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Medicine

Experimentelle und Bildgebende Verfahren für die Prüfung Fibringerinnsel Strukturen in normalen und erkrankten Staaten

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

Schädigung eines Blutgefäßes Endothelauskleidung durch die hämostatische Reaktion oder die Bildung eines Blutgerinnsels repariert. Wenn Blut dringt in die extrazelluläre Matrix, Gewebefaktoren aktiviert Blutplättchen in den Blutstrom, die Einleitung der Gerinnungskaskade zu erleichtern. Der Schlüssel mechanische Komponente dieser Heilungsprozess ist die Fibrinmatrix, von Fibrin Fasern, die hochelastisch sind zusammengesetzt und kann große Kräfte 1-4 zu erhalten. Viele Forscher haben die Bildung Struktur und Funktion von Fibrin ausführlich in den vergangenen Jahrzehnten 5-13 untersucht.

Patienten mit Krankheiten, wie Diabetes mellitus und Sichelzellen ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von thrombotischen Komplikationen wie Herzinfarkte, ischämische Herzerkrankungen und Schlaganfälle 14-19. Über 2 Millionen Menschen neu mit Diabetes mellitus diagnostiziert jedes Jahr in den Vereinigten Staaten. Es gibt zwei Arten von Diabetes: Typ I, wo dieKörper nicht ausreichende Mengen an Insulin und Typ II, wo der Körper wird resistent gegen Insulin zu produzieren. Unter Diabetikern, kardiovaskulärer Erkrankung (CVD) ist die Ursache für die 80% der Morbidität und Mortalität, die mit der Krankheit assoziiert 20,21.

Sichelzellanämie (SCD) ist eine genetisch bedingte Blutgerinnungsstörung, die mehr als 100.000 Menschen in den Vereinigten Staaten 22 wirkt. SCD ist eine Punkt-Mutation Krankheit, die roten Blutkörperchen bewirkt, halbmondförmige geworden, dass es schwierig für die Zellen durch die Blutgefäßsystem 23 übergeben. Beide Krankheitszuständen erhöht die Chancen der Entwicklung atherothrombotischer Bedingungen im Körper. Einer der Gründe dafür ist, auf einer veränderten Fibrin Struktur und Funktion in erkrankten Zuständen 14,24-26.

In beiden Diabetes und Sichelzellanämie, gibt es Hyperkoagulation und Hypofibrinolyse Aktivität, die Atherothrombose und kardiovaskulären Erkrankungen induziert (CVD) im Vergleich zu gesunden Patienten 17,27,28. Es ist bekannt, dass Hypofibrinolyse fördert Atherosklerose Progression und erzeugt rezidivierende ischämische Ereignisse bei Patienten mit vorzeitigem Koronararterienerkrankung 29. In der aktuellen Manuskript untersuchten wir die Rolle von Fibrin physikalischen Eigenschaften in diesem besonderen Ambiente. Fibringerinnsel Strukturen in nicht erkrankten Patienten werden von dünnen Fasern, größere Poren, und in der Regel weniger dicht 14,24 zusammen. Die erhöhte Porosität und weniger dicht Fibringerinnseln in gesunden Patienten wurde gefunden, dass die Fibrinolyse 16 erleichtern. In hyperthrombotischen Bedingungen wie diabetische und Sichelzellanämie, gibt es eine Erhöhung in der Produktion von Fibrinogen, wodurch der Fibrinogenkonzentration um vom Normalniveau von 2,5 mg / ml in gesunden Patienten 30-33 erhöhen. Fibringerinnseln in diabetischen Patienten gebildet haben sich als weniger porös, steifer, mehr Verzweigungspunkte, und dichter im Vergleich zu gesunden, nicht-diaBetic Patienten 14,24,33-35. Die veränderte Fibrinstruktur ist ein Ergebnis der Glykierung Mechanismen, die in den Proteinen der Gerinnselbildung beteiligt auftreten. Nichtenzymatische (irreversibel) Glykosylierung tritt auf, wenn Glukose-Moleküle binden an Lysinresten auf der Fibrinogen-Molekül, das die menschliche Faktor XIIIa (FXIIIa) ordnungsgemäß Vernetzungs Glutamin und Lysin-Reste 33,36,37 hemmt.

Die Strukturanalyse von Fibrin-Netzwerken wurde ausgiebig vor kurzem untersucht. Insbesondere haben Forscher Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion von Fibrin-Netzwerken 38, untersucht, wie auch intravaskuläre (endotheliale Zellen) und extravaskuläre (Fibroblasten und glatte Muskelzellen) Zellen beeinflussen Fibrinstruktur 39, verwendet viskoelastischen und Spektralanalyse zu Fibrin Strukturen 40 analysiert und verwendet entwickelten Korrelationen zwischen Fibrin Struktur und mechanischen Eigenschaften mit experimentellen und theoretischen Ansätze 41 in vitro Glykierung Fibrinogen induzieren. Um Sichelzellanämie Gerinnungsbedingungen zu simulieren, wurden erhöhte Fibrinogenkonzentrationen mit Sichelzellen Hämatokrit von Patienten gesammelt, wie zuvor von unserer Gruppe 42 getan gemischt. Diese Verfahren wurden verwendet, um die Struktur und die Funktionen in Fibringerinnselbildung und Fibrinolyse bei Krankheitszuständen beteiligt sind, sowie die Mechanismen, die CVD induzieren zu untersuchen. Basierend auf den aktuellen Informationen über diese Krankheiten waren die glykosylierten Fibringerinnsel Strukturen dichter mit weniger einnd kleineren Poren. Die Fibringerinnsel mit roten Blutzellen von Sichelzellpatienten (RBCs) wurden ebenfalls dichter und angezeigt Aggregation der Erythrozyten und agglomeriert Fibrin Clustern. Dies ist ein gut etabliertes Phänomen, das zuvor 43 festgestellt hat. Es wurde auch vermutet, dass die Fibrinolyse Quote wäre in glykosylierten Fibringerinnsel mit und ohne reduzierte Plasmin im Vergleich zu gesunden, normalen Fibrin deutlich geringer. Die Ergebnisse zeigten, dass für glykosyliertes Fibringerinnseln, signifikant Lyserate Ergebnisse wurden nur unter den Bedingungen einer reduzierten Plasminkonzentration beobachtet. Dieses experimentelle Technik der Verwendung der konfokalen Mikroskopie bietet signifikante Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren, weil die Zellen und Proteine ​​in ihrem nativen Zustand, der die Erfassung von Echtzeitvideo der Gerinnungsaktivität ermöglicht bleibt. Diese Methode synthetisch induzierenden Blutgerinnung ist auch billiger und zeiteffizienter als Erhalt von Patientenproben und Ausfiltern einzelneProteine ​​und Enzyme. Ferner ergeben sich mit getrennten Proteine ​​und Enzyme, um Gerinnsel zu synthetisieren, die Gerinnsel wurden standardisiert, so dass es nicht die Variabilität zwischen den Proben als Folge von anderen Proteinen im Plasma.

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Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll befolgt die vom Institutional Review Board (IRB) an der Georgia Tech Richtlinien.

1. Blutentnahme und Rotes Blutkörperchen Isolierungsverfahren

  1. Sammeln Sie 40 bis 120 ml Blut von Spendern in 10 ml Heparin-Vacutainer-Röhrchen. Starten PBMC (periphere Blut mononukleären Zellen) Isolierung innerhalb von 4 Stunden der Sammlung. Während dieser Zeit halten Blut bei RT.
    HINWEIS: O / N Lagerung von Blut in RT oder bei 4 ° C wird nicht empfohlen, da dies zu niedrigeren PBMC Ausbeute führen.
  2. Verdünnen Sie Vollblut 1: 1 in eiskaltem (4 ° C) sterile PBS.
  3. Je 10 ml eiskaltem hydrophile Polysaccharid in eine leere, sterile 50 ml konischen Röhrchen. Verdünntem Vollblut übertragen Sie leicht über der hydrophilen Polysaccharid.
  4. Verwenden Sie eine 25 ml Pipette in Zeiteinstellung und Pipetten Blut an der Seite des Rohres sehr langsam. Sicherzustellen, dass das Blut nicht mit der Saccharid vor Centri vermischtfugation weil das hydrophile Polysaccharid Zellen toxisch, und ansonsten wird die PBMC Ausbeute niedriger sein.
  5. Zentrifuge Blutproben für 30 min bei 400 × g bei 4 ° C. Falls verfügbar, verringern die Bremsgeschwindigkeit der Zentrifuge auf die Hälfte der maximalen zur besseren Trennung nach der Zentrifugation.
  6. Absaugen des Plasmas / Thrombozytenfraktion der zentrifugierten Blutprobe. Sorgfältig absaugen die hydrophile Polysaccharid Schicht direkt über der RBC-Schicht verpackt.
  7. Sammeln Sie 8-10 ml gepacktes Erythrozyten und verdünnt 1: 1 mit unsterilen 0,9% NaCl Kochsalzlösung.

2. konfokale Mikroskopie Bewertung der Glykiertes Clot Strukturen (Simulated Diabetische Blutgerinnsel)

  1. Abzutauen Humanfibrinogen und fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat bei 37 ° C.
  2. Pipettieren Sie die folgenden zu einem 0,5 ml-Messmikrozentrifugenröhrchen.
    1. Für die gesunde, normale Fibrinogen gerinnt, mischen, Fibrinogen mit 10% fluoreszenzmarkierten FibrinogenKonjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl-Puffer bei einer Konzentration von 5 mg / ml.
    2. Künstlich glykiertes Fibrinogen (diabetische Gerinnsel zu simulieren), Inkubation Humanfibrinogen und 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einer 5 mM Lösung von Glucose in 50 mM Tris / 100 mM NaCl bei einer resultierenden Konzentration von 6,8 mg / ml.
  3. Umfassen die Mikrozentrifugenröhrchen mit einem undurchsichtigen Material, um Belichtung zu vermeiden. Die Röhrchen in ein 37 ° C Wasserbad für 48 Stunden inkubieren.
  4. Machen Sie eine Kammer auf einen Glasobjektträger durch Aufbringen eines dünnen Klebe auf 2 Seiten des Schlittens.
  5. Nach 48 Stunden Inkubationszeit vorzubereiten Reagenzien für die Fibrinbildung durch Auftauen FXIIIa und Menschen alpha Thrombin bei RT.
  6. Verdünne FXIIIa bis 80 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
  7. Verdünnte Thrombin bis 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
    1. Für normale gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 2,5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
    2. Für die glykierte gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 3,4 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
  8. Unmittelbar Je 30 ul der Fibrin-Lösung in die durch den Kleber gebildete Kammer.
  9. Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,15 mm auf der Oberseite der zwei Klebstoffschichten. Verschließen Sie die offenen Seiten mit klaren Klebstoff, um das Fibringerinnsel austrocknet. Sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht mit dem Fibringerinnsel interagieren.
  10. Lassen Sie die Fibringerinnsel zu 21-23 ° C für 2 Stunden, bevor die konfokale Abbildung zu polymerisieren.
  11. Nehmen Sie die konfokale Mikroskopie Bilder der Gerinnsel mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Oil M27 Objektiv mit einem 488 nm Argon-Laser.

3. konfokale Mikroskopie Bewertung von Fibringerinnseln haltigen Erythrozyten von Sichelzellanämie Patienten

  1. Abzutauen Humanfibrinogen und fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat bei 37 ° C.
  2. Pipettieren Sie die folgenden zu einem 0,5 ml-Messmikrozentrifugenröhrchen.
    1. Für den gesunden, normal Fibringerinnsels mischen menschlichem Fibrinogen mit 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl-Puffer bei einer Konzentration von 5 mg / ml.
    2. Für die Gerinnsel enthaltenden SCD RBCs mischen Humanfibrinogen und 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl, daß die resultierende Konzentration der Fibrinogen 10 mg / ml.
  3. Beschriften Sie die isolierten Erythrozyten (sowohl normale als auch jene von Sichelzellpatienten von der RBC-Isolierungsprotokoll erhalten wird) mit einem Zell-Markierungslösung.
    1. Suspend-Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 pro ml in jeder gewählten serumfreien Kulturmedium.
    2. Mit 5 ul / ml der Zellsuspension in Zellmarkierungslösung. Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren vorsichtig.
    3. Zentrifugieren der markierten Suspension Röhrchen bei 1.500 UpM für 5 min bei 37 ° C.
    4. Entfernen Sie den Überstand und sanft wieder die Zellen in 37 ° C Medium.
    5. Wiederholen Sie den Waschvorgang (3.3.4 und 3.3.5) zwei weitere Male.
  4. Verdünne FXIIIa bis 80 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
  5. Verdünnte Thrombin bis 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
    1. Für normale gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 2,5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
    2. Für die Gerinnsel enthaltenden SCD RBCs, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin werden 5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
  6. Je 10 ul der markierten roten Blutkörperchen in das Fibrin-Lösung. Pipette 30 ul des Fibrin mit Erythrozyten auf das Mikroskop Glas (siehe Vorbereitung gl schiebenycated Blutgerinnsel).
  7. Ermöglichen das Fibrin auf 21-23 ° C für 2 Stunden, bevor die konfokale Abbildung zu polymerisieren.
  8. Nehmen konfokale Bilder der Gerinnsel mit dem konfokalen Mikroskop, und nutzen Anregungslaser mit Wellenlängen von 488 nm und 633 nm, um die Fluoreszenz-markierten Fibrin und Erythrozyten anregen.

4. konfokale Mikroskopie Bewertung der Fibrinolyse Preise in Glykiertes Clot Strukturen

  1. Wiederholen der Konfokalmikroskopie Protokoll von glykiertem Blutgerinnsel (Protocol Schritt 2) für die Fibrinolyse Rate Auswertung in glykierten Gerinnsel.
  2. Verschließen Sie nicht die Enden der Kammer mit klaren Klebstoff. Lassen Sie die Fibringerinnsel für 1,5 h bei 21-23 ° C in einem geschlossenen Gehäuse, das 250 ml Wasser, um Austrocknung zu verhindern polymerisieren.
  3. Nach der Polymerisation erhalten Bilder der Gerinnsel mit dem konfokalen Mikroskop.
  4. Pipette Plasmin in das offene Ende der Kammer und verteilen das Plasmin durch das Gerinnsel durch Kapillarwirkung.
    1. Fürder normale und der glykierten Fibrinolyse Experimente mit normalen Konzentrationen, Pipetten 25 ul mit 200 ug / ml Plasmin in die Öffnung der Kammer.
    2. Für die glykierte Gerinnseln mit reduzierten Konzentrationen Pipette 25 ul bei 50 ug / ml in die Öffnung der Kammer.
  5. Verwenden Sie den Zeitreihen-Funktion (siehe Abbildung 1) in der konfokalen Mikroskop-Software, um Echtzeit-Videoaufnahmen von der Plasmin Lyse des Gerinnsels zu erfassen.
    1. Klicken Erfassungsmodus und wählen Sie "Time Series". Wählen Sie die Anzahl der Zyklen und die Aufnahmezeitintervall.

5. Berechnung Fibrinolyse Preise

  1. Bestimmen Sie die Lyse Rate, indem Sie einen Bereich (2500 & mgr; m 2) und der Berechnung der verstrichenen Zeit erforderlich ist, um einen festen Bereich der Gerinnsel aufzulösen. Errechnen Lyserate Verwendung der folgenden Gleichung (2):
    Gleichung 1

6. Statistische Analyse der Fibrinolyse Preise

  1. Analysieren Sie die Lyse-Daten mit Hilfe statistischer Analyse-Software. Führen Sie eine one-way ANOVA und post hoc Tukey-Kramer-Test 44,45.

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Representative Results

Konfokale Mikroskopie Analyse der Glykiertes Fibringerinnsel Strukturen

Konfokales Mikroskopiebilder von normalen und glykiertem Blutgerinnsel sind in Abbildung 3 dargestellt. Die konfokale Mikroskopie-Analyse der normalen und glykiertem Blutgerinnsel zeigt, dass glykiertes Blutgerinnsel sind dichter mit kleineren Poren als die normalen Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Zusatz von FXIIIa während der Gerinnsel Polymerisation. In 3A und 3B ist es eine untere Fibrinkonzentration die eine weniger dichte Struktur als die glykierte Gerinnseln mit höheren Fibrinkonzentration (3C und 3D) erzeugt.

Der beobachtete höhere Dichte (Anzahl der Fasern pro Flächeneinheit) in den glykosylierten Blutgerinnsel ist ein Ergebnis der erhöhten Fibrinogen-Konzentration, die bei Menschen mit Diabetes auftritt. Bei den normalen Blutgerinnsel waren die Fibrinfasern linearer und gebildet längere Fasern bei der Polymerisation mit FXIIIa, dieist wahrscheinlich eine Folge der FXIIIa bilden Vernetzungen zwischen den Fasern. Im Falle der glykierten Gerinnsel schienen die Fasern kürzer zu sein, auch mit Zusatz von FXIIIa. Dies ist wahrscheinlich das Ergebnis der Polymerisation, die durch die Gegenwart von glykiertem Regionen auf dem Fibrinogenmolekül verändert wurde. Außerdem ergibt sich aus der Analyse Abbildung 3, ist es wahrscheinlich, dass die Faserdicke wurde auch als Ergebnis der Glykierung, was wahrscheinlich ist, weshalb die Fluoreszenz von den glykosylierten Fasern scheinen eine geringere Intensität haben reduziert.

Konfokale Mikroskopie Analyse von Fibringerinnseln haltigen Erythrozyten von Sichelzellen Patienten

Die konfokale Mikroskopbilder des Fibringerinnsels Struktur von Gerinnseln mit normalen und RBCs von Sichelzellpatienten sind in Figur 4 dargestellt. Wie vorausgesagt, die konfokale Bilder der Fibrinklumpen, enthaltend Erythrozyten Sichelzellpatienten hatten dichtere Struktur als die der gesunden Fibrin cLose. 4A zeigt eine homogene Verteilung von Fibrin und normalen RBCs. Jedoch in 4B gibt es Klumpen von Fibrin und Hohlräume in dem kein Fibrinnetzwerk gebildet. Die RBCs von Sichelzellpatienten waren nicht homogen verteilt, sondern wurden in der Fibrin-Klumpen eingebettet. Die erhöhte Dichte (Anzahl der Fasern pro Flächeneinheit) ist ein Ergebnis der erhöhten Fibrinogen-Konzentration, die als Folge von Hyperkoagulabilität in SCD-Patienten auftritt. Weiterhin ist die natürliche Tendenz der RBCs von Sichelzellpatienten zu Aggregaten erzeugt Klumpen von RBCs, die in das Fibrin-Netzwerk verwoben wurde. Dies resultierte in der Bildung aberranter Gerinnsel Strukturen, die in der Morphologie als die bei normalen Patienten deutlich unterschiedlich sind. Aus Figur 4B ist zu beobachten, dass die RBCs von Sichelzellpatienten verursacht größer Heterogenität in der Fibrin-Probe und verursachte auch eine größere räumliche Verteilung der RBCs in der Fibrin-Probe, im comVergleich zu den gesunden Fibringerinnsel mit normaler Erythrozyten. Im Gegensatz dazu sind die gesunde Fibringerinnsel mit normalen RBCs angezeigten eine homogenere Dispersion der Zellen in der gesamten Fibrinnetzwerk.

Es ist nicht bekannt, wie viel HbS (Sichel Hämoglobin) wurde in den Erythrozyten Sichelzellpatienten polymerisiert und in den Proben enthalten sind. Bekannt ist jedoch, dass die Anwesenheit von jeder Menge an HbS verursacht höhere Aggregation von Zellen, die in Reihe von HbS-Moleküle pro Volumeneinheit gegenüber normalen HbA Molekülen. Pan et al. 46 haben dieses Phänomen in einer Studie, in der sie die Aggregation / Clustering Wirkungen deoxy-HbS Vergleich gezeigt, und, zum Vergleich, von Oxy-HbS und Oxy-normalen erwachsenen Hämoglobin HbA. Die innerhalb von wenigen Sekunden nach der Zubereitung der Lösung und deren Größe und Anzahl gebildeten Cluster blieben für 3 h relativ konstant. Eine der Schlussfolgerungen aus der Studie war, dass die beiden Sauerstoff-HbS und deoxy-HbS-Moleküle mit einer höheren Zahl den Cluster-sität als Oxy-HbA (normal) Moleküle als Funktion der Temperatur. Bezüglich der aktuellen Studie bedeutet dies, daß die RBCs von Sichelzellpatienten waren wahrscheinlich zusammenballen und gefangen Fibrin, wie es aus der Fibrinogen-Vorläufer polymerisiert.

Konfokale Mikroskopie Lyse Rate Analyse der normalen und Glykiertes Blutgerinnsel

Es wurde vermutet, dass die Fibrinolyse Kursen hätte mehr für normale Fibringerinnseln im Vergleich zu glykosyliertem Fibringerinnsel mit verminderter Plasminkonzentration sein. Um diese Hypothese zu testen, wurde die konfokale Mikroskopie verwendet, um die Lyse von Fibringerinnseln Raten unter Zusatz von Plasmin zu beurteilen. Die durchschnittliche (mittlere) Lyse Raten normalen Fibrin unter Zusatz von 200 ug / ml Plasmin betrug 43,2 ± 26,5 & mgr; m 2 / sec und die durchschnittliche (mittlere) Lyse Raten von glykiertem Fibrin unter Zusatz von 200 ug / ml Plasmin 29,7 ± 11,2 & mgr; m 2 / s. Für glykierten Fibringerinnsel mit lysiert50 ug / ml Plasmin, die durchschnittliche Lyse Rate betrug 12,8 ± 3,1 & mgr; m 2 / se. Insgesamt wurden 10 Proben jeweils (30 Proben) wurden verwendet, um die Durchschnittswerte und Standardabweichungen zu bestimmen. Diese Werte sind in Figur 5 dargestellt. Ein p-Wert von 0,05 wurde verwendet, um die Signifikanz zwischen den unabhängigen Versuchsgruppen festzustellen. Analyse der Fibrinolyse Raten zeigten, dass der Wert für den normalen Gerinnsel gegenüber den glykosylierten (simulierte diabetisch) Gerinnsel mit verminderter Plasmin waren signifikant unterschiedlich.

Figur 1
Abbildung 1. Beispielbildschirmfoto von konfokalen Mikroskop-Software detailliert Verfahren zum Erhalt von Echtzeit, kontinuierliche Darstellung von Fibringerinnsel-Lyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thiWert.

Abbildung 2
Abbildung 2. Beispiel konfokale Abbildung mit festen Bereich verwendet werden, um die Lyse Rate von Fibringerinnsel Probe zu berechnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
3. Die konfokale Bilder von gesunden und glykosyliertem (Diabetiker) Fibringerinnseln. Das grüne Leuchten repräsentiert das Fibrin-Netzwerk. Die nicht glykosylierten Fibrin stellt Blutgerinnsel in gesunden Patienten gebildet, während glykosylierten Fibrin stellt Blutgerinnseln bei Patienten mit Diabetes gebildet. (A) nicht glykosylierten Fibrin ohne Zusatz von FXIIIa. (B) nicht glykosylierten Fibrin mit FXIIIa. (C (D) Glykiertes Fibrin mit FXIIIa. Der rote Balken zeigt Skala 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Die konfokale Bilder von gesunden Fibringerinnsel mit normaler Erythrozyten und Fibringerinnseln mit RBCs von Sichelzellen-Patienten. Das grüne Leuchten repräsentiert das Fibrinnetzwerk und Magenta steht für gesunde und RBCs von Sichelzellen-Patienten gekennzeichnet. (A) Gesunde Erythrozyten im Normal Fibrinkonzentration mit FXIIIa und (B) erhöhte Fibrin mit FXIIIa und Erythrozyten aus einer Sichelzell Patienten. Der weiße Maßstabsbalken zeigt 50 um. Die weißen Kreise in Bild (B) zeigen, erkennbar sichelförmigen roten Blutkörperchen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Fibrinolyse Raten von normalen Fibringerinnseln im Vergleich zu glykiert (Diabetiker) Fibringerinnseln und glykiertem Blutgerinnsel mit reduzierten Plasminkonzentration. Die statistische Signifikanz wurde auf der Grundlage einer Einweg-ANOVA und post hoc Tukey-Kramer Fachvergleichstest bestimmt. Die ANOVA-Analyse zeigte, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen Lyserate Mittel. Der Tukey-Kramer-Test zeigte, dass es einen signifikanten Unterschied in der Mittel zwischen den normalen Gerinnseln und Gerinnsel mit verminderter Plasmin mit einem p <0,05. Das * zeigt einen signifikanten Unterschied von normalen Gerinnsel.

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Discussion

Um aussagekräftige Daten über die Struktur des Gerinnungsmechanismen bei Krankheitszuständen zu erhalten, ist es wichtig, die Faktoren der Blutgerinnung beteiligt sind, um die Effekte der Proteine ​​und Zellen unter diesen Bedingungen zu bestimmen, zu isolieren. Dieses Protokoll wurde zum Zweck der Untersuchung der Struktur des Fibringerinnsels bei diabetischen und SCD Zustände in vitro entwickelt.

Es ist notwendig, um die Mechanismen in der Fibrinbildung und Fibrinolyse bei Krankheitszuständen beteiligt sind, da geänderte Bedingungen verursachen hypercoagulation, Atherothrombose und CVD verstehen. Aus den konfokalen Bildern in diesem Experiment erhalten wurde, ist es offensichtlich, dass Hyperkoagulabilität Aktivität bei diabetischen und SCD Zustände, die eine erhöhte Konzentration an Fibrinogen verursacht auftritt. Eine erhöhte Konzentration an Fibrinogen zu einer dichteren Fibrinnetzwerk mit Verzweigungspunkten und kleineren Poren im gesamten Netzwerk. In Fibrinnetzwerken der SCD-Patienten, gibt es nicht nur mehr vorhanden Fibrin, but die aggregierende Natur der Erythrozyten Sichelzellpatienten verändert auch die Struktur des Netzwerks, wie es einschließt Fibrin in Cluster. Das Konglomerat von RBCs von Sichelzellpatienten vermindert auch Porosität der Fibrin-Cluster im Netzwerk, aber scheint Hohlraumkonzentration im Gesamtnetz zu erhöhen. Die Ergebnisse der Analyse der Fibrinolyse glykierten Gerinnsel unterstützten die Hypothese der Lyserate in glykierten Gerinnsel niedriger eingeschränkter Plasmin als die von gesunden, normalen Gerinnsel. Allerdings haben die Ergebnisse nicht schlüssig nachzuweisen Lyse Raten von glykiertem Blutgerinnsel mit normalen Konzentrationen von Plasmin. Somit kann gefolgert werden, daß bei diabetischen Patienten mit normaler Plasminkonzentration, kann es ausreichend sein, Fibrinolyseaktivität Fibringerinnseln in effizienter Weise abgebaut werden.

Für die Experimente wurden in dieser Studie durchgeführt wurden isolierte Proteine ​​und RBCs verwendet, anstelle von Vollblut und Plasma. Durch die Verwendung vongetrennten Proteine ​​auf die Fibringerinnsel synthetisieren, konnten die Ursachen für die veränderten Strukturen des Normal vs. erkrankten Gerinnsel bestimmt werden. Diese die Möglichkeit von anderen Plasmaproteinen stören die Struktur und die Morphologie der Fibringerinnseln stark reduziert. Unter Verwendung von isolierten Proteinen, ist es entscheidend, die Lagerung und Handhabung der Zellen und Proteine ​​richtig, da sie anfällig für Zelltod und Proteinabbau sind.

Konfokales Mikroskopieabbildungstechnik für diese Studie ausgewählt wurde aufgrund der Fähigkeit, Bilder des Fibringerinnsels Strukturen zu erhalten unter Beibehaltung der natürlichen thrombotischen Eigenschaften der Zellen und Proteine. Die konfokale Mikroskopie wurde auch gezeigt, um einen verbesserten Kontrast und die optische Auflösung der Probe mit reduziertem Rauschen im Vergleich zu herkömmlichen Lichtmikroskopie zu geben. Das Laserlicht wird in ein Stiftloch, dass unscharfe Blöcke Eintritt von Licht geleitet. Ausnutzung der konfokalen Mikroskopie überflüssig gemacht dasZugabe von Fixierungschemikalien; wodurch die Zellen und Proteine ​​konnten ihre natürliche Protein Aktivität zur Bildung von Fibringerinnseln aufrechtzuerhalten. Dadurch werden die Zellen, Proteinen und Enzymen funktioniert im nativen Zustand, was die Verwendung der konfokalen Mikroskopie für die Aufnahme von Bildern und Videos von Echtzeit-Aktivität. Mit konfokaler Mikroskopie wurden 3D-Bilder der Fibringerinnseln erfasst und Videos von Plasmin-Verdau von Fibringerinnseln in Echtzeit erhalten. Beim Hinzufügen Plasmin um das Gerinnsel, eine Zeitreihe Video der Gerinnselauflösung Prozess zu erfassen, war es wichtig, Kapillarwirkung über Plasmin verwenden, um homogen zu verteilen, die das Enzym durch die Fibrinmatrix. Dies wurde getan, um sicherzustellen, daß das zugegebene Plasmin-Konzentration genau und erlaubt dem Enzym, das gesamte Blutgerinnsel auf den lokalen Bereich, der Plasmin zugegeben lysieren, in Kontrast.

Das Verfahren und die in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich wie bei einer Untersuchung von Dunn et al, der diese Gerinnsellyse gefunden getanRaten waren bei Diabetikern als Kontrollgruppe 25 deutlich geringer. In beiden Studien gab es signifikante Unterschiede in Lyse Raten der diabetischen (glykiertes) Blutgerinnsel; jedoch kann das aktuelle Protokoll genau darzustellen diabetischen Zuständen wegen der reduzierten Plasminmengen. Zusätzlich ist in dieser Studie Fibrinolyse wurde kontinuierlich in Echtzeit unter Verwendung des konfokalen Mikroskops, im Gegensatz zu analysieren diskreten Abschnitten zu verschiedenen Zeitintervallen erfasst. Wooton et al. 47 wurden Fibringerinnsel-Lyse untersucht und verwendet eine Lyse Frontgeschwindigkeit (cm / s), die Geschwindigkeit der Lyse für Blutgerinnsel zu untersuchen. Sie benutzten die konfokale Bildanalyse in ihrer Studie, um die Frontgeschwindigkeit zu bestimmen. In der vorliegenden Studie, anstelle einer Lyse Frontgeschwindigkeit wurde eine Lyse Flächengeschwindigkeit verwendet (wegen der Art der Aufnahme des Bildes auf der konfokalen ausgewertet). Zur weiteren Validierung des in unserer Studie entwickelten Methode, haben die Autoren in 48 ein mathematisches Modell beschrieben Fibrin-Gerinnsel-Lyse durch Plasmin, in der sie die Lyse Frontgeschwindigkeit als eine Funktion des effektiven Geschwindigkeitskonstante der Fibrinolyse verschreiben. Die Gleichung ist gegeben durch:
Gleichung 2

