplysninger om real-time billeder af clotlyse samtsom statistisk analyse af lysis satser. Den lethed, hvormed tromben kan produceres og afbildes in vitro er anvendelig til en lang række applikationer i cellulære og vævsmanipulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).

Tags

Medicine fibrin størkne sygdom konfokal mikroskopi diabetes glycosylering erythrocyt seglcelle
Eksperimentelle og billedteknikker for behandlingen fibrinkoagel Structures i Normal og sygdomstilstande
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. … More

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter