Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten

Introduction

Letsel aan endotheliale bekleding van een bloedvat wordt hersteld door de hemostatische reactie of de vorming van een bloedstolsel. Wanneer bloed doordringt in de extracellulaire matrix, weefselfactoren activeert bloedplaatjes stroom die initiatie van de coagulatie cascade vergemakkelijken. De belangrijkste mechanische componenten van dit genezingsproces is de fibrine matrix, samengesteld uit fibrine vezels die zeer elastisch, en kan grote krachten ^1-4 ondersteunen. Veel onderzoekers hebben de vorming van structuur en functie van fibrine uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia ^5-13.

Patiënten met ziekten zoals diabetes mellitus en sikkelcel hebben een verhoogd risico op trombotische complicaties zoals myocardinfarct, ischemische hartziekte, en lijnen ^14-19. Meer dan 2 miljoen mensen zijn met nieuw gediagnosticeerde diabetes mellitus elk jaar in de Verenigde Staten. Er zijn twee types van diabetes: Type I, waarbij delichaam niet in slaagt om voldoende hoeveelheden insuline, en type II, waar het lichaam resistent wordt voor insuline te produceren. Bij patiënten met diabetes, cardiovasculaire ziekte (CVD) is de oorzaak van 80% van de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met de ziekte ^20,21.

Sikkelcelziekte (SCZ) is een erfelijke bloedziekte die meer dan 100.000 mensen in de Verenigde Staten ²² beïnvloedt. SCD is een puntmutatie ziekte die rode bloedcellen veroorzaakt halvemaanvormige worden, waardoor het moeilijk voor de cellen door het bloed vasculatuur ²³ te passen. Beide ziekten vergroten de kans op het ontwikkelen atherotrombotische omstandigheden in het lichaam. Eén van de redenen hiervoor is een gevolg van veranderde fibrine structuur en functie in zieke toestanden ^14,24-26.

Zowel diabetes en sikkelcelziekte, is hypercoagulatie en hypofibrinolysis activiteit die atherotrombose en cardiovasculaire ziekte induceert (CVD) in vergelijking met gezonde patiënten ^17,27,28. Het is bekend dat hypofibrinolysis bevordert progressie van atherosclerose en wekt terugkerende ischemische gebeurtenissen voor patiënten met premature kransslagaderziekte ^29. In de huidige manuscript, onderzochten we de rol van fibrine fysische eigenschappen in deze specifieke setting. Fibrinestolsel structuren niet zieke patiënten bestaan ​​uit dunne vezels, grotere poriën, en meestal minder dichte ^14,24. De toegenomen porositeit en minder dichte fibrinestolsels bij gezonde patiënten zijn gevonden fibrinolyse ¹⁶ vergemakkelijken. In hyperthrombotic aandoeningen zoals diabetes en sikkelcelziekte, is er een toename van fibrinogeen productie, waardoor het fibrinogeen concentratie toenemen van normale niveaus van 2,5 mg / ml bij gezonde patiënten ^30-33. Fibrine stolsels gevormd in diabetespatiënten gevonden minder poreus, stijver te zijn, meer vertakkingspunten en dichtere vergelijking met gezonde, niet-diabetic patiënten ^14,24,33-35. De gewijzigde fibrine structuur is een gevolg van glycosylering mechanismen die optreden in de bij stolselvorming eiwitten. Niet-enzymatische (onomkeerbare) glycation treedt op wanneer glucose moleculen binden aan lysine residuen op de fibrinogeen molecuul, dat menselijke factor XIII bis (FXIIIa) niet goed verknoping glutamine en lysineresiduen ^33,36,37 remt.

De structuuranalyse van fibrine netwerk is uitgebreid recent bestudeerd. In het bijzonder hebben onderzoekers elektronenmicroscopie en 3D reconstructie van fibrine netwerken ^38, onderzocht hoe zowel intravasculaire (endotheel) cellen en extravasculaire (fibroblasten en gladde spier) cellen beïnvloeden fibrine structuur ^39, gebruikt viscoelastische en spectraalanalyse in fibrine structuren ⁴⁰ analyseren, en benut ontwikkelde correlaties tussen fibrine structuur en mechanische eigenschappen met behulp van experimentele en computationele benaderingen ⁴¹ in vitro fibrinogeen glycatie induceren. Aan sikkelcelanemie stolling omstandigheden te simuleren, werden verhoogd fibrinogeen concentraties gemengd met sikkelcelziekte hematocriet verzameld van patiënten zoals eerder gedaan door onze groep ^42. Deze methoden werden gebruikt om de structuur en functies betrokken in fibrine stolselvorming en fibrinolyse onder ziektetoestanden, alsmede de mechanismen die CVD induceren onderzocht. Op basis van de huidige informatie over deze ziekten, de geglyceerde fibrinestolsel structuren waren dichter met minder eennd kleinere poriën. De fibrine stolsels met rode bloedcellen van sikkelcel patiënten (RBC) werden ook dichter en weergegeven aggregatie van de rode bloedcellen en fibrine geagglomereerde clusters. Dit is een gevestigde verschijnsel dat eerder ⁴³ bepaald. Ook werd verondersteld dat de fibrinolyse percentage significant lager in geglyceerd fibrinestolsels met en zonder verminderde plasmine vergelijking met gezonde, normale fibrine is. De resultaten toonden dat voor geglycosileerd fibrinestolsels significant verschillend lysis coëfficiënt resulteert alleen in omstandigheden van verminderde concentratie plasmine waargenomen. Deze experimentele techniek van het gebruik van confocale microscopie biedt aanzienlijke voordelen boven andere beeldvormende technieken omdat de cellen en eiwitten blijven in hun natieve toestand, waarbij het vangen van real-time video van de stollingsactiviteit mogelijk maakt. Deze methode van synthetisch inducerende stolling is ook goedkoper en meer tijd efficiënter dan het verkrijgen van monsters van patiënten en te filteren op individueleeiwitten en enzymen. Bovendien, door gescheiden eiwitten en enzymen om stolsels synthetiseren, de stolsels werden gestandaardiseerd zodat er geen variabiliteit tussen monsters als gevolg van andere eiwitten in het plasma.

Protocol

OPMERKING: Het volgende protocol houdt zich aan de door de Institutional Review Board (IRB) in te stellen aan de Georgia Tech richtlijnen.

1. bloedafname en rode bloedcellen isolatieprocedure

1. Verzamel 40-120 ml bloed donoren in 10 ml gehepariniseerde Vacutainer buizen. Start PBMC (perifere bloed mononucleaire cellen) isolatie binnen 4 uur van de collectie. Gedurende deze tijd, blijven bloed bij KT.
   OPMERKING: O / N opslag van bloed in RT of in 4 ° C wordt niet aanbevolen, omdat dit zal leiden tot lagere PBMC opbrengst.
2. Verdun volbloed 1: 1 in ijskoude (4 ° C) steriel PBS.
3. Pipetteer 10 ml van ijskoude hydrofiele polysaccharide in een lege, steriele 50 ml conische buis. Zacht overdracht verdund volbloed bovenop de hydrofiele polysaccharide.
4. Gebruik een pipet 25 ml in slow-instelling en de pipet bloed langs de kant van de buis heel langzaam. Zorg ervoor dat het bloed niet wordt gemengd met de saccharide vóór Centrifugation omdat de hydrofiele polysaccharide is giftig voor cellen en anders de PBMC rendement lager.
5. Centrifuge bloedmonsters gedurende 30 min bij 400 xg bij 4 ° C. Indien beschikbaar, verminderen de rem snelheid van de centrifuge helft van maximum betere scheiding na centrifugeren.
6. Zuig uit het plasma / bloedplaatjes fractie van de gecentrifugeerd bloedmonster. Aspireren voorzichtig de hydrofiele polysaccharide laag direct boven de verpakte RBC laag.
7. Verzamel 8-10 ml van verpakte RBC en verdunnen 1: 1 met niet-steriele 0,9% NaCl zoutoplossing.

2. confocale microscopie Evaluatie van Geglyceerde Clot Structures (Simulated Diabetische Klonters)

1. Ontdooi menselijk fibrinogeen en fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat bij 37 ° C.
2. Pipet het volgende in een 0,5 ml afgestudeerd microcentrifugebuisje.
   1. Voor de gezonde, normale fibrinogeen stolsels, mengen menselijk fibrinogeen met 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeenconjugaat in 50 mM Tris / 100 mM NaCl buffer bij een concentratie van 5 mg / ml.
   2. Voor kunstmatig geglyceerd fibrinogeen (simuleren diabetische stolsels), incubeer menselijk fibrinogeen en 10% fluorescent gelabelde conjugaat fibrinogeen in een 5 mM oplossing van glucose opgelost in 50 mM Tris / 100 mM NaCl gedurende een resulterende concentratie van 6,8 mg / ml.
3. Bedek de micro-centrifugebuizen met een opaak materiaal om blootstelling aan licht te vermijden. Incubeer de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 48 uur.
4. Maak een kamer op een glazen microscoopglaasje door het aanbrengen van een dunne lijm aan 2 kanten van de dia.
5. Na de 48 uur incubatietijd, bereiden reagentia voor fibrinevorming door ontdooien FXIIIa en menselijke alfa trombine bij RT.
6. Verdun FXIIIa 80 U / ml in 5 mM _CaCl2 buffer.
7. Verdun trombine 4 U / ml in 5 mM _CaCl2 buffer.
   1. Voor normale stolsels, ervoor zorgen dat de uiteindelijke concentraties van fibrinogeen, FXIIIa, en trombine zijn 2,5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
   2. Voor de geglyceerde stolsels, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 3.4 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
8. Onmiddellijk Pipetteer 30 ul van de oplossing fibrine in de kamer gevormd door de kleefstof.
9. Plaats een 22 mm x 22 mm glazen dekglas met een dikte van 0,15 mm bovenop de 2 lijmlagen. Verzegel de open zijden met duidelijke lijm te voorkomen dat de fibrine stolsel uitdroogt. Zorg ervoor dat de lijm niet interageren met de fibrinestolsel.
10. Laat de fibrineklonters polymeriseren bij 21-23 ° C gedurende 2 uur voor confocale beeldvorming.
11. Neem confocale microscopie beelden van de stolsels met behulp van een confocale microscoop met een 40X / 1.30 Olie M27 lens met een 488 nm Argon laser.

3. confocale microscopie Evaluatie van fibrineklonters bevattende RBC uit sikkelcelpatiënten

1. Ontdooi menselijk fibrinogeen en fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat bij 37 ° C.
2. Pipet het volgende in een 0,5 ml afgestudeerd microcentrifugebuisje.
   1. Voor de gezonde, normale fibrine, mengen menselijk fibrinogeen met 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat in een 50 mM Tris / 100 mM NaCl buffer bij een concentratie van 5 mg / ml.
   2. Voor de stolsels die SCD RBCs, meng menselijk fibrinogeen en 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat in een 50 mM Tris / 100 mM NaCl zodanig dat de verkregen concentratie van het fibrinogeen 10 mg / ml.
3. Label de geïsoleerde RBC (zowel normaal als die van sikkelcelpatiënten verkregen uit de RBC isolatie protocol) met behulp van een cel-labeling oplossing.
   1. Suspendeer cellen bij een dichtheid van 1 x 10 ⁶ per ml in elke gewenste serumvrij kweekmedium.
   2. Voeg 5 ul / ml van de celsuspensie aan de cel-labeling oplossing. Meng goed door zachte pipetteren voorzichtig.
   3. Centrifugeer de suspensie gemerkte buizen bij 1.500 rpm gedurende 5 min bij 37 ° C.
   4. Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de cellen in 37 ° C medium.
   5. Herhaal het wassen procedure (3.3.4 en 3.3.5) nog twee keer.
4. Verdun FXIIIa 80 U / ml in 5 mM _CaCl2 buffer.
5. Verdun trombine 4 U / ml in 5 mM _CaCl2 buffer.
   1. Voor normale stolsels, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 2,5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
   2. Voor de stolsels die SCD erytrocyten, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl.
6. Pipetteer 10 ul van de gemerkte RBC in de fibrine oplossing. Pipetteer 30 ul van de fibrine met RBC op de microscoop glas (zie voorbereiding op gl schuivenycated stolsels).
7. Laat de fibrine polymeriseren bij 21-23 ° C gedurende 2 uur voor confocale beeldvorming.
8. Neem confocale beelden van de stolsels met de confocale microscoop en gebruiken excitatie lasers met golflengten van 488 nm en 633 nm om de fluorescent gelabelde fibrine en RBC wekken.

4. confocale microscopie Evaluatie van Fibrinolyse Tarieven in Geglyceerde Clot Structuren

1. Herhaal de confocale microscopie protocol van geglyceerde stolsels (Protocol Stap 2) voor de fibrinolyse tarief evaluatie in geglyceerde stolsels.
2. Raak de uiteinden van de kamer met duidelijke lijm niet dichten. Laat de fibrineklonters polymeriseren gedurende 1,5 uur bij 21-23 ° C in een afgesloten omhulling met 250 ml water om uitdroging te voorkomen.
3. Na polymerisatie verkregen beelden van de stolsels met de confocale microscoop.
4. Pipetteer plasmine in het open einde van de kamer en verspreiden de plasmine door de prop via capillaire werking.
   1. Voorde normale en geglyceerd fibrinolyse experimenten met normale concentraties pipet 25 pi 200 pg / ml van plasmine in de opening van de kamer.
   2. Voor de geglyceerde stolsels met verminderde concentraties pipet 25 ul bij 50 ug / ml in de opening van de kamer.
5. Gebruik de tijdreeks-functie (zie figuur 1) in de confocale microscoop software om real-time videobeelden van de plasmine lyseren het stolsel te vangen.
   1. Klik acquisitie-modus en selecteer vervolgens "Time-serie." Selecteer het aantal cycli en de opname tijdsinterval.

5. Berekening Fibrinolysis tarieven

1. Bepaal de lysis tarief door het instellen van een gebied (2500 um ²⁾ en het berekenen van de verstreken tijd die nodig is om een vast gedeelte van het stolsel op te lossen. Bereken het percentage lysis met de volgende vergelijking (Figuur 2):
   

6. Statistische analyse van Fibrinolysis Tarieven

1. Analyseer de lysis van gegevens met behulp van statistische analyse software. Voer een one-way ANOVA en een post hoc Tukey-Kramer-test ^44,45.

Representative Results

Confocale microscopie Analyse van Geglyceerde fibrinestolsel Structuren

De confocale microscopie foto van normale en geglycosileerd stolsels zijn weergegeven in Figuur 3. Confocale microscopie analyse van de normale en geglyceerd bloedstolsels blijkt dat geglyceerd stolsels dichter zijn met kleinere poriën dan de normale stolsels met en zonder toevoeging van FXIIIa tijdens stolsel polymerisatie. In figuur 3A en 3B, is een lagere fibrine concentratie die een minder dichte structuur gecreëerd dan geglyceerd stolsels hogere fibrine concentratie (Figuren 3C en 3D).

De grotere dichtheid waargenomen (aantal vezels per oppervlakte-eenheid) in de geglyceerde stolsels is een gevolg van de verhoogde fibrinogeen concentratie die voorkomt bij mensen met diabetes. In de normale stolsels, fibrine vezels waren lineair en gevormde langere vezels bij polymerisatie met FXIIIa, diewaarschijnlijk een gevolg van de FXIIIa verknopingen tussen de vezels. Bij de geglyceerd stolsels, de vezels bleken korter, zelfs met toevoeging van FXIIIa. Dit is waarschijnlijk het resultaat van de polymerisatie die is gewijzigd door de aanwezigheid van geglyceerde gebieden op het fibrinogeen molecuul. Bovendien, het analyseren van figuur 3, is het waarschijnlijk dat de vezeldikte ook verminderd als gevolg van glycosylering, wat waarschijnlijk de reden waarom de fluorescentie van geglyceerd vezels blijken een lagere intensiteit hebben.

Confocale microscopie Analyse van fibrineklonters bevattende RBC uit sikkelcelpatiënten

De confocale microscoop foto van de fibrine klonter structuur van stolsels normale en RBC van sikkelcel patiënten zijn weergegeven in figuur 4. Zoals voorspeld, de confocale beelden van de fibrine-stolsels bevattende RBC van sikkelcel patiënten dichtere structuur dan die van gezonde fibrine cpercelen. Figuur 4A toont een homogene verdeling van fibrine en de normale RBC. Echter, in figuur 4B zijn er massa's van fibrine en holle ruimten waar geen fibrine netwerk gevormd. De RBC van sikkelcel patiënten niet homogeen verspreid, maar zijn ingebed in de fibrine bosjes. De verhoogde dichtheid (aantal vezels per oppervlakte-eenheid) was een gevolg van de verhoogde fibrinogeen concentratie die optreedt als gevolg van hypercoagulatie in SCD patiënten. Bovendien is de natuurlijke neiging van RBC uit sikkelcelpatiënten om aggregaten te vormen veroorzaakt klonten van RBC, dat werd verweven in de fibrine netwerk. Dit resulteerde in de vorming van stolsel afwijkende structuren die aanzienlijk verschillen in morfologie dan die van normale patiënten. Uit figuur 4B, wordt waargenomen dat RBC van sikkelcel patiënten veroorzaakt grotere heterogeniteit in de fibrine monster en veroorzaakte ook een bredere ruimtelijke verdeling van RBC in de fibrine monster wordt als comvergelijking met de gezonde fibrineklonters normale RBC. In tegenstelling, de gezonde fibrineklonters normale RBC vertoonden een meer homogene dispersie van cellen in het fibrine netwerk.

Het is onbekend hoe veel HbS (sikkelhemoglobine) werd gepolymeriseerd in de erytrocyten uit sikkelcel patiënten en is opgenomen in de monsters. Wat echter bekend is dat de aanwezigheid van een hoeveelheid HbS veroorzaakt grotere aggregatie van cellen in aantal HbS moleculen per volume-eenheid versus normale HbA moleculen. Pan et al. ⁴⁶ heeft dit verschijnsel in een studie waarin ze vergeleken de aggregatie / clustering effecten van deoxy-HbS aangetoond en, ter vergelijking, van oxy-HbS en oxy-normale volwassen hemoglobine HbA. De clusters gevormd binnen enkele seconden na bereiding van de oplossing en de afmetingen en aantallen bleef relatief stabiel tot 3 uur. Een van de conclusies van de studie was dat zowel oxy-HbS en deoxy-HbS moleculen geclusterd op een hoger nummer density dan oxy-HbA (normaal) moleculen als functie van de temperatuur. Met betrekking tot de huidige studie, betekent dit dat de RBC van sikkelcel patiënten waarschijnlijk bundelen en gevangen fibrine als het werd gepolymeriseerd uit de fibrinogeen precursor.

Confocale microscopie Lyse Beoordeel Analyse van Normal en Geglyceerde Klonters

De hypothese was dat de fibrinolyse tarieven groter voor normale fibrineklonters vergelijking met glycated fibrineklonters met verminderde plasmine concentratie zou zijn. Om deze hypothese te testen, werd confocale microscopie gebruikt voor de lysis tarieven fibrinestolsels ervan met de toevoeging van plasmine. De gemiddelde (gemiddelde) lysis percentages normale fibrine met de toevoeging van 200 pg / ml van plasmine was 43,2 ± 26,5 pm ² / sec en de gemiddelde (gemiddelde) lysis percentages van geglyceerd fibrine met de toevoeging van 200 pg / ml plasmine werd 29.7 ± 11.2 ² pm / sec. Voor de geglyceerde fibrinestolsel gelyseerd met50 ug / ml van plasmine, de gemiddelde lysis bedroeg 12,8 ± 3,1 pm ² / se. Een totaal van 10 monsters per (30 monsters) werden gebruikt om het gemiddelde en standaardafwijking waarden te bepalen. Deze waarden worden weergegeven in figuur 5. Een p-waarde van 0,05 werd gebruikt om significantie tussen de onafhankelijke experimentele groepen bepalen. Analyse van de fibrinolyse percentages aangetoond dat de waarde van de normale stolsels ten opzichte van het geglycosyleerd (gesimuleerde diabetes) stolsels met verminderde plasmine waren significant verschillend.

Figuur 1. Voorbeeld van een schermafbeelding van confocale microscoop software detaillering methode voor het verkrijgen van real-time, continue beeldvorming van fibrine stolsellysis. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.

Figuur 2. Voorbeeld confocale afbeelding met vast gebied gebruikt om lysis tarief van fibrinestolsel monster te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Confocale beelden van gezond en geglyceerde (diabetische) fibrineklonters. Groen fluorescentie vertegenwoordigt de fibrine netwerk. De unglycated fibrine vertegenwoordigt stolsels gevormd in gezonde patiënten, terwijl glycated fibrine vertegenwoordigt stolsels gevormd bij diabetespatiënten. (A) Unglycated fibrine zonder toevoeging van FXIIIa. (B) Unglycated fibrine met FXIIIa. (C (D) Geglyceerde fibrine met FXIIIa. De rood schaal balk geeft 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Confocale beelden van gezonde fibrinestolsels normale rode bloedcellen en fibrine stolsels met RBC van sikkelcelpatiënten. Groene fluorescentie geeft het fibrine netwerk en magenta vertegenwoordigt gezonde en RBC van sikkelcelpatiënten gelabeld. (A) gezonde RBC normale fibrineconcentratie met FXIIIa en (B) Verhoogd fibrine met FXIIIa en RBC van een sikkelcel patiënt. De witte schaal balk geeft 50 micrometer. De witte cirkels in de afbeelding (B) geven herkenbare gesikkelde RBC.

Figuur 5. Fibrinolyse tarieven van de normale fibrineklonters vergelijking met glycated (diabetische) fibrineklonters en geglyceerde stolsels met verminderde concentratie plasmine. Statistische significantie werd bepaald op basis van een one-way ANOVA en een post hoc Tukey-Kramer meervoudige vergelijkingstest. De ANOVA analyse bleek dat er een significant verschil tussen lysis rate middelen. De Tukey-Kramer test toonde aan dat er een significant verschil betekent tussen de gewone stolsels en stolsels met verminderde plasmine met een p <0,05. De * geeft een significant verschil met normale stolsels.

Discussion

Om zinvolle gegevens over de structuur van stollingsmechanismen bij ziektetoestanden verkrijgen, is het belangrijk om de bij stolling om de effecten van de eiwitten en cellen onder deze omstandigheden vast factoren te isoleren. Dit protocol werd ontwikkeld ten behoeve van onderzoek naar de structuur van de fibrine klonter in diabetische cardiomyopathie toestanden in vitro.

