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Medicine

Techniques expérimentales et d'imagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

Des traumatismes de la paroi endothéliale d'un vaisseau sanguin est réparé par la réponse hémostatique, ou la formation d'un caillot de sang. Lorsque le sang pénètre dans la matrice extracellulaire, les facteurs tissulaires activer les plaquettes dans le flux de sang qui facilitent l'initiation de la cascade de coagulation. L'élément mécanique essentiel de ce processus de guérison est la matrice de fibrine, composé de fibres de fibrine qui sont hautement élastique, et peut supporter des forces importantes 1-4. De nombreux chercheurs ont étudié la structure de la formation, et la fonction de la fibrine abondamment dans les dernières décennies 5-13.

Les patients atteints de maladies telles que le diabète sucré et la drépanocytose ont un risque accru de développer des complications thrombotiques telles que l'infarctus du myocarde, la cardiopathie ischémique, les accidents vasculaires cérébraux et 14-19. Plus de 2 millions de personnes sont nouvellement diagnostiquées avec le diabète sucré chaque année aux États-Unis. Il existe deux types de diabète: type I, où lecorps ne parvient pas à produire des quantités adéquates d'insuline, et Type II, où le corps devient résistant à l'insuline. Chez les patients diabétiques, les maladies cardiovasculaires (CVD) est la cause de 80% de la morbidité et de la mortalité associée à la maladie 20,21.

La drépanocytose (SCD) est une maladie génétique du sang qui touche plus de 100 000 personnes aux États-Unis 22. SCD est une maladie point mutation qui provoque des globules rouges à devenir en forme de croissant, ce qui rend difficile pour les cellules de passer à travers le système vasculaire sanguin 23. Ces deux états pathologiques augmenter les chances de développer des maladies athérothrombotiques dans le corps. Une des raisons à cela est le résultat de la structure de fibrine modifié et la fonction dans les Etats malades 14,24-26.

Dans les deux diabète et la drépanocytose, il est hypercoagulation et l'activité de hypofibrinolyse qui induit l'athérothrombose et les maladies cardiovasculaires (CVD) par rapport à des patients sains 17,27,28. Il est connu que hypofibrinolyse favorise la progression de l'athérosclérose et engendre des événements ischémiques récurrents pour les patients atteints de maladie coronarienne prématurée 29. Dans le manuscrit en cours, nous avons étudié le rôle des propriétés physiques fibrine dans ce contexte particulier. Structures de caillot de fibrine chez les patients non malades sont composés de fibres fines et des pores plus grands, et généralement moins dense 14,24. La porosité accrue et des caillots de fibrine moins denses chez les patients en bonne santé ont été trouvées 16 pour faciliter la fibrinolyse. Dans des conditions hyperthrombotic telles que la maladie diabétique et la faucille cellule, il existe une augmentation de la production de fibrinogène, ce qui provoque la concentration de fibrinogène à augmenter à partir de niveaux normaux de 2,5 mg / ml dans 30 à 33 patients en bonne santé. Les caillots de fibrine formés chez les patients diabétiques se sont révélés être moins poreux, plus rigide, plus de points de ramification, et plus dense en comparaison avec sain, non-diapatients Bétique 14,24,33-35. La structure de fibrine modifiée est le résultat de mécanismes de glycation qui se produisent dans les protéines impliquées dans la formation du caillot. Non enzymatique (irréversible) glycation se produit lorsque les molécules de glucose se lient à des résidus de lysine sur la molécule de fibrinogène, qui inhibe le facteur XIIIa humaine (FXIIIa) à partir de résidus lysine et glutamine correctement reticulation 33,36,37.

L'analyse structurale des réseaux de fibrine a été largement étudié ces derniers temps. En particulier, les chercheurs ont utilisé la microscopie électronique et reconstruction 3D de réseaux de fibrine 38, a étudié comment les deux (endotheliales) Les piles et extravasculaires (fibroblastes et de muscle lisse) intravasculaires cellules influent sur ​​la structure de fibrine 39, viscoélastique utilisé et l'analyse spectrale à analyser les structures de fibrine 40, et corrélations développés entre la structure de fibrine et les propriétés mécaniques utilisant des approches expérimentales et informatiques 41 in vitro fibrinogène glycation. Pour simuler les conditions de coagulation drépanocytaires, une augmentation des concentrations de fibrinogène ont été mélangés avec hématocrite falciforme recueillies auprès de patients comme précédemment par notre groupe 42. Ces méthodes ont été utilisées pour examiner la structure et les fonctions impliquées dans la formation de caillot de fibrine et de la fibrinolyse dans des conditions malades, ainsi que les mécanismes qui induisent les maladies cardiovasculaires. Basé sur l'information courante sur ces maladies, les structures de fibrine caillot glyquée étaient plus dense avec moins d'unnd pores plus petits. Les caillots de fibrine avec les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose (RBC) étaient également plus dense et affichées agrégation des globules rouges et des grappes agglomérées de fibrine. Ce est un phénomène bien établi qui a été précédemment déterminé 43. On a également émis l'hypothèse que le taux de la fibrinolyse est sensiblement