Hier, Gleichung 3 repräsentiert die effektive Geschwindigkeitskonstante der Fibrinolyse, K a ist die Adsorption konstanten, C pm der Plasmin-Konzentration und ρ Fn ist die Dichte von Fibrin. Wenn der Messgröße Gleichung 4 (Aus dem konfokalen Analyse in der aktuellen Studie gemessen) verwendet wird und der Kettenregel verwendet wird, führt dies zu:
Gleichung 5

t "> Unter der Annahme, nur eine Dimension verändert sich pro Zeiteinheit führt zu:

Gleichung 6

Gleichung 7

So ist die effektive Geschwindigkeitskonstante der Fibrinolyse für das Experiment führt zu:
Gleichung 8

Diese Beziehung folgert, dass die effektive Geschwindigkeitskonstante der Fibrinolyse ( Gleichung 9 ) Ist eine Funktion der Plasmin-Konzentration (C pm) und der Fläche Lyserate Gleichung 10 .

Diese Technik ist auch wichtig für die Untersuchung von Thrombose inSCD-Patienten, da es nur wenig über Fibrin und Gerinnungsmechanismen in Bezug auf diese Krankheit. Es wurden nur sehr wenige Untersuchungen über die Wirkungen von SCD auf der Struktur von Fibringerinnseln geführt; damit die konfokale Bilder aus dieser Studie gesammelt bietet seltenen Visualisierung des Gerinnsels Struktur mit einbezogen sichelförmigen roten Blutkörperchen.

Um die Unterschiede in der Einrichtung zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen, verwenden Sie eine one-way ANOVA und post hoc Tukey-Kramer-Test. Ein Einweg-ANOVA ist ein statistischer Test verwendet werden, um einen statistisch signifikanten Unterschied in der Mittel zwischen den unabhängigen Gruppen bestimmen. Der Tukey-Kramer post-Test wird verwendet, um die Hilfe von jedem unabhängigen Gruppe zu vergleichen und festzustellen, welche Gruppen mittels statistisch unterschiedlich voneinander sind. Vor dem Ausführen einer Einweg-ANOVA, gibt es sechs Annahmen, die erfüllt sein müssen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse gültig werden. Die sechs Annahmen sind: eine kontinuierliche abhängige Variable (Lyse-Rate), eine unabhängige variaBle, bestehend aus zwei oder mehreren unabhängigen Gruppen kategorisch (normal, glykosilierten und glykiertes bei vermindertem Plasmin) und unabhängig beobachteten Daten in jeder Gruppe derart, daß ein Ereignis auftritt, wirkt sich nicht auf ein weiteres Ereignis (Dies stellt sicher, daß es keine Überlappung in den Daten.) , die Datenmenge keine wesentlichen Ausreißer nicht enthalten, normalverteilten Daten durch die Shapiro-Wilk statistischen Test überprüft, und die Homogenität der Varianzen in den von der Levene statistischen Test geprüften Daten. Wenn diese Annahmen gegeben sind, werden ein Ein-Weg-ANOVA und post-hoc-Tukey-Kramer-Test mit einem p-Wert von 0,05 als Schwellenwert zur Bestimmung statistischer Signifikanz durchgeführt. Für eine strenge Detail der Einweg-ANOVA und post-hoc Tukey-Kramer-Test, um 44,45 beziehen.

Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren zur Abbildung von normalen und abnormalen (aufgrund von Krankheitszuständen) Fibringerinnseln in ihrer nativen Zuständen. Das Verfahren liefert auch Informationen für die Echtzeit-Bildgebung des Gerinnsellyse sowiewie statistische Analyse der Lyse Raten. Die Leichtigkeit, mit der der Thrombus kann hergestellt und in vitro abzubilden ist nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen in der Zell- und Gewebetechnik.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).

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Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

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