Het is noodzakelijk om de bij de vorming van fibrine en fibrinolyse bij ziektetoestanden aangezien veranderde omstandigheden veroorzaken hypercoagulatie, atherotrombose, en CVD mechanismen te begrijpen. Uit de confocale beelden verkregen in dit experiment is het duidelijk dat hypercoagulatie activiteit optreedt bij diabetische cardiomyopathie toestanden, die een verhoogde fibrinogeen concentratie veroorzaakt. Een verhoogde fibrinogeen concentratie resulteert in een dichter fibrine netwerk met meer vertakkingspunten en kleinere poriën gehele netwerk. In fibrine netwerk van SCD patiënten, niet alleen is er meer fibrine aanwezig, but de aggregerende aard van de erytrocyten uit sikkelcelpatiënten verandert ook de structuur van het netwerk als het vangt fibrine in clusters. Het conglomeraat van RBC van sikkelcel patiënten vermindert ook porositeit van de fibrine clusters in het netwerk, maar blijkt void concentratie in het totale netwerk te vergroten. De resultaten van de analyse van de fibrinolyse geglyceerd stolsels steun voor de hypothese van de lysis tarief geglyceerd stolsels lager met beperkte plasmine dan die van gezonde normale stolsels. Echter, de resultaten geen sluitend bewijs over lysis tarieven van geglyceerde stolsels met normale concentraties van plasmine. Derhalve kan worden geconcludeerd dat bij diabetische patiënten met een normale concentratie plasmine, er kan voldoende fibrinolyse activiteit aan fibrine klonters breken op een efficiënte wijze.

Voor experimenten die in dit onderzoek werden geïsoleerde eiwitten en erytrocyten gebruikt, in plaats van volledig bloed en plasma. Viaafgescheiden eiwitten aan de fibrineklonters synthetiseren, kunnen de oorzaken van gewijzigde structuren tussen de normale versus zieke stolsels worden bepaald. Dit sterk verminderd de mogelijkheid van andere plasmaproteïnen interfereert met de structuur en morfologie van de fibrinestolsels. Door echter geïsoleerde eiwitten, is het cruciaal opslag en hantering de cellen en eiwitten gewoon, omdat ze kwetsbaarder celdood en eiwitafbraak.

De confocale microscopie techniek gekozen voor deze studie was te wijten aan de mogelijkheid om beelden van de fibrine klonter structuur verkrijgen, terwijl de natuurlijke trombotische eigenschappen van de cellen en eiwitten behouden. Confocale microscopie heeft ook aangetoond dat een verbeterd contrast en de optische resolutie van het monster met minder ruis in vergelijking met traditionele lichte microkopie geven. Het laserlicht wordt gericht in een gaatje dat blokkeert ongericht licht binnenkomt. Gebruik van confocale microscopie overbodig maakte detoevoeging van fixatief chemicaliën; waardoor de cellen en eiwitten konden hun natuurlijke eiwitwerkzaamheid vormen fibrinestolsels handhaven. Hierdoor cellen, proteïnen en enzymen functioneerden in hun natieve toestand, die het gebruik van confocale microscopie om foto's en video van real-time activiteit. Met confocale microscopie werden 3D beelden van de fibrinestolsels gevangen en video plasmine digestie van fibrinestolsels werden verkregen in real-time. Bij het toevoegen van plasmine aan het stolsel een tijdreeks video van het stolsel lysis proces vangen, was het belangrijk om capillaire werking te gebruiken via plasmine homogeen dispergeren enzym door de fibrine matrix. Dit werd gedaan om de toegevoegde plasmine concentratie nauwkeurig en liet het enzym de volledige klonter lyseren, in tegenstelling tot de omgeving die het plasmine werd toegevoegd.

De werkwijze en de in deze studie verkregen resultaten waren vergelijkbaar met een studie uitgevoerd door Dunn et al, die dat stolsel lysis gevondentarieven waren significant lager bij diabetische patiënten dan controlepersonen ^25. In beide onderzoeken waren er significante verschillen in lysis tarieven van diabetische (glycated) stolsels; echter, de actuele protocol nauwkeurig weergeven diabetische toestanden vanwege de verlaagde plasmine niveaus. Verder in dit onderzoek fibrinolyse werd continu meegenomen in real-time via de confocale microscoop, in tegenstelling tot de analyse discrete secties verschillende tijdsintervallen. Wooton et al. ⁴⁷ hebben fibrine stolsel lysis onderzocht en gebruikt een lysis voorste snelheid (cm / s) om het percentage lysis van stolsels onderzoeken. Ze gebruikten confocale beeldanalyse in de studie naar voren snelheid bepalen. In de huidige studie, in plaats van een lysis frontsnelheid, werd een specifieke lysis snelheid gebruikt (vanwege de manier waarop het beeld werd geanalyseerd op het confocale). Om de methode ontwikkeld in onze studie verder te valideren, hebben de auteurs in ⁴⁸ een wiskundig model van de beschreven fibrine stolsel lysis door plasmine, waarin zij voorschrijven lysis voorste snelheid als functie van de effectieve snelheidsconstante van fibrinolyse. De vergelijking wordt gegeven als:

Hier, is de effectieve snelheidsconstante van de fibrinolyse, K _een constante is de adsorptie, C _pm is de concentratie plasmine en _Fn ρ de dichtheid van fibrine. Als de gemeten hoeveelheid (Gemeten vanaf de confocale analyse in deze studie) wordt gebruikt en de ketting regel wordt toegepast, leidt dit tot:

t "> Aangenomen slechts één dimensie verandert per tijdseenheid leidt tot:

Dus het effectieve tarief constante van fibrinolyse voor het experiment leidt tot:

Deze relatie leidt hieruit af dat het effectieve tarief constante van fibrinolyse ( ) Is een functie van de concentratie plasmine (C _pm) en het gebied lysis percentage .

Deze techniek is ook belangrijk voor de studie van tromboseSCD patiënten, omdat er weinig bekend is over fibrine en stollingsmechanismen met betrekking tot deze ziekte. Er zijn zeer weinig onderzoek gedaan naar de effecten van SCD op de structuur van fibrinestolsels geweest; dus de confocale beelden verzameld uit deze studie levert zeldzame visualisatie van het stolsel structuur met ingebouwde gesikkelde RBC.

Om de verschillen in middelen tussen de groepen te vergelijken, gebruik dan een one-way ANOVA en een post hoc Tukey-Kramer test. Een eenzijdige ANOVA is een statistische toets gebruikt om een ​​statistisch significant verschil in de middelen tussen onafhankelijke groepen bepalen. De Tukey-Kramer post-test wordt gebruikt om de middelen van elke onafhankelijke groep vergelijken en bepalen welke middelen groepen statistisch verschillend van elkaar. Voordat een one-way ANOVA, er zes aannames die moeten worden voldaan opdat de resultaten geldig. De zes veronderstellingen zijn: een continue afhankelijke variabele (lysis rate), een onafhankelijke variable bestaande uit twee of meer onafhankelijke categorische groepen (normaal, geglyceerd en geglyceerd met verminderde plasmine), en onafhankelijk waargenomen gegevens in elke groep zodat één voorval heeft geen invloed op andere gebeurtenis (Dit verzekert dat er geen overlapping in data.) , de dataset geen significante uitschieters bevatten, normaal verdeelde gegevens geverifieerd door de Shapiro-Wilk statistische toets, en homogeniteit van variantie in de gegevens geverifieerd door de Levene statistische test. Zodra deze aannames voldaan, werden ANOVA en post hoc Tukey-Kramer proef uitgevoerd met een p-waarde van 0,05 als criterium voor de bepaling van statistische significantie. Voor een rigoureuze detail van de one-way ANOVA en post-hoc Tukey-Kramer-test, zie ^44,45.

Kortom, zorgt deze werkwijze voor beeldvorming van normale en afwijkende (door zieke toestanden) fibrinestolsels in hun oorspronkelijke staat. De werkwijze verschaft ook informatie voor real-time imaging van stolsel lysis ookals statistische analyse van lysis tarieven. Het gemak waarmee de trombus kan worden geproduceerd en afgebeeld in vitro bruikbaar voor een groot aantal toepassingen in cellulaire en tissue engineering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22