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Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

Lesão de revestimento endotelial de um vaso sanguíneo é reparada através da resposta hemostática, ou a formação de um coágulo de sangue. Quando o sangue penetra na matriz extracelular, os factores de tecidos activar as plaquetas do sangue que facilitam a iniciação da cascata de coagulação. O componente mecânico chave deste processo de cicatrização é a matriz de fibrina, composto de fibras de fibrina que são altamente elástico, e pode suportar grandes forças de 1-4. Muitos pesquisadores têm estudado a estrutura de formação e função de fibrina extensivamente nas últimas décadas 13/05.

Pacientes com doenças como diabetes mellitus e falciforme têm um risco aumentado de desenvolvimento de complicações trombóticas, tais como infarto do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidentes vasculares cerebrais 14-19. Mais de 2 milhões de pessoas são diagnosticadas com diabetes mellitus a cada ano nos Estados Unidos. Existem dois tipos de diabetes: Tipo I, onde ocorpo não consegue produzir quantidades adequadas de insulina, e Tipo II, em que o corpo se torna resistente à insulina. Nos pacientes com diabetes, doença cardiovascular (DCV) é a causa de 80% da morbidade e mortalidade associadas com a doença 20,21.

A doença falciforme (SCD) é uma desordem genética do sangue que afeta mais de 100 mil pessoas nos Estados Unidos 22. SCD é uma doença ponto de mutação que faz com que as células vermelhas do sangue para se tornar em forma de crescente, fazendo com que seja difícil para as células que passam através da vasculatura sanguínea 23. Ambos os estados de doença aumentar as possibilidades de desenvolver condições aterotrombóticas no corpo. Uma das razões para isso é o resultado da estrutura da fibrina alterada e função em estados doentes 14,24-26.

Em ambas as diabetes e doença das células falciformes, há um estado de hipercoagulabilidade e hipofibrinólise actividade que induz a aterotrombose e doença cardiovascular (CVD), em comparação com pacientes saudáveis ​​17,27,28. Sabe-se que hipofibrinólise promove a progressão da aterosclerose e gera eventos isquêmicos recorrentes para os pacientes com doença arterial coronariana prematura 29. No manuscrito atual, nós investigamos o papel das propriedades físicas de fibrina neste cenário particular. Estruturas de coágulos de fibrina em pacientes não-doentes são compostas por fibras finas, poros de maiores dimensões, e geralmente menos densa 14,24. O aumento da porosidade e coágulos de fibrina menos densas em pacientes saudáveis, foram encontrados para facilitar a fibrinólise 16. Em condições hyperthrombotic tais como a doença de células falciformes e diabética, há um aumento na produção de fibrinogénio, fazendo com que a concentração de fibrinogénio a partir de aumentar os níveis normais de 2,5 mg / ml em pacientes saudáveis ​​30-33. Coágulos de fibrina formados em pacientes diabéticos têm sido encontrados para ser menos poroso, mais rígida, têm mais pontos de ramificação, e mais denso quando comparado com saudável, não-diâmpacientes Bética 14,24,33-35. A estrutura de fibrina é alterada um resultado de glicação de mecanismos que ocorrem nas proteínas envolvidas na formação do coágulo. Não enzimática (irreversível) glicação ocorre quando as moléculas de glicose se ligar a resíduos de lisina na molécula de f ibrinogénio, que inibe XIIIa factor humano (FXIIIa) de glutamina e lisina apropriadamente de reticulação 33,36,37.

A análise estrutural de redes de fibrina tem sido extensivamente estudado recentemente. Em particular, os pesquisadores utilizaram microscopia eletrônica e reconstrução 3D de redes de fibrina 38, investigou como ambas as células e extravasculares (fibroblastos e do músculo liso) intravascular (células endoteliais) afetam a estrutura da fibrina 39, viscoelástico utilizados e análise espectral para analisar estruturas de fibrina 40, e correlações desenvolvidos entre a estrutura da fibrina e propriedades mecânicas usando experimental e computacional se aproxima 41 in vitro fibrinogénio glicação. Para simular a doença de células falciformes condições de coagulação, o aumento da concentração de fibrinogênio foram misturados com hematócrito falciforme coletadas de pacientes como feito anteriormente pelo nosso grupo 42. Estes métodos foram usados ​​para examinar a estrutura e as funções envolvidas na formação do coágulo de fibrina e fibrinólise sob condições de doença, bem como os mecanismos que induzem a DCV. Com base em informações atuais sobre essas doenças, as estruturas do coágulo de fibrina glicada foram mais denso com menos umnd poros menores. Os coágulos de fibrina com hemácias de pacientes com anemia falciforme (hemácias) também eram mais densas e exibido agregação das hemácias e aglomerados de fibrina aglomeradas. Este é um fenômeno bem estabelecido que tenha sido determinado anteriormente 43. Também foi levantada a hipótese de que a taxa de fibrinólise seria significativamente menor nos coágulos de fibrina glicada com e sem plasmina reduzida em comparação com saudável, normal, de fibrina. Os resultados mostraram que, para a formação de coágulos de fibrina glicada, resultados significativamente diferentes taxas de lise foram observados apenas sob condições de baixa concentração de plasmina. Esta técnica experimental utilizando microscopia confocal oferece vantagens significativas sobre outros métodos de imagem, porque as células e proteínas permanecem no seu estado nativo, que permite a captação de vídeo em tempo real da actividade de coagulação. Este método de coagulação sinteticamente indutor também é mais barato e mais eficiente do que o tempo de obtenção de amostras de pacientes e filtrar indivíduoproteínas e enzimas. Além disso, utilizando proteínas e enzimas separados para sintetizar a formação de coágulos, os coágulos foram normalizados de modo que não existe variabilidade entre as amostras, como resultado de outras proteínas do plasma.

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Protocol

NOTA: O protocolo a seguir segue as diretrizes estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) no Georgia Tech.

1. Coleta de Sangue e Blood Red isolamento de células Procedimento

  1. Recolha 40-120 ml de sangue de doadores em 10 ml tubos Vacutainer contendo heparina. Comece PBMC (célula mononucleated sangue periférico) isolamento dentro de 4 horas da coleta. Durante este tempo, manter o sangue à temperatura ambiente.
    NOTA: O armazenamento / N de sangue na RT ou em 4 ° C não é recomendada como isso irá resultar em menor rendimento PBMC.
  2. Dilui-se todo o sangue 1: 1 em arrefecido em gelo (4 ° C) PBS estéril.
  3. Pipetar 10 ml de gelado polissacarídeo hidrofílico em um, estéril tubo de 50 ml vazio. Suavemente transferir sangue total diluído em cima do polissacárido hidrófilo.
  4. Usar uma pipeta de 25 ml no ajuste lento e sangue pipeta ao longo do lado do tubo muito lentamente. Certifique-se de que o sangue não é misturado com o sacárido antes centrifugation porque o polissacárido hidrófilo é tóxico para as células e de outro modo, o rendimento de PBMC será menor.
  5. Centrifugar as amostras de sangue durante 30 minutos a 400 xg, a 4 ° C. Se disponíveis, reduzir a velocidade do travão da centrífuga para metade do máximo para uma melhor separação, após a centrifugação.
  6. Aspirar fora da fracção de plasma / plaquetas da amostra de sangue centrifugado. Aspirar cuidadosamente a camada hidrofílica polissacarídeo diretamente acima da camada RBC lotado.
  7. Recolha 8-10 ml de concentrado de eritrócitos e diluir 1: 1 com unsterile 0,9% NaCl salina.

2. microscopia confocal de Avaliação de Estruturas glicada Clot (simulado diabéticos coágulos)

  1. Descongelar o fibrinogénio humano marcado com fluorescência e conjugado de fibrinogénio humano a 37 ° C.
  2. Pipeta a seguinte em um 0,5 ml graduada tubo de microcentrífuga.
    1. Para os saudáveis, coágulos normais de fibrinogênio, misturar fibrinogénio humano com 10% fluorescente etiquetado fibrinogénio humanoconjugado em tampão Tris 50 mM / NaCl 100 mM a uma concentração de 5 mg / ml.
    2. Para o fibrinogénio glicada artificialmente (para simular a formação de coágulos diabéticos), incubar fibrinogénio humano e 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio numa solução 5 mM de glucose dissolvida em mM Tris / NaCl 100 mM para 50 a consequente concentração de 6,8 mg / ml.
  3. Cubra os tubos micro-centrífuga, usando um material opaco para evitar a exposição à luz. Incubar os tubos num banho de água a 37 C ° durante 48 h.
  4. Faça uma câmara em uma lâmina de microscópio de vidro por aposição de um adesivo fino em 2 lados do slide.
  5. Após o período de incubação de 48 horas, para preparar reagentes e a formação de fibrina por trombina e descongelação FXIIIa alfa humano à TA.
  6. Diluir FXIIIa a 80 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
  7. Dilui-se a trombina a 4 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
    1. Para coágulos normais, garantir que as concentrações finais de fibrinogênio, FXIIIa, e trombina são 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, em um volume de 50 ul.
    2. Para os coágulos glicada, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 3,4 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul.
  8. Imediatamente pipeta 30 ul da solução de fibrina para dentro da câmara formada pelo adesivo.
  9. Coloque um 22 milímetros x 22 mm deslizamento tampa de vidro com espessura de 0,15 mm no topo das duas camadas de adesivo. Selar os lados abertos com adesivo transparente para evitar que o coágulo de fibrina de secar. Certifique-se de que o adesivo não interage com o coágulo de fibrina.
  10. Permitir que os coágulos de fibrina para polimerizar a 21-23 ° C por 2 horas antes de imagem confocal.
  11. Tome imagens de microscopia confocal dos coágulos usando um microscópio confocal com uma lente de 40x / 1,30 Oil M27 com 488 nm laser de argônio.

3. microscopia confocal Avaliação de fibrina coágulos que contêm apenas hemácias de foice Pacientes Celulares

  1. Descongelar o fibrinogénio humano marcado com fluorescência e conjugado de fibrinogénio humano a 37 ° C.
  2. Pipeta a seguinte em um 0,5 ml graduada tubo de microcentrífuga.
    1. Para o saudável, coágulo de fibrina normais, misturar fibrinogénio humano com 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio humano num tampão mM de NaCl 50 mM de Tris / 100 a uma concentração de 5 mg / ml.
    2. Para os coágulos que contêm eritrócitos SCD, misturar fibrinogénio humano e 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio humano em tampão Tris 50 mM / NaCl 100 mM, de tal modo que a concentração resultante do fibrinogénio é de 10 mg / ml.
  3. Rotular as hemácias isoladas (normais e as de doentes falciformes obtidos a partir do protocolo de isolamento RBC), utilizando uma solução de marcação celular.
    1. Suspender as células a uma densidade de 1 x 10 6 por ml em qualquer meio de cultura isento de soro escolhido.
    2. Adicionam-se 5 ul / ml de suspensão de células para a solução de marcação celular. Misture bem por pipetagem suave suavemente.
    3. Centrifugar os tubos de suspensão rotulados a 1.500 rpm durante 5 min a 37 ° C.
    4. Remover o sobrenadante e re-suspender suavemente as células em meio de 37 ° C.
    5. Repita o procedimento de lavagem (3.3.4 e 3.3.5) mais duas vezes.
  4. Diluir FXIIIa a 80 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
  5. Dilui-se a trombina a 4 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM.
    1. Para a formação de coágulos normais, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul.
    2. Para os coágulos que contêm eritrócitos SCD, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul.
  6. Pipetar 10 ul de hemácias marcadas para a solução de fibrina. Pipeta 30 ul da fibrina com hemácias no vidro do microscópio (consulte a deslizar preparação para glcoágulos ycated).
  7. Permitir que a fibrina para polimerizar a 21-23 ° C durante 2 h antes de imagem confocal.
  8. Tome imagens confocal dos coágulos usando o microscópio confocal, e utilizar lasers de excitação com comprimentos de onda de 488 nm e 633 nm para excitar a fibrina marcado por fluorescência e hemácias.

4. Avaliação da microscopia confocal Fibrinolysis Tarifas em glicada Estruturas Clot

  1. Repita o protocolo de microscopia confocal de coágulos glicada (Protocolo Etapa 2) para a avaliação da taxa de fibrinólise em coágulos glicada.
  2. Não selar as extremidades da câmara com adesivo transparente. Permitir que os coágulos de fibrina que polimerizam durante 1,5 h a 21-23 ° C num invólucro selado contendo 250 ml de água para evitar a desidratação.
  3. Após a polimerização, obter imagens dos coágulos usando o microscópio confocal.
  4. Pipeta plasmina dentro da extremidade aberta da câmara e dispersar a plasmina através do coágulo através da acção capilar.
    1. Paraas experiências normais e fibrinólise glicada com concentrações normais, de pipeta 25 ul a 200 ug / ml de plasmina para a abertura da câmara.
    2. Para os coágulos glicada com concentrações reduzidas, pipeta 25 ul a 50 ug / ml para a abertura da câmara.
  5. Use o recurso de série de tempo (veja a Figura 1) no software microscópio confocal para capturar em tempo real imagens de vídeo do plasmina lise do coágulo.
    1. Clique em modo de aquisição e, em seguida, selecione "Séries Temporais". Selecione o número de ciclos e do intervalo de tempo de gravação.

5. Cálculo Fibrinólise Rates

  1. Determinar a taxa de lise, definindo uma área (2.500 mm 2) e calculando o tempo decorrido necessário para dissolver uma área fixa do coágulo. Calcula-se a taxa de lise utilizando a seguinte equação (Figura 2):
    Equação 1

6. Análise Estatística da fibrinólise Rates

  1. Analisar os dados de lise usando o software de análise estatística. Realize uma análise de variância one-way e um post hoc teste de Tukey-Kramer 44,45.

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Representative Results

Microscopia Confocal Análise de glicada fibrina Coágulo Estruturas

As imagens de microscopia confocal de coágulos normais e glicadas são apresentados na Figura 3. A análise por microscopia confocal dos coágulos normais e glicada revela que a formação de coágulos glicada são mais densos com poros mais pequenos do que os coágulos normais ambos com e sem a adição de FXIIIa coágulo durante a polimerização. Na Figura 3A e 3B, não é uma concentração de fibrina inferior que criou uma estrutura menos densa do que os coágulos glicosilada com maior concentração de fibrina (Figuras 3C e 3D).

A maior densidade observadas (número de fibras por unidade de área) nos coágulos glicada é um resultado do aumento da concentração de fibrinogénio que ocorre em pessoas com diabetes. Nos coágulos normais, as fibras de fibrina eram mais linear e formada fibras mais longas com FXIIIa após polimerização, queé provavelmente um resultado do FXIIIa formando ligações cruzadas entre as fibras. No caso dos coágulos glicada, as fibras parecia ser mais curta, mesmo com a adição de FXIIIa. Este é provavelmente o resultado do processo de polimerização que foi alterado, devido à presença de regiões glicosiladas da molécula de fibrinogénio. Além disso, a partir da análise Figura 3, é provável é que a espessura das fibras foi também reduzida como um resultado de glicação, que é provavelmente porque a fluorescência das fibras glicada parecem ter uma intensidade mais baixa.

Microscopia confocal Análise de fibrina coágulos que contêm apenas hemácias de foice Pacientes Celulares

As imagens de microscopia confocal da estrutura de coágulo de fibrina de coágulos com eritrócitos normais e de pacientes com anemia falciforme são apresentados na Figura 4. Tal como previsto, as imagens confocais dos coágulos de fibrina que contêm glóbulos vermelhos a partir de pacientes com anemia falciforme tinham estruturas mais densas do que as de c saudável de fibrinalotes. Figura 4A mostra uma distribuição homogénea de fibrina e glóbulos vermelhos normais. No entanto, na Figura 4B, existem aglomerados de fibrina e espaços vazios onde não há nenhuma rede de fibrina formados. As hemácias de pacientes com anemia falciforme não foram homogeneamente dispersas, mas sim foram embutidos nas touceiras de fibrina. O aumento da densidade (número de fibras por unidade de área) era um resultado do aumento da concentração de fibrinogénio que ocorre como um resultado de um estado de hipercoagulabilidade em pacientes SCD. Além disso, a tendência natural das hemácias de pacientes com anemia falciforme para formar agregados engendrada aglomerados de glóbulos vermelhos que se tornaram entrelaçadas na rede de fibrina. Isto resultou na formação de coágulo estruturas aberrantes que são marcadamente diferentes na morfologia do que as dos doentes normais. A partir da Figura 4B, constata-se que os glóbulos vermelhos a partir de pacientes com anemia falciforme causado maior heterogeneidade da amostra de fibrina e também causou uma distribuição espacial mais ampla de glóbulos vermelhos na amostra de fibrina, quando COMcomparado com os coágulos de fibrina saudáveis ​​com eritrócitos normais. Em contraste, os coágulos de fibrina saudáveis ​​com eritrócitos normais exibiu uma dispersão mais homogénea das células ao longo da rede de fibrina.

Não se sabe o quanto HbS (hemoglobina falciforme) foi polimerizada nos eritrócitos de pacientes com anemia falciforme e está contido nas amostras. O que se sabe, no entanto, é que a presença de qualquer quantidade de HbS causa maior agregação de células em número de moléculas de HbS por unidade de volume vs. moléculas HbA normais. Pan et al. 46 demonstraram esse fenômeno em um estudo onde comparou os efeitos de agregação / agrupamento de desoxi-HbS, e, para a comparação, de oxi-HbS e oxi-hemoglobina adulta normal, HbA. Os clusters formados em poucos segundos após o preparo da solução e seus tamanhos e números mantiveram-se relativamente estável por até 3 horas. Uma das conclusões do estudo foi que ambas as moléculas oxi-HBs e desoxi-HbS agrupados em um número maior densidade de HbA oxi-moléculas (normais) como uma função da temperatura. Pertencente ao estudo atual, isso significa que as hemácias de pacientes com anemia falciforme eram susceptíveis a se agrupar, e fibrina preso como ele estava sendo polimerizada a partir do precursor fibrinogênio.

Microscopia confocal Lise Taxa de Análise de Normal e glicada Clots

Postula-se que as taxas de fibrinólise seria maior para a formação de coágulos de fibrina normais em comparação com coágulos de fibrina glicada com a diminuição da concentração de plasmina. Para testar esta hipótese, microscopia confocal foi utilizada para avaliar as taxas de lise de coágulos de fibrina, com a adição de plasmina. A média (média) taxas de lise de fibrina normal com a adição de 200 ng / ml de plasmina foi de 43,2 ± 26,5 mm 2 / seg e as médias (média) taxas de lise de fibrina glicada com a adição de 200 ug / ml de plasmina foi 29,7 ± 11,2 mm 2 / seg. Para o coágulo de fibrina com glicada lisadas50 ug / ml de plasmina, a taxa de lise média foi de 12,8 ± 3,1 mm 2 / SE. Um total de 10 amostras de cada um (30) amostras foram usadas para determinar os valores de média e desvio padrão. Estes valores são apresentados na Figura 5. Um valor de p igual a 0,05 foi utilizado para determinar a significância entre os grupos experimentais independentes. Análise das taxas de fibrinólise demonstrou que o valor para os coágulos normais em comparação com os diabéticos glicada (simulados) coágulos com plasmina diminuiu foram significativamente diferentes.

Figura 1
Figura 1. Exemplo de tela de software microscópio confocal método para a obtenção em tempo real detalhamento, imaging contínuo de fibrina lise do coágulo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior do this figura.

Figura 2
Figura 2. Exemplo de imagem confocal com área fixa usada para calcular a taxa de lise de amostra do coágulo de fibrina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Imagens confocal (diabéticos) coágulos de fibrina saudáveis ​​e glicada. Fluorescência verde representa a rede de fibrina. A fibrina unglycated representa coágulos formados em pacientes saudáveis, ao passo que a fibrina glicada representa coágulos formados em pacientes diabéticos. (A) Unglycated fibrina sem a adição de FXIIIa. (B) de fibrina Unglycated com FXIIIa. (C (D) fibrina glicada com FXIIIa. A barra de escala vermelha indica 50 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Imagens confocal de coágulos de fibrina saudáveis ​​com os glóbulos vermelhos normais e coágulos de fibrina com hemácias de pacientes com anemia falciforme. Fluorescência verde representa a rede de fibrina e magenta representa marcado saudável e hemácias de pacientes com anemia falciforme. (A) os glóbulos vermelhos saudáveis ​​na concentração de fibrina normal com FXIIIa e (B) Aumento da fibrina com FXIIIa e hemácias de um paciente falciforme. A barra de escala branca indica 50 um. Os círculos brancos na imagem (B) indicam hemácias falciformes reconhecíveis.

Figura 5
Figura 5. Taxas Fibrinólise de coágulos de fibrina normais em comparação com glicada coágulos (diabético) de fibrina e coágulos glicada com reduzida concentração plasmina. Significância estatística foi determinada com base em um one-way ANOVA e uma hoc Tukey-Kramer teste post de comparação múltipla. A análise de variância mostrou que houve uma diferença significativa entre as médias das taxas de lise. O teste de Tukey-Kramer mostrou que houve uma diferença significativa de meios entre os coágulos normais e coágulos com diminuição da plasmina com p <0,05. O * indica uma diferença significativa de coágulos normais.

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Discussion

Para obter dados significativos sobre a estrutura de mecanismos de coagulação em estados de doença, é importante isolar os factores implicados na coagulação para determinar os efeitos das proteínas e células nestas condições. Este protocolo foi desenvolvido para os efeitos da análise da estrutura de coágulo de fibrina em estados diabéticos e DF in vitro.

É necessário compreender os mecanismos envolvidos na formação de fibrina e fibrinólise em estados de doença, desde condições alteradas causar hipercoagulabilidade, aterotrombose, e CVD. A partir das imagens confocais obtidos nesta experiência, é evidente que a actividade ocorre em estados de hipercoagulabilidade e SCD diabéticos, o que provoca um aumento da concentração de fibrinogénio. Um aumento da concentração de fibrinogênio resultados em uma rede de fibrina mais densa, com mais pontos de ramificação e poros menores em toda a rede. Nas redes de fibrina de pacientes com DF, não só há mais de fibrina presente, but da natureza agregando dos eritrócitos de pacientes com anemia falciforme também altera a estrutura da rede, uma vez que aprisiona fibrina em clusters. O conglomerado de hemácias de pacientes com anemia falciforme também reduz a porosidade dos agregados de fibrina na rede, mas parece aumentar a concentração vazio na rede global. Os resultados da análise de fibrinólise de coágulos glicada suportam a hipótese de a taxa de lise de coágulos em glicada sendo inferior com plasmina reduzida do que a dos coágulos saudáveis, normais. No entanto, os resultados não fornecem evidências conclusivas sobre as taxas de lise de coágulos glicada com concentrações normais de plasmina. Assim, pode-se concluir que para pacientes diabéticos com plasmina concentração normal, pode haver actividade suficiente para degradar a fibrinólise de coágulos de fibrina de um modo eficiente.

Para as experiências realizadas neste estudo de investigação, foram usadas as proteínas isoladas e RBCs, em vez de sangue total e plasma. Ao utilizarproteínas separadas para sintetizar os coágulos de fibrina, as causas para as estruturas alteradas entre o normal, contra coágulos de doentes pode ser determinada. Isto reduziu consideravelmente a possibilidade de ter outras proteínas plasmáticas interferir com a estrutura e morfologia dos coágulos de fibrina. No entanto, utilizando as proteínas isoladas, é crucial para armazenar e tratar as células e proteínas de forma adequada, uma vez que são mais vulneráveis ​​a morte celular e a degradação da proteína.

A técnica de imagiologia de microscopia confocal escolhido para este estudo foi devido à capacidade de obtenção de imagens das estruturas coágulo de fibrina, mantendo as propriedades naturais trombóticas das células e proteínas. A microscopia confocal foi também demonstrado para dar um melhor contraste e resolução óptica da amostra com o ruído reduzido em comparação com microscopia óptica tradicional. A luz laser é dirigida para dentro de um orifício que bloqueia a luz desfocada de entrar. Utilização de microscopia confocal obviada a necessidade de aadição de produtos químicos fixadores; assim que as células e proteínas foram capazes de manter a sua actividade proteína natural de formar coágulos de fibrina. Como resultado as células, proteínas e enzimas funcionou no seu estado nativo, que permite a utilização de microscopia confocal para a captura de imagens de vídeo e de actividade em tempo real. Com microscopia confocal, as imagens 3D dos coágulos de fibrina foram capturados e vídeos de digestão plasmina de coágulos de fibrina foram obtidos em tempo real. Quando a adição de plasmina para o coágulo de vídeo para capturar uma série de tempo do processo de lise do coágulo, foi importante a utilização de acção capilar através da plasmina para dispersar homogeneamente o enzima através da matriz de fibrina. Isto foi feito para assegurar que a concentração de plasmina foi adicionado precisas e permitiu a enzima para lisar a totalidade do coágulo, em contraste com a área local que a plasmina foi adicionado.

O método e os resultados obtidos neste estudo foram semelhantes a um estudo realizado por Dunn et al, que descobriu que a lise do coágulotaxas foram significativamente menores em indivíduos diabéticos que os indivíduos controle 25. Em ambos os estudos, houve diferenças significativas nas taxas de lise de diabéticos (glicada) coágulos; No entanto, o protocolo atual pode representar fielmente estados diabéticos por causa dos níveis de plasmina reduzidos. Adicionalmente, neste estudo de pesquisa fibrinólise foi capturado continuamente em tempo real utilizando o microscópio confocal, em contraste com a análise de secções discretas em intervalos de tempo diferentes. Wooton et al. 47 investigaram a lise do coágulo de fibrina e empregue uma velocidade da frente de lise (cm / s) para investigar a taxa de lise de coágulos. Eles usaram análise de imagem confocal em seu estudo para determinar a velocidade da frente. No estudo actual, em vez de uma velocidade da frente de lise, uma velocidade de área de lise foi utilizado (por causa da forma como a imagem foi analisada no confocal). Para validar ainda mais o método desenvolvido em nosso estudo, os autores em 48 descreveram um modelo matemático de lise do coágulo de fibrina pela plasmina, em que prescrevem a velocidade da frente de lise como uma função da constante de velocidade efectiva de fibrinólise. A equação é dada como:
Equação 2

Aqui, Equação 3 representa a constante da taxa efectiva de fibrinólise, K é uma constante de adsorção, C pm é a concentração de plasmina, e ρ Fn é a densidade de fibrina. Se a quantidade medida Equação 4 (Medido a partir da análise de microscópio confocal, no estudo corrente) é utilizado e se utiliza a regra da cadeia, isto conduz a:
Equação 5

t "> Assumindo que apenas uma dimensão está mudando por unidade de tempo leva a:

Equação 6

Equação 7

Assim, a constante de velocidade de fibrinólise eficaz para a experiência leva a:
Equação 8

Esta relação infere que a constante de taxa efetiva de fibrinólise ( Equação 9 ) É uma função da concentração de plasmina (C pm) e a taxa de lise área Equação 10 .

Esta técnica também é importante para o estudo de trombose emPacientes com DF, uma vez que não é pouco conhecido sobre a fibrina e mecanismos de coagulação no que diz respeito a esta doença. Tem havido muito poucos estudos realizados sobre os efeitos de SCD sobre a estrutura de formação de coágulos de fibrina; assim, as imagens confocal recolhidos a partir deste estudo fornece visualização rara da estrutura do coágulo com hemácias falciformes incorporadas.

Para comparar as diferenças de médias entre os grupos, use uma ANOVA one-way e um teste de Tukey-Kramer post hoc. A one-way ANOVA é um teste estatístico utilizado para determinar uma diferença estatisticamente significativa nas médias entre grupos independentes. O pós-teste de Tukey-Kramer é usado para comparação das médias de cada grupo independente e determinar quais os meios dos grupos são estatisticamente diferentes um do outro. Antes de realizar uma one-way ANOVA, há seis pressupostos que devem ser cumpridas para garantir que os resultados são válidos. Os seis pressupostos são: uma variável (taxa de lise) dependente contínua, uma varia independenteble que consiste em dois ou mais grupos independentes categóricas (normais, glicosilada e glicosilada com plasmina reduzida), e os dados observados de forma independente em cada grupo de tal forma que um evento de ocorrência não afecta outro evento (Isto assegura que não há sobreposição em dados). , o conjunto de dados que não contenham os valores atípicos significativas, normalmente distribuído dados verificados pelo teste estatístico de Shapiro-Wilk, e homogeneidade das variâncias dos dados verificados pelo teste estatístico Levene. Uma vez que estes pressupostos foram cumpridos, uma análise de variância one-way e um teste de Tukey-Kramer post hoc foram realizadas com um valor-p de 0,05 como limite para determinar a significância estatística. Para um detalhe rigorosa do one-way ANOVA e teste post-hoc de Tukey-Kramer, referem-se a 44,45.

No geral, este método permite imagens de coágulos normais e anormais (devido ao estado de doença) de fibrina em seus estados de origem. O método também fornece detalhes de imagem em tempo real de lise do coágulo, bemcomo análise estatística das taxas de lise. A facilidade com que o trombo pode ser produzida e fotografada in vitro é útil para uma vasta gama de aplicações na engenharia celular e do tecido.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

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