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Técnicas Experimentales y de imagen para examinar la estructura coágulo de fibrina en normales y enfermos Unidos

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

La lesión de revestimiento endotelial de un vaso sanguíneo se repara a través de la respuesta hemostática, o la formación de un coágulo de sangre. Cuando la sangre penetra en la matriz extracelular, factores tisulares activar las plaquetas en el torrente sanguíneo que facilitan la iniciación de la cascada de la coagulación. El componente mecánico clave de este proceso de curación es la matriz de fibrina, compuesto de fibras de fibrina que son altamente elástico, y puede sostener grandes fuerzas 1-4. Muchos investigadores han estudiado la estructura de formación, y la función de la fibrina ampliamente en las últimas décadas 5-13.

Los pacientes con enfermedades como la diabetes mellitus y de células falciformes tienen un mayor riesgo de desarrollar complicaciones trombóticas tales como infartos de miocardio, enfermedad isquémica del corazón y accidentes cerebrovasculares 14-19. Más de 2 millones de personas son diagnosticadas con diabetes mellitus cada año en los Estados Unidos. Hay dos tipos de diabetes: Tipo I, donde elcuerpo no puede producir cantidades adecuadas de insulina, y Tipo II, donde el cuerpo se vuelve resistente a la insulina. Entre los pacientes con diabetes, enfermedad cardiovascular (ECV) es la causa del 80% de la morbilidad y la mortalidad asociadas con la enfermedad 20,21.

La enfermedad de células falciformes (ECF) es un trastorno genético de la sangre que afecta a más de 100.000 personas en los Estados Unidos 22. SCD es una enfermedad mutación puntual que hace que las células rojas de la sangre para convertirse en forma de media luna, lo que hace difícil para que las células pasan a través de la vasculatura arterial 23. Ambos de estos estados de enfermedad aumentan las probabilidades de desarrollar condiciones aterotrombóticos en el cuerpo. Una de las razones de esto es un resultado de la estructura de fibrina alterada y función en estados de enfermedad 14,24-26.

En la diabetes y la enfermedad de células falciformes, existe hipercoagulabilidad y la actividad hipofibrinolisis que induce la aterotrombosis y la enfermedad cardiovascular (CVD) en comparación con pacientes sanos 17,27,28. Se sabe que hipofibrinolisis promueve la progresión de la aterosclerosis y engendra eventos isquémicos recurrentes para los pacientes con enfermedad de la arteria coronaria prematura 29. En el manuscrito, se determinó el papel de las propiedades físicas de fibrina en este entorno particular. Estructuras coágulo de fibrina en pacientes no enfermos se componen de fibras finas, poros más grandes, y en general menos densa 14,24. Se ha encontrado que el aumento de la porosidad y coágulos de fibrina menos densas en pacientes sanos para facilitar la fibrinólisis 16. En condiciones hipertrombótico tales como la enfermedad de células falciformes y diabética, hay un aumento en la producción de fibrinógeno, haciendo que la concentración de fibrinógeno para aumentar los niveles normales de 2,5 mg / ml en pacientes sanos 30-33. Los coágulos de fibrina formados en los pacientes diabéticos se han encontrado para ser menos poroso, más rígido, tener más puntos de ramificación, y más denso en comparación con sanos, no-diacientes diabéticos 14,24,33-35. La estructura de fibrina alterada es un resultado de los mecanismos de glicación que se producen en las proteínas implicadas en la formación del coágulo. No enzimática (irreversible) glicación se produce cuando las moléculas de glucosa se ​​unen a residuos de lisina en la molécula de fibrinógeno, que inhibe factor humano XIIIa (FXIIIa) a partir de glutamina y lisina residuos adecuadamente de reticulación 33,36,37.

El análisis estructural de las redes de fibrina ha sido ampliamente estudiado recientemente. En particular, los investigadores han utilizado la microscopía electrónica y la reconstrucción 3D de las redes de fibrina 38, investigados cómo ambas células intravasculares (endoteliales) y extravasculares (fibroblastos y músculo liso) células afectan a la estructura de fibrina 39, viscoelástico utilizado y el análisis espectral para analizar estructuras de fibrina 40, y correlaciones desarrolladas entre la estructura de fibrina y las propiedades mecánicas utilizando experimental y computacional enfoques 41 in vitro la glicación fibrinógeno. Para simular las condiciones de coagulación anemia de células falciformes, el aumento de las concentraciones de fibrinógeno se mezclaron con hematocrito células falciformes recogido de pacientes como se ha hecho anteriormente por nuestro grupo 42. Estos métodos se utilizaron para examinar la estructura y las funciones que participan en la formación del coágulo de fibrina y la fibrinolisis bajo condiciones de enfermedad, así como los mecanismos que inducen CVD. En base a la información actual sobre estas enfermedades, las estructuras coágulo de fibrina glicosilada eran más densas con menos de unnd poros más pequeños. Los coágulos de fibrina con las células rojas de la sangre de pacientes con anemia drepanocítica (GR) eran también más denso y se muestran agregación de los glóbulos rojos y las agrupaciones de fibrina aglomerados. Este es un fenómeno bien establecido que se ha determinado previamente 43. También se planteó la hipótesis de que la tasa de fibrinólisis sería significativamente menor en los coágulos de fibrina glucosilada con y sin reducción de plasmina en comparación con saludable, fibrina normal. Los resultados mostraron que para los coágulos de fibrina glucosilada, resultados significativamente diferentes tipos de lisis se observaron sólo bajo condiciones de reducida concentración de plasmina. Esta técnica experimental de la utilización de la microscopía confocal ofrece ventajas significativas sobre otros métodos de imagen, porque las células y las proteínas permanecen en su estado nativo, lo que permite la captura de vídeo en tiempo real de la actividad de coagulación. Este método de coagulación sintéticamente inductor es también más barato y más eficiente en el tiempo que la obtención de muestras de pacientes y filtrar individuoproteínas y enzimas. Además, mediante el uso de proteínas y enzimas separadas para sintetizar coágulos, los coágulos se estandarizaron de modo que no era la variabilidad entre las muestras como resultado de otras proteínas en el plasma.

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Protocol

NOTA: El siguiente protocolo se adhiere a las directrices establecidas por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Georgia Tech.

1. Extracción de sangre y la Sangre Procedimiento de aislamiento celular de color rojo

  1. Recoger 40-120 ml de sangre de donantes en 10 ml tubos vacutainer heparinizados. Iniciar PBMC (células mononucleadas de sangre periférica) de aislamiento dentro de las 4 horas de la recolección. Durante este tiempo, mantener la sangre a temperatura ambiente.
    NOTA: O / N de almacenamiento de la sangre en RT o en 4 ° C no se recomienda ya que esto resultará en un menor rendimiento de PBMC.
  2. Diluir la sangre completa 1: 1 en PBS estéril enfriado con hielo (4 ° C).
  3. Pipetear 10 ml de helado polisacárido hidrofílico en un tubo vacío, estéril cónico de 50 ml. Transferir suavemente la sangre entera diluida en la parte superior del polisacárido hidrófilo.
  4. Usar una pipeta de 25 ml en el ajuste lento y la sangre de la pipeta a lo largo del lado del tubo muy lentamente. Asegúrese de que la sangre no se mezcla con el sacárido antes de la centrifugation porque el polisacárido hidrófilo es tóxico para las células y de otra manera, el rendimiento PBMC será menor.
  5. Centrifugar las muestras de sangre durante 30 minutos a 400 xg a 4 ° C. Si está disponible, reducir la velocidad de freno de la centrífuga a la mitad de la máxima para una mejor separación después de la centrifugación.
  6. Aspirar la fracción de plasma / plaquetas de la muestra de sangre centrifugada. Aspirar con cuidado la capa de polisacárido hidrófilo directamente encima de la capa de glóbulos rojos envasados.
  7. Recoger 8-10 ml de glóbulos rojos empaquetados y diluir 1: 1 con no estéril 0,9% NaCl solución salina.

2. Microscopía Confocal Evaluación de glucosilada Estructuras Clot (simulados diabéticos coágulos)

  1. Descongele fibrinógeno humano y la etiqueta fluorescente conjugado fibrinógeno humano a 37 ° C.
  2. Pipetear lo siguiente en un 0,5 ml tubo de microcentrífuga se graduaron.
    1. Para los coágulos de fibrinógeno, normales sanos, mezclar fibrinógeno humano con 10% de fibrinógeno humano marcado con fluorescenciaconjugado en un tampón de Tris 50 mM / NaCl 100 mM a una concentración de 5 mg / ml.
    2. Para fibrinógeno glucosilada artificialmente (para simular la formación de coágulos diabéticos), incubar fibrinógeno humano y 10% de fibrinógeno marcado con fluorescencia conjugado en una solución 5 mM de glucosa disuelta en 50 mM Tris / NaCl 100 mM para una concentración resultante de 6,8 mg / ml.
  3. Cubra los tubos de microcentrífuga utilizando un material opaco para evitar la exposición a la luz. Incubar los tubos en un 37 ° C baño de agua durante 48 hr.
  4. Haga una cámara en un portaobjetos de microscopio de vidrio mediante la colocación de un adhesivo delgada en los 2 lados de la diapositiva.
  5. Después del período de incubación de 48 horas, preparar reactivos para la formación de fibrina por la descongelación FXIIIa y trombina alfa humano a RT.
  6. Diluir FXIIIa a 80 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
  7. Diluir la trombina a 4 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
    1. Para coágulos normales, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y trombina son 2,5 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
    2. Para los coágulos glucosilada, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y la trombina son 3,4 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
  8. Inmediatamente pipetear 30 l de la solución de fibrina en la cámara formada por el adhesivo.
  9. Coloque un 22 mm x 22 mm cubreobjetos de vidrio con un espesor de 0,15 mm en la parte superior de las 2 capas de adhesivo. Selle los lados abiertos con adhesivo transparente para evitar que el coágulo de fibrina se sequen. Asegúrese de que el adhesivo no interactúa con el coágulo de fibrina.
  10. Permita que los coágulos de fibrina que polimerizan a 21-23 ° C durante 2 horas antes de la imagen confocal.
  11. Tomar imágenes de microscopía confocal de los coágulos utilizando un microscopio confocal con una lente de 40X / 1.30 Aceite de M27 con un láser de argón de 488 nm.

3. Microscopía Confocal Evaluación de fibrina coágulos que contengan hematíes falciformes pacientes de celulares

  1. Descongele fibrinógeno humano y la etiqueta fluorescente conjugado fibrinógeno humano a 37 ° C.
  2. Pipetear lo siguiente en un 0,5 ml tubo de microcentrífuga se graduaron.
    1. Para el, coágulo de fibrina normal y saludable, la mezcla de fibrinógeno humano con 10% de conjugado marcado con fluorescencia fibrinógeno humano en un tampón de Tris 50 mM / NaCl 100 mM a una concentración de 5 mg / ml.
    2. Para los coágulos que contienen SCD glóbulos rojos, mezclar fibrinógeno humano y 10% de conjugado marcado con fluorescencia fibrinógeno humano en un Tris 50 mM / NaCl 100 mM tal que la concentración resultante del fibrinógeno es 10 mg / ml.
  3. Etiquetar los glóbulos rojos aislados (tanto normales como los de pacientes con anemia drepanocítica obtenidos del protocolo de aislamiento RBC) utilizando una solución de marcaje celular.
    1. Suspender las células a una densidad de 1 x 10 6 por ml en cualquier medio de cultivo libre de suero elegido.
    2. Añadir 5 l / ml de la suspensión celular a la solución de etiquetado celular. Mezclar bien con la pipeta suave suavemente.
    3. Centrifugar los tubos de suspensión etiquetados a 1.500 rpm durante 5 min a 37 ° C.
    4. Eliminar el sobrenadante y suavemente volver a suspender las células en 37 ° C medio.
    5. Repita el procedimiento de lavado (3.3.4 y 3.3.5) dos veces más.
  4. Diluir FXIIIa a 80 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
  5. Diluir la trombina a 4 U / ml en tampón 5 mM CaCl 2.
    1. Para la formación de coágulos normales, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y la trombina son 2,5 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
    2. Para los coágulos que contienen SCD glóbulos rojos, asegúrese de que las concentraciones finales de fibrinógeno, FXIIIa, y la trombina son 5 mg / ml, 20 U / ml, y 1 U / ml, respectivamente, en un volumen de 50 l.
  6. Añadir 10 l de los glóbulos rojos marcados en la solución de fibrina. Pipeta 30 l de la fibrina con eritrocitos en el cristal de microscopio (consulte deslice preparación para glcoágulos ycated).
  7. Deje que la fibrina polimerizar a 21-23 ° C durante 2 horas antes de la imagen confocal.
  8. Tome imágenes confocal de los coágulos utilizando el microscopio confocal, y utilizar láseres de excitación con longitudes de onda de 488 nm y 633 nm para excitar la fibrina marcada con fluorescencia y glóbulos rojos.

4. Microscopía Confocal Evaluación de fibrinólisis Tarifas en Estructuras Clot glicada

  1. Repita el protocolo de microscopía confocal de coágulos glucosilada (Protocolo Paso 2) para la evaluación del índice fibrinólisis en coágulos glucosilada.
  2. No selle los extremos de la cámara con adhesivo transparente. Permita que los coágulos de fibrina que se polimerizan durante 1,5 horas a 21-23 ° C en un recinto cerrado que contenga 250 ml de agua para prevenir la deshidratación.
  3. Después de la polimerización, obtener imágenes de los coágulos utilizando el microscopio confocal.
  4. Pipetear plasmina en el extremo abierto de la cámara y dispersar la plasmina a través del coágulo a través de la acción capilar.
    1. Paralos experimentos fibrinolisis normales y glucosilada con concentraciones normales, pipeta 25 l a 200 g / ml de plasmina en la apertura de la cámara.
    2. Para los coágulos glucosilada con concentraciones reducidas, pipeta 25 l de 50 mg / ml en la apertura de la cámara.
  5. Utilice la función de series de tiempo (véase la Figura 1) en el software de microscopio confocal para capturar en tiempo real imágenes de vídeo de la plasmina lisar el coágulo.
    1. Haga clic en el modo de adquisición y luego seleccione "Time Series". Seleccione el número de ciclos y el intervalo de tiempo de grabación.

5. Calcular Fibrinólisis Precios

  1. Determinar la tasa de lisis mediante el establecimiento de un área (2500 m 2) y calcular el tiempo transcurrido requerido para disolver un área fija del coágulo. Calcular la tasa de lisis utilizando la siguiente ecuación (Figura 2):
    Ecuación 1

6. Análisis estadístico de la fibrinólisis Precios

  1. Analizar los datos de lisis utilizando software de análisis estadístico. Realizar un ANOVA de una vía y una prueba post hoc de Tukey-Kramer 44,45.

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Representative Results

Microscopía Confocal Análisis de Estructuras Clot glucosilada fibrina

Las imágenes de microscopía confocal de coágulos normales y glucosilada se presentan en la Figura 3. Análisis de microscopía confocal de los coágulos normales y glucosilada revela que los coágulos glucosilada son más densos con poros más pequeños que los coágulos normales con y sin la adición de FXIIIa durante la polimerización coágulo. En la Figura 3A y 3B, hay una concentración de fibrina inferior que creó una estructura menos densa que los coágulos glucosilada con mayor concentración de fibrina (Figuras 3C y 3D).

La mayor densidad observada (número de fibras por unidad de área) en los coágulos glicosilada es un resultado del aumento de la concentración de fibrinógeno que se produce en personas con diabetes. En los coágulos normales, las fibras de fibrina eran más lineal y forman fibras más largas en la polimerización con FXIIIa, quees probablemente el resultado de la FXIIIa la formación de enlaces cruzados entre las fibras. En el caso de los coágulos glucosilada, las fibras parecían ser más corto, incluso con adición de FXIIIa. Este es probablemente el resultado del proceso de polimerización que se ha modificado debido a la presencia de las regiones glicosiladas en la molécula de fibrinógeno. Además, desde el análisis de la Figura 3, es probable es que el grosor de la fibra también se redujo como resultado de la glicación, que es probable que la razón por la fluorescencia de las fibras glucosilada parecen tener una menor intensidad.

Microscopía Confocal análisis de fibrina coágulos que contengan hematíes falciformes pacientes de celulares

Las imágenes del microscopio confocal de la estructura del coágulo de fibrina de los coágulos con normalidad y los glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica se presenta en la figura 4. Como se predijo, las imágenes confocal de los coágulos de fibrina que contengan hematíes de pacientes con anemia drepanocítica tenían estructuras más densas que las de sana fibrina clotes. Figura 4A muestra una distribución homogénea de la fibrina y glóbulos rojos normales. Sin embargo, en la figura 4B hay matas de fibrina y huecos donde no hay red de fibrina formada. Los glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica no fueron homogéneamente dispersas, sino que fueron incorporados en las matas de fibrina. El aumento de la densidad (número de fibras por unidad de área) era un resultado de la mayor concentración de fibrinógeno que se produce como resultado de hipercoagulabilidad en pacientes de SCD. Por otra parte, la tendencia natural de los glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica para formar agregados engendró grumos de glóbulos rojos que se entretejieron en la red de fibrina. Esto dio lugar a la formación de estructuras aberrantes coágulo que son marcadamente diferentes en la morfología de las de los pacientes normales. De la Figura 4B, se observa que los glóbulos rojos de pacientes de células falciformes causados ​​mayor heterogeneidad en la muestra de fibrina y también causaron una distribución espacial más amplia de glóbulos rojos en la muestra de fibrina, cuando comcomparación con los coágulos de fibrina sanos con los glóbulos rojos normales. En contraste, los coágulos de fibrina sanos con los glóbulos rojos normales muestran una dispersión más homogénea de las células en toda la red de fibrina.

No se sabe cuánto HbS (hemoglobina falciforme) se polimeriza en los eritrocitos de pacientes con anemia drepanocítica y está contenida en las muestras. Lo que se sabe, sin embargo, es que la presencia de cualquier cantidad de HbS causa una mayor agregación de células en el número de moléculas de HbS por unidad de volumen frente a moléculas normales de HbA. Pan et al. 46 han demostrado este fenómeno en un estudio donde se compararon los efectos de agregación / agrupación de desoxi-HBs, y, para la comparación, de oxi-HBs y oxi-hemoglobina adulta normal, HbA. Los grupos formados dentro de unos pocos segundos después de la preparación de la solución y sus tamaños y los números se mantuvieron relativamente constante durante un máximo de 3 hr. Una de las conclusiones del estudio es que las dos moléculas de oxígeno-HBs y desoxi-HbS agrupan en varias den mayorsidad de HbA-oxi moléculas (normales) como una función de la temperatura. Perteneciente a la estudio actual, esto significa que los glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica probablemente a agruparse, y fibrina atrapados ya que estaba siendo polimerizado a partir del precursor fibrinógeno.

Microscopía Confocal Lisis análisis de la tarifa de normales y glicada coágulos

Se planteó la hipótesis de que las tasas de la fibrinolisis sería mayor para la formación de coágulos de fibrina normales en comparación con los coágulos de fibrina glucosilada con disminución de la concentración de plasmina. Para probar esta hipótesis, se utilizó la microscopía confocal para evaluar las tasas de lisis de coágulos de fibrina con la adición de plasmina. El promedio (media) tasas de lisis de la fibrina normal con la adición de 200 g / ml de plasmina fue 43,2 ± 26,5 m 2 / seg y el promedio (media) tasas de lisis de fibrina glucosilada con la adición de 200 mg / ml de plasmina se 29,7 ± 11,2 m 2 / s. Para el coágulo de fibrina glucosilada se lisaron con50 mg / ml de plasmina, la tasa de lisis promedio fue de 12,8 ± 3,1 m 2 / SE. Un total de 10 muestras cada una (30 muestras) se utilizaron para determinar los valores medios y la desviación estándar. Estos valores se presentan en la Figura 5. Se utilizó un valor de p de 0,05 para determinar la significación entre los grupos experimentales independientes. Análisis de las tasas de la fibrinolisis demostró que el valor de los coágulos normales en comparación con los coágulos (diabéticos simulados) glucosilada con disminución de la plasmina fueron significativamente diferentes.

Figura 1
Figura 1. Ejemplo de pantalla del software microscopio confocal método para obtener en tiempo real que detalla, imagen continua de la lisis del coágulo de fibrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de this figura.

Figura 2
Figura 2. Ejemplo de imagen confocal con área fija se utiliza para calcular la tasa de lisis de la muestra coágulo de fibrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Confocal imágenes de (diabéticos) coágulos de fibrina sanos y glucosilada. Fluorescencia verde representa la red de fibrina. La fibrina unglycated representa los coágulos formados en pacientes sanos, mientras que la fibrina glucosilada representa los coágulos formados en pacientes diabéticos. (A) de fibrina Unglycated sin la adición de FXIIIa. (B) fibrina Unglycated con FXIIIa. (C (D) de fibrina glicosilada con FXIIIa. La barra roja escala indica 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Confocal imágenes de coágulos de fibrina saludables con los glóbulos rojos normales y coágulos de fibrina con glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica. Fluorescencia verde representa la red de fibrina y magenta representa etiquetados saludable y glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica. (A) en la concentración de glóbulos rojos sanos fibrina normal con FXIIIa y (B) Aumento de la fibrina con FXIIIa y los glóbulos rojos de un paciente de células falciformes. La barra de escala blanca indica 50 micras. Los círculos blancos en la imagen (B) indican hematíes falciformes reconocibles.

Figura 5
Figura 5. Tasas Fibrinólisis de coágulos de fibrina normales en comparación con glicosilada coágulos (diabético) de fibrina y coágulos glucosilada con reducida concentración de plasmina. La significación estadística se determinó sobre la base de un ANOVA de una vía y un hoc de Tukey-Kramer prueba de comparación múltiple de correos. El análisis ANOVA mostró que había una diferencia significativa entre los tipos de medios de lisis. La prueba de Tukey-Kramer mostró que no había una diferencia significativa en las medias entre los coágulos normales y los coágulos con disminución de la plasmina con una p <0,05. El * indica una diferencia significativa de coágulos normales.

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Discussion

Para obtener datos significativos sobre la estructura de los mecanismos de coagulación en estados de enfermedad, es importante aislar los factores implicados en la coagulación para determinar los efectos de las proteínas y células en estas condiciones. Este protocolo fue desarrollado para los fines de la investigación de la estructura del coágulo de fibrina en los estados diabéticos y SCD in vitro.

Es necesario entender los mecanismos implicados en la formación de fibrina y la fibrinólisis en estados de enfermedad ya que las condiciones alteradas causan hipercoagulabilidad, aterotrombosis, y las enfermedades cardiovasculares. De las imágenes confocales obtenidos en este experimento, es evidente que la actividad hipercoagulabilidad se produce en los estados diabéticos y SCD, lo que provoca un aumento de la concentración de fibrinógeno. Un aumento de los resultados de concentración de fibrinógeno en una red de fibrina densa con más puntos de ramificación y poros más pequeños en toda la red. En las redes de fibrina de los pacientes de SCD, no sólo hay más de fibrina presente, but el carácter agregación de los eritrocitos de pacientes con anemia drepanocítica también cambia la estructura de la red, ya que atrapa fibrina en grupos. El conglomerado de glóbulos rojos de pacientes con anemia drepanocítica también reduce la porosidad de los grupos de fibrina en la red, pero parece aumentar la concentración en vacío de la red general. Los resultados del análisis de la fibrinólisis de los coágulos glucosilada apoyaron la hipótesis de la tasa de lisis en coágulos glucosilada siendo inferior con plasmina reducida que la de los coágulos normales, sanos. Sin embargo, los resultados no proporcionan pruebas concluyentes acerca de las tasas de lisis de coágulos glucosilada con concentraciones normales de plasmina. Por lo tanto se puede concluir que para los pacientes diabéticos con concentración normal de la plasmina, puede ser suficiente para degradar la actividad de la fibrinolisis de coágulos de fibrina de una manera eficiente.

Para los experimentos realizados en este estudio de investigación, se utilizaron proteínas y glóbulos rojos aislados, en vez de sangre entera y plasma. Mediante el uso deproteínas separadas para sintetizar los coágulos de fibrina, las causas de las estructuras alteradas entre lo normal frente a coágulos enfermas pudo ser determinada. Esto reduce en gran medida la posibilidad de tener otras proteínas plasmáticas interfieren con la estructura y la morfología de los coágulos de fibrina. Sin embargo, mediante el uso de proteínas aisladas, es crucial para almacenar y manejar las células y proteínas correctamente, ya que son más vulnerables a la muerte celular y la degradación de proteínas.

La técnica de formación de imágenes de microscopía confocal elegido para este estudio fue debido a la capacidad para obtener imágenes de las estructuras coágulo de fibrina al tiempo que conserva las propiedades trombóticas naturales de las células y las proteínas. La microscopía confocal también se ha demostrado para dar un mejor contraste y una resolución óptica de la muestra con ruido reducido en comparación con microscopía de luz tradicional. La luz láser se dirige en un agujero de alfiler que bloquea la luz fuera de foco de entrar. La utilización de microscopía confocal evita la necesidad de laAdemás de los productos químicos para la adherencia; así las células y las proteínas fueron capaces de mantener su actividad de la proteína natural de la formación de coágulos de fibrina. Como resultado, las células, proteínas y enzimas funcionaron en su estado nativo, permitiendo el uso de la microscopía confocal para la captura de imágenes y de vídeo de la actividad en tiempo real. Con microscopía confocal, las imágenes 3D de los coágulos de fibrina fueron capturados y vídeos de digestión plasmina de coágulos de fibrina se obtuvieron en tiempo real. Cuando la adición de plasmina al coágulo para capturar un video de series de tiempo del proceso de lisis de coágulos, que era importante utilizar la acción capilar a través de plasmina para dispersar homogéneamente la enzima a través de la matriz de fibrina. Esto se hizo para asegurar que la concentración de plasmina añadido era exacta y permitió la enzima para lisar todo el coágulo, en contraste con el área local que se añadió la plasmina.

El método y los resultados obtenidos en este estudio fueron similares a un estudio realizado por Dunn et al, quienes encontraron que la lisis del coágulolas tasas fueron significativamente inferiores en los pacientes diabéticos que en los controles 25. En ambos estudios, se observaron diferencias significativas en las tasas de lisis (glicosilada) coágulos diabéticos; Sin embargo, el protocolo corriente puede representar con precisión los estados diabéticos debido a los niveles reducidos de plasmina. Además, en este estudio de investigación fibrinólisis fue capturado de forma continua en tiempo real utilizando el microscopio confocal, en contraste con el análisis de secciones discretas en diferentes intervalos de tiempo. Wooton et al. 47 han investigado la fibrina del coágulo de lisis y se empleó una velocidad del frente de lisis (cm / s) para investigar la tasa de lisis de coágulos. Se utilizaron análisis de imagen confocal en su estudio para determinar la velocidad del frente. En el estudio actual, en lugar de una velocidad del frente de la lisis, se utilizó una velocidad área de lisis (debido a la forma de la imagen se analizó en el confocal). A fin de validar el método desarrollado en nuestro estudio, los autores de 48 han descrito un modelo matemático de lisis de fibrina del coágulo por la plasmina, en la que se exija la velocidad del frente de lisis en función de la constante de velocidad efectiva de la fibrinolisis. La ecuación se da como:
Ecuación 2

Aquí, Ecuación 3 representa la constante de velocidad efectiva de la fibrinólisis, K a es la constante de adsorción, C pm es la concentración de plasmina, y ρ Fn es la densidad de fibrina. Si la cantidad medida Ecuación 4 (Medido a partir del análisis confocal en el estudio actual) se utiliza y se emplea la regla de la cadena, esto conduce a:
Ecuación 5

t "> Suponiendo sólo una dimensión está cambiando por unidad de tiempo conduce a:

Ecuación 6

Ecuación 7

Por lo tanto la constante de velocidad efectiva de la fibrinólisis para el experimento lleva a:
Ecuación 8

Esta relación se infiere que la constante de velocidad efectiva de la fibrinólisis ( Ecuación 9 ) Es una función de la concentración de plasmina (C pm) y la tasa de lisis área Ecuación 10 .

Esta técnica también es importante para el estudio de trombosis enPacientes de SCD, ya que no se sabe poco acerca de la fibrina y los mecanismos de coagulación con respecto a esta enfermedad. Ha habido muy pocos estudios realizados sobre los efectos de la MSC sobre la estructura de los coágulos de fibrina; por lo tanto las imágenes confocal recogidos de este estudio proporciona la visualización rara de la estructura del coágulo con hematíes falciformes incorporadas.

Para comparar las diferencias de medias entre los grupos, utilice un ANOVA de una vía y una prueba post hoc de Tukey-Kramer. Un ANOVA de una vía es una prueba estadística que se utiliza para determinar una diferencia estadísticamente significativa en los medios entre los grupos independientes. El post-test de Tukey-Kramer se utiliza para comparar las medias de cada grupo independiente y determinar qué medias grupos son estadísticamente diferentes entre sí. Antes de realizar un ANOVA de una vía, hay seis supuestos que deben cumplirse para asegurar que los resultados son válidos. Los seis supuestos son: una variable (tasa de lisis) dependiente continua, una varia independienteble que consiste en dos o más grupos independientes categóricas (normal, glucosilada y glucosilada con una reducción de la plasmina), y de forma independiente los datos observados en cada grupo de tal manera que un evento que ocurre no afecta a otro evento (Esto asegura que no hay superposición en los datos). , el conjunto de datos no contiene valores atípicos significativos, normalmente distribuye datos verificados por la prueba estadística de Shapiro-Wilk y homogeneidad de las diferencias en los datos verificados por la prueba estadística Levene. Una vez que se cumplen estos supuestos, un ANOVA de una vía y una prueba post hoc de Tukey-Kramer se realizaron con un p-valor de 0,05 como umbral para determinar la significación estadística. Para un detalle riguroso del ANOVA de una vía y la prueba post-hoc de Tukey-Kramer, consulte 44,45.

En general, este método permite la formación de imágenes de coágulos normales y anormales (debido a estados de enfermedad) de fibrina en sus estados nativos. El método también proporciona detalles para formación de imágenes en tiempo real de la lisis del coágulo, asícomo el análisis estadístico de las tasas de lisis. La facilidad con que el trombo puede ser producido y fotografiado in vitro es útil para una amplia gama de aplicaciones en la ingeniería celular y tisular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

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