Experimentella och avbildningsmetoder för att pröva fibrinpropp Structures i normala och sjuka stater

Introduction

Skada på ett blodkärl s endotelbeklädnaden repareras genom den hemostatiska svar, eller bildningen av en blodpropp. När blodet tränger in i den extracellulära matrisen, vävnadsfaktorer aktiverar blodplättar i blodet som underlättar initiering av koagulationskaskaden. Nyckeln mekaniska komponenten i denna läkningsprocessen är fibrinmatrisen, sammansatt av fibrin fibrer som är mycket elastisk och kan upprätthålla stora krafter ^1-4. Många forskare har studerat bildandet struktur och funktion av fibrin i stor utsträckning i de senaste decennierna ^5-13.

Patienter med sjukdomar som diabetes mellitus och sickle cell har en ökad risk att utveckla trombotiska komplikationer såsom hjärtinfarkt, ischemisk hjärtsjukdom, och stroke ^14-19. Över 2 miljoner människor är nyligen diagnostiserats med diabetes mellitus varje år i USA. Det finns två typer av diabetes: typ I, där denorgan underlåter att producera tillräckliga mängder insulin, och typ II, där kroppen blir resistent mot insulin. Bland patienter med diabetes, är hjärt-kärlsjukdom (CVD) orsaken till 80% av sjuklighet och dödlighet i samband med sjukdomen ^20,21.

Sicklecellanemi (SCD) är en genetisk blodsjukdom som drabbar mer än 100.000 människor i USA ^22. SCD är en punkt-mutation sjukdom som orsakar röda blodkroppar för att bli halvmånformad, vilket gör det svårt för cellerna att passera genom blodvaskulaturen ^23. Båda dessa sjukdomstillstånd ökar chanserna att utveckla aterotrombotiska förhållanden i kroppen. En av anledningarna till detta är ett resultat av förändrad fibrin struktur och funktion i sjukdomstillstånd ^14,24-26.

I både diabetes och sicklecellanemi, det finns hyperkoagulation och hypofibrinolysis aktivitet som inducerar aterotrombos och hjärt-kärlsjukdom (CVD) jämfört med friska patienter ^17,27,28. Det är känt att hypofibrinolysis främjar ateroskleros progression och alstrar återkommande ischemiska händelser för patienter med prematur kranskärlssjukdom ^29. I den aktuella manuskriptet, undersökte vi den roll som fibrin fysikaliska egenskaper i denna särskilda miljö. Fibrinkoagel strukturer i icke-sjuka patienter består av tunna fibrer, större porer och generellt mindre tät ^14,24. Den ökade porositet och mindre täta fibrinkoagel hos friska patienter har visat sig underlätta fibrinolys ^16. I hyperthrombotic förhållanden såsom diabetiker och sicklecellanemi, det finns en ökning av fibrinogen produktion, vilket gör att fibrinogenkoncentration öka från normala nivåer av 2,5 mg / ml hos friska patienter ^30-33. Fibrinkoagel bildas i diabetiska patienter har befunnits vara mindre porös, styvare, har fler förgreningspunkter, och tätare i jämförelse med friska, icke-diaBetic patienter ^14,24,33-35. Den förändrade fibrin struktur är ett resultat av glykation mekanismer som förekommer i de proteiner som är involverade i koagelbildning. Icke-enzymatisk (irreversibel) glykation uppstår när glukosmolekyler binder till lysinrester på fibrinogenmolekylen, vilket hämmar mänskliga faktorn Xllla (FXIIIa) från rätt tvärbindnings glutamin och lysinrester ^33,36,37.

Den strukturella analysen av fibrin-nät, har studerats i stor omfattning på senare tid. I synnerhet har forskarna utnyttjat elektronmikroskopi och 3D-rekonstruktion av fibrin nätverk ^38, undersöktes hur både intravaskulära (endotelceller) celler och extravaskulära (fibroblaster och glatta muskelceller) celler påverkar fibrin struktur ^39, utnyttjad viskoelastiska och spektralanalys att analysera fibrin strukturer ^40, och utvecklade korrelationer mellan fibrin struktur och mekaniska egenskaper med hjälp av experimentella och beräknings närmar ⁴¹ in vitro fibrinogen glykation. För att simulera sicklecellanemi koagulering förhållanden, höjdes fibrinogenkoncentrationer blandat med sickle-cell hematokrit samlats in från patienter som gjort tidigare av vår grupp ^42. Dessa metoder användes för att undersöka struktur och funktioner som är involverade i fibrinkoagel bildning och fibrinolys i sjuka förhållanden, samt de mekanismer som inducerar CVD. Baserat på aktuell information om dessa sjukdomar, de glykerade fibrinkoagel strukturer var tätare med färre and mindre porer. De fibrinkoagel med röda blodkroppar från sicklecellpatienter (RBC) var också tätare och visas aggregering av RBC och agglomererade fibrin kluster. Detta är en väletablerad företeelse som har bestämts tidigare ^43. Det var också en hypotes att fibrinolys takten skulle vara betydligt lägre i glykerade fibrinkoagel med och utan minskad plasmin jämfört med friska, normala fibrin. Resultaten visade att för glycerade fibrinkoagel, var signifikant olika lys ränta resultat observerades endast under förhållanden med reducerad plasmin koncentration. Denna experimentella tekniken att använda konfokalmikroskopi erbjuder betydande fördelar jämfört med andra avbildningsmetoder eftersom cellerna och proteiner förblir i sitt nativa tillstånd, vilket möjliggör upptagning av video i realtid av koagulationsaktivitet. Denna metod för syntetiskt inducerande koagulering är också billigare och mer tidseffektivt än att få patientprover och filtrera bort individuellaproteiner och enzymer. Vidare, genom att använda separerade proteiner och enzymer för att syntetisera proppar ades proppar standardiserade så att det inte fanns variabilitet mellan prover som ett resultat av andra proteiner i plasmat.

Protocol

OBS: Följande protokoll följer de riktlinjer som fastställts av Institutional Review Board (IRB) vid Georgia Tech.

1. Blod Insamling och röda blodkroppar Isolering Tillvägagångssätt

1. Samla 40-120 ml blod från givare i 10 ml hepariniserade vacutainerrör. Starta PBMC (perifert blod mononukleära celler) isolering inom 4 timmar för insamlingen. Under denna tid, hålla blod vid RT.
   OBS: O / N lagring av blod i RT eller 4 ° C rekommenderas inte eftersom detta kommer att resultera i lägre PBMC avkastning.
2. Späd helblod 1: 1 i iskall (4 ° C) steril PBS.
3. Pipettera 10 ml iskall hydrofil polysackarid i en tom, steril 50 ml koniska rör. Försiktigt överföra utspätt helblod ovanpå hydrofil polysackarid.
4. Använd en 25 ml pipett i långsam inställning och pipett blod längs sidan av röret mycket långsamt. Se till att blodet inte blandas med sackarid före centrifugation eftersom den hydrofila polysackarid är giftigt för celler och annat kommer PBMC avkastningen bli lägre.
5. Centrifugera blodprov för 30 min vid 400 xg vid 4 ° C. Om tillgängligt, minska bromshastighet hos centrifugen till hälften av maximum för bättre separation efter centrifugering.
6. Sug bort plasma / blodplättsfraktionen av det centrifugerade blodprovet. Försiktigt aspirera bort hydrofila polysackarid lagret direkt ovanför den packade RBC lagret.
7. Samla 8-10 ml packade RBCs och späd 1: 1 med osterila 0,9% NaCl-saltlösning.

2. konfokalmikroskopi Utvärdering av Glykerat Clot Structures (Simulerad Diabetic proppar)

1. Upptining humant fibrinogen och fluorescensmärkt humant fibrinogen konjugatet vid 37 ° C.
2. Pipet följande i en 0,5 ml graderad mikrocentrifugrör.
   1. För friska, normala fibrinogen proppar, blanda humant fibrinogen med 10% fluorescerande humant fibrinogenkonjugatet i en 50 mM Tris / 100 mM NaCl-buffert vid en koncentration av 5 mg / ml.
   2. För artificiellt glykerat fibrinogen (för att simulera diabetic proppar), inkubera humant fibrinogen och 10% fluorescensmärkt fibrinogen konjugat i en 5 mM lösning av glukos upplöst i 50 mM Tris / 100 mM NaCl under en resulterande koncentration av 6,8 mg / ml.
3. Täck mikro-centrifugrör med användning av ett ogenomskinligt material för att undvika exponering för ljus. Inkubera rören i en 37 ° C vattenbad i 48 h.
4. Gör en kammare på en glasmikroskopskiva genom att anbringa en tunn adhesiv på två sidor av sliden.
5. Efter 48 timmars inkubationstid, förbereda reagens för fibrinbildning genom avfrostning FXIIIa och human alfa trombin vid RT.
6. Späd FXIIIa till 80 U / ml i 5 mM _{CaCl2-buffert.}
7. Späd trombin till 4 U / ml i 5 mM _{CaCl2-buffert.}
   1. För normala blodproppar, se till att de slutliga koncentrationerna av fibrinogen, FXIIIa, och trombin är 2,5 mg / ml, 20 U / ml, och 1 U / ml, respektive vid en volym av 50 | il.
   2. För glykerade proppar, se till att de slutliga koncentrationerna av fibrinogen, FXIIIa, och trombin är 3,4 mg / ml, 20 U / ml, och en U / ml vid en volym av 50 ul.
8. Omedelbart pipett 30 ul av fibrin lösningen in i kammaren som bildas av bindemedlet.
9. Placera en 22 mm x 22 mm glas täckglas med en tjocklek på 0,15 mm ovanpå de 2 lager lim. Försegla de öppna sidorna med tydlig lim för att förhindra fibrinkoaglet från att torka ut. Kontrollera att limmet inte interagerar med fibrinkoaglet.
10. Låt fibrinkoagel att polymerisera vid 21-23 ° C under 2 timmar innan konfokal avbildning.
11. Ta konfokalmikroskopi bilder av blodproppar med en konfokalmikroskop med 40X / 1,30 Olja M27-objektiv med en 488 nm Argon laser.

3. konfokalmikroskopi Utvärdering av fibrinkoagler Innehållande RBC från sicklecellpatienter

1. Upptining humant fibrinogen och fluorescensmärkt humant fibrinogen konjugatet vid 37 ° C.
2. Pipet följande i en 0,5 ml graderad mikrocentrifugrör.
   1. För friska, normala fibrinkoagel, blanda humant fibrinogen med 10% fluorescensmärkt humant fibrinogen konjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCl-buffert vid en koncentration av 5 mg / ml.
   2. För proppar innehållande SCD RBC, blanda humant fibrinogen och 10% fluorescensmärkt humant fibrinogen konjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCl så att den erhållna koncentrationen av fibrinogen är 10 mg / ml.
3. Märk isolerade RBK (både normala och de från sicklecellpatienter erhållits från RBC isoleringsprotokoll) med en cellmärkningslösning.
   1. Suspendera cellerna vid en densitet av 1 x 10 ⁶ per ml i någon vald serumfritt odlingsmedium.
   2. Lägg 5 pl / ml av cellsuspensionen till cellmärkningslösning. Blanda väl genom försiktig pipettering försiktigt.
   3. Centrifugera märkta upphängnings rören vid 1500 rpm i 5 minuter vid 37 ° C.
   4. Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i 37 ° C medium.
   5. Upprepa tvättförfarandet (3.3.4 och 3.3.5) två gånger.
4. Späd FXIIIa till 80 U / ml i 5 mM _{CaCl2-buffert.}
5. Späd trombin till 4 U / ml i 5 mM _{CaCl2-buffert.}
   1. För normala blodproppar, se till att de slutliga koncentrationerna av fibrinogen, FXIIIa, och trombin är 2,5 mg / ml, 20 U / ml, och en U / ml vid en volym av 50 ul.
   2. För proppar innehåller SCD RBC, se till att de slutliga koncentrationerna av fibrinogen, FXIIIa, och trombin är 5 mg / ml, 20 U / ml, och en U / ml vid en volym av 50 ul.
6. Pipettera 10 pl av de märkta RBC till fibrin lösningen. Pipett 30 ìl av fibrin med RBC på mikroskop glaset (se glida förberedelse för glycated proppar).
7. Låt fibrin polymerisera vid 21-23 ° C under 2 timmar innan konfokal avbildning.
8. Ta konfokala bilder av blodproppar som använder konfokalmikroskop, och utnyttja excitation lasrar med våglängder av 488 nm och 633 nm för att excitera fluorescerande fibrin och RBK.

4. konfokalmikroskopi Utvärdering av Fibrinolysis priser i glykerat Clot Structures

1. Upprepa konfokalmikroskopi protokollet av glykerade proppar (Protokoll Steg 2) för utvärdering fibrinolys takten i glykerade proppar.
2. Inte täta ändarna hos kammaren med tydlig adhesiv. Låt fibrinkoagel polymerisera under 1,5 h vid 21-23 ° C i en förseglad inneslutning som innehåller 250 ml vatten för att förhindra uttorkning.
3. Efter polymerisation, få bilder av blodproppar som använder konfokalmikroskop.
4. Pipettera plasmin i den öppna änden av kammaren och dispergera plasmin genom koaglet via kapillärverkan.
   1. Förnormala och glykerade fibrinolys experiment med normala koncentrationer, pipett 25 ul på 200 mikrogram / ml plasmin in i öppningen av kammaren.
   2. För glykerade proppar med reducerade koncentrationer, pipett 25 ^ vid 50 ug / ml in i öppningen av kammaren.
5. Använd tidsserier funktionen (se figur 1) i konfokalmikroskop programvara för att fånga video i realtid bilder av plasmin lyse proppen.
   1. Klicka förvärvsläge och välj sedan "Time Series." Välj antal cykler och inspelnings tidsintervall.

5. Beräkning Fibrinolysis priser

1. Bestäm lys hastigheten genom att ställa ett område (2,500 nm ²⁾ och beräkna hur lång tid som krävs för att lösa upp ett fast område av koagel. Beräkna lys hastigheten med hjälp av följande ekvation (Figur 2):
   

6. Statistisk analys av fibrinolys priser

1. Analysera lys data med hjälp av statistisk programvara analys. Utför en en-vägs ANOVA och en post hoc-Tukey-Kramer-test ^44,45.

Representative Results

Konfokalmikroskopi Analys av glykerat fibrinkoagel Strukturer

De konfokalmikroskopi bilder av normala och glykerade proppar presenteras i Figur 3. Konfokalmikroskopi analys av de normala och glykerade proppar avslöjar att glycerade proppar är tätare med mindre porer än de normala blodproppar både med och utan tillägg av FXIIIa under koagel polymerisation. I fig 3A och 3B, det finns en lägre fibrin koncentration som skapade en mindre tät struktur än de glykerade proppar med högre fibrin koncentration (figurerna 3C och 3D).

Ju större täthet observeras (antal fibrer per ytenhet) i glykerade proppar är ett resultat av den ökade fibrinogenkoncentration som uppstår hos personer med diabetes. I normala blodproppar, fibrin fibrerna var mer linjär och bildade längre fibrer vid polymerisation med FXIIIa, vilketsannolikt ett resultat av FXIIIa bilda tvärbindningar mellan fibrerna. I fallet med de glykerade proppar, verkade fibrerna att vara kortare, även med tillsats av FXIIIa. Detta är sannolikt ett resultat av polymerisationsprocessen som ändrades på grund av närvaron av glykerade regioner på fibrinogenmolekylen. Dessutom, från analys Figur 3, är sannolikt är det att fibertjockleken också minskade som ett resultat av glycation, vilket sannolikt varför fluorescens från glykerade fibrerna verkar ha en lägre intensitet.

Konfokalmikroskopi Analys av fibrinkoagler Innehållande RBC från sicklecellpatienter

De konfokala mikroskopbilder av fibrinkoaglet struktur proppar med normal och RBC från sicklecellpatienter presenteras i figur 4. Som förutspått konfokala bilder av fibrinkoagel innehållande RBC från sicklecellpatienter hade tätare strukturer än de hos friska fibrin cmassor. Figur 4A visar en homogen fördelning av fibrin och normala RBK. Emellertid, i figur 4B finns klumpar av fibrin och tomrum där ingen fibrinnätverk bildade. De röda blodkropparna från sicklecellpatienter inte homogent spridda, utan snarare var inbäddade i fibrin klumpar. Den ökade densiteten (antalet fibrer per ytenhet) var en följd av den ökade fibrinogenkoncentration som sker som ett resultat av hyperkoagulation i SCD-patienter. Vidare, den naturliga tendensen hos de röda blodkropparna från sicklecellpatienter att bilda aggregat alstrade klumpar av RBCs som blev sammanvävda i fibrinnätverket. Detta resulterade i bildandet av avvikande clot strukturer som är markant annorlunda i morfologi än de hos normala patienter. Från figur 4B, har det konstaterats att de röda blodkropparna från sicklecellpatienter orsakat större heterogenitet i fibrin provet och även orsakat en bredare geografisk utbredning av RBC i fibrin provet, när comjämfört med de friska fibrinkoagel med normala RBK. Däremot, de friska fibrinkoagel med normala röda blodkroppar visade en mer homogen dispersion av celler i hela fibrinnätverket.

Det är okänt hur mycket HbS (sickle-hemoglobin) polymeriserades i erytrocyterna från sicklecellpatienter och finns i proverna. Vad som är känt är dock att närvaron av något belopp av HbS orsakar större aggregering av celler i antal HBS molekyler per volymenhet vs. normala HbA molekyler. Pan et al. ⁴⁶ har visat detta fenomen i en studie där de jämförde aggregering / klustereffekter deoxi-HbS och, som jämförelse, av oxy-HbS och oxi-normal vuxen hemoglobin, HbA. Klustren bildas inom några sekunder efter beredning lösning och deras storlekar och antal förblev relativt stabilt i upp till 3 h. En av slutsatserna från studien var att båda oxy-HBS och deoxi-HBS molekyler klustrade på ett högre nummer hålasitet än oxi-HbA (normala) molekyler som en funktion av temperaturen. Avseende den aktuella studien, innebär detta att de röda blodkropparna från sicklecellpatienter sannolikt skulle kluster tillsammans, och fångade fibrin som det var att polymeriseras från fibrinogen prekursor.

Konfokalmikroskopi Lysis Rate Analys av Normal och glykerad proppar

Det antogs att fibrinolys priserna skulle vara större för normala fibrinkoagel jämfört med glycerade fibrinkoagel med minskad plasmin koncentration. För att testa denna hypotes, var konfokalmikroskopi för att bedöma de lyseringshastigheter av fibrinkoagel med tillsats av plasmin. Den genomsnittliga (medelvärde) lys andelen normala fibrin med tillsats av 200 pg / ml plasmin var 43,2 ± 26,5 nm ² / sek och den genomsnittliga (medelvärde) lys andelen glykosylerat fibrin med tillägg av 200 mikrogram / ​​ml plasmin 29,7 ± 11,2 nm ² / sek. För det glykerade fibrinkoagel lyserades med50 ug / ml plasmin, var den genomsnittliga lys takten 12,8 ± 3,1 nm ² / se. Sammanlagt 10 prov vardera (30 prover) användes för att bestämma de genomsnittliga och standardavvikelsevärden. Dessa värden presenteras i figur 5. Ades Ett p-värde på 0,05 används för att bestämma signifikans mellan de oberoende experimentella grupper. Analys av fibrinolys priser visade att värdet för de normala blodproppar jämfört med glukosiderade (simulerade diabetiker) proppar med minskad plasmin var signifikant olika.

Figur 1. Exempel på skärmbild från konfokalmikroskop programvara detailing metod för att erhålla realtids, kontinuerlig avbildning av fibrinkoagel lys. Klicka här för att se en större version av this siffra.

Figur 2. Exempel konfokala bild med fast yta som används för att beräkna lys takt fibrinkoagel prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Konfokala bilder av friska och glukosiderade (diabetes) fibrinkoagel. Grön fluorescens representerar fibrinnätverket. Den unglycated fibrin representerar proppar bildas i friska patienter, medan glykosylerat fibrin representerar proppar bildas hos diabetespatienter. (A) Unglycated fibrin utan tillsats av FXIIIa. (B) Unglycated fibrin med FXIIIa. (C (D) Glykerat fibrin med FXIIIa. Den röda skalan stapeln visar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Confocal bilder av friska fibrinkoagel med normala RBC och fibrinkoagel med RBC från sicklecellpatienter. Grön fluorescens representerar fibrinnätverket och magenta representerar märkt frisk och RBC från sicklecellpatienter. (A) Friska RBC i normal fibrin koncentration med FXIIIa och (B) Ökad fibrin med FXIIIa och RBC från en sicklecell patient. Den vita skalan stapeln visar 50 pm. De vita cirklar i bilden (B) indikerar igenkännliga halvmånformade RBK.

Figur 5. fibrinolys andelen normala fibrinkoagel jämfört med glykerat (diabetiker) fibrinkoagel och glykerade proppar med nedsatt plasmin koncentration. Statistisk signifikans bestämdes utifrån en envägs ANOVA och post hoc Tukey-Kramer multipla jämförelsetest. ANOVA-analys visade att det fanns en signifikant skillnad mellan lys ränta medel. Den Tukey-Kramer test visade att det fanns en signifikant skillnad i väg mellan normala proppar och proppar med minskad plasmin med ap <0,05. * Indikerar en signifikant skillnad från normala blodproppar.

Discussion

För att få meningsfulla uppgifter om strukturen på koagulering mekanismer i sjukdomstillstånd, är det viktigt att isolera de faktorer som koagulering att bestämma effekterna av proteiner och celler i dessa villkor. Detta protokoll har utvecklats i syfte att undersöka strukturen fibrinkoaglet hos diabetiker och SCD stater in vitro.

Det är nödvändigt att förstå de mekanismer som är involverade i fibrinbildning och fibrinolys vid sjukdomstillstånd sedan förändrade förhållanden ge hyperkoagulation, aterotrombos, och CVD. Från konfokala bilder som erhölls i detta experiment, är det uppenbart att hyperkoagulation aktiviteten sker i diabetes och SCD stater, vilket orsakar en ökad fibrinogenkoncentration. En ökning av fibrinogen koncentration resulterar i ett tätare fibrinnätverk med fler förgreningspunkter och mindre porer i hela nätverket. I fibrin nätverk av SCD patienter, inte bara där mer fibrin närvarande, but aggregeringsmedlet typ av erytrocyter ur sicklecellpatienter också förändrar strukturen på nätverket som den fångar fibrin i kluster. Den gytter av RBC från sicklecellpatienter minskar också porositet av fibrin kluster i nätverket, men tycks öka void koncentrationen i det stora nätet. Resultaten av fibrinolys analys av de glykerade proppar stödde hypotesen om lys takten i glykerade proppar blir lägre med minskad plasmin än för friska, normala blodproppar. Dock har resultaten inte lämna avgörande bevis om lys andelen glycerade proppar med normala koncentrationer av plasmin. Således kan man dra slutsatsen att för diabetespatienter med normal plasmin koncentration, kan det vara tillräckligt fibrinolys aktivitet för att bryta ned fibrinkoagel på ett effektivt sätt.

För experimenten utförs i denna forskningsstudie har isolerade proteiner och RBC används, istället för helblod och plasma. Genom att användaseparerade proteiner för att syntetisera fibrinkoagel kunde orsakerna till förändrade strukturer mellan normal kontra sjuka proppar bestämmas. Detta minskade kraftigt risken för att ha andra plasmaproteiner interfererar med strukturen och morfologin hos fibrinkoagel. Men genom att använda isolerade proteiner, är det viktigt att förvara och hantera celler och proteiner ordentligt, eftersom de är mer sårbara för celldöd och proteinnedbrytning.

Den konfokalmikroskopi avbildningsteknik som valts för denna studie berodde på möjligheten att få bilder av fibrinkoaglet strukturer och samtidigt behålla de naturliga trombotiska egenskaper hos cellerna och proteiner. Konfokalmikroskopi har också visat sig ge bättre kontrast och optisk upplösning av provet med nedsatt buller jämfört med traditionella ljus microcopy. Laserljuset riktas in i en hål som blockerar ofokuserat ljus från att komma in. Utnyttjande av konfokalmikroskopi undanröjt behovet förtillsats av fixativ kemikalier; sålunda cellerna och proteinerna kunde upprätthålla deras naturliga proteinaktivitet av formnings fibrinkoagel. Som ett resultat av de celler, proteiner och enzymer fungerat i sitt nativa tillstånd, som medger användning av konfokalmikroskopi för att fånga bilder och video av realtid aktivitet. Med konfokalmikroskopi, var 3D-bilder av fibrinkoagel fångas och videor av plasmin rötning av fibrinkoagel erhölls i realtid. När du lägger plasmin till koagel att fånga en tidsserie video av koagellys processen, var det viktigt att använda kapillärkraften via plasmin att homogent dispergera enzymet genom fibrinmatrisen. Detta gjordes för att säkerställa att den tillsatta plasmin koncentrationen var korrekt och tillät enzymet att lysera hela koagel, i motsats till det lokala området att plasmin tillsattes.

Metoden och de resultat som uppnåtts i denna studie liknade en studie gjord av Dunn et al, som fann att koagellyspriser var betydligt lägre hos diabetiker än kontrollpersoner ^25. I båda studierna var det signifikanta skillnader i lys andelen diabetiker (glykosylerat) proppar; kan dock det nuvarande protokollet korrekt representera diabetiker stater på grund av de sänkta plasmin nivåerna. Dessutom, i denna forskningsstudie fibrinolys fångades kontinuerligt i realtid med hjälp av konfokalmikroskop, i motsats till att analysera diskreta sektioner med olika tidsintervaller. Wooton et al., ⁴⁷ har undersökt fibrin koagellys och anställt en lys fronthastighet (cm / s) för att undersöka graden av lys för blodproppar. De använde konfokala bildanalys i sin studie att bestämma fronthastigheten. I den aktuella studien, i stället för en lys fronthastighet, var ett lys område hastighet används (på grund av det sätt som bilden analyserades på konfokala). För att ytterligare validera den metod som utvecklats i vår studie, har författarna i ⁴⁸ beskrivs en matematisk modell av fibrinpropp lys genom plasmin, i vilken de föreskriva lys fronthastigheten som funktion av den effektiva räntan konstant fibrinolys. Ekvationen erhålls enligt:

Här, är den effektiva hastighetskonstanten av fibrinolys, K är _en adsorptionen konstant, C _pm är plasmin koncentrationen, och ρ _Fn är densiteten av fibrin. Om den uppmätta kvantiteten (Mätt från det konfokala analysen i den aktuella studien) utnyttjas och kedjan regeln användes, leder detta till:

t "> Förutsatt bara en dimension förändras per tidsenhet leder till:

Således den effektiva räntan konstant fibrinolys för experimentet leder till:

Detta förhållande dragit slutsatsen att den effektiva räntan konstant fibrinolys ( ) Är en funktion av plasmin koncentrationen (C _pm) och området lys hastigheten .

Denna teknik är också viktiga för studiet av trombos iSCD patienter, eftersom det är lite känt om fibrin och koagulation mekanismer med avseende på denna sjukdom. Det har varit mycket få studier om effekterna av SCD om företagsstrukturen i fibrinkoagel; alltså de konfokala bilder som samlats in från denna studie ger sällan visualisering av koagel struktur med inbyggda halvmånformade RBC.

Att jämföra skillnaderna i väg mellan grupperna, använd en envägs ANOVA och post hoc Tukey-Kramer testet. En envägs ANOVA är en statistiskt test som används för att bestämma en statistiskt signifikant skillnad i väg mellan fria grupper. Den Tukey-Kramer efter test används för att jämföra medel från varje oberoende grupp och bestämma vilka gruppers sätt är statist olika varandra. Innan du utför en envägs ANOVA, det finns sex antaganden som måste uppfyllas för att säkerställa att resultaten är giltiga. De sex antagandena är: en kontinuerlig beroende variabel (lys hastighet), en oberoende variagänglig som består av två eller flera oberoende kategoriska grupper (normal, glycated och glycated med reducerad plasmin), och självständigt observerade data i varje grupp så att en händelse inträffar påverkar inte en annan händelse (Detta försäkrar att det inte finns någon överlappning i data.) , datamängden som inte innehåller några väsentliga avvikare, normalfördelade uppgifter som kontrollerats av Shapiro-Wilk statistiskt test, och homogenitet variationer i de uppgifter som kontrollerats av Levene statistiskt test. När dessa antaganden möttes, var en enkelriktad ANOVA och post hoc Tukey-Kramer test med ett p-värde på 0,05 som tröskeln för att bestämma statistisk signifikans. För en rigorös detalj av envägs ANOVA och post-hoc Tukey-Kramer testet, se ^44,45.

Sammantaget ger denna metod för avbildning av normala och onormala (pga sjukdomstillstånd) fibrinkoagel i deras infödda stater. Metoden ger också information för realtids avbildning av koagellys samtsåsom statistisk analys av lys hastigheter. Den lätthet med vilken trombosen kan produceras och avbildas in vitro är användbar för ett brett spektrum av tillämpningar inom cellulär och vävnadsteknik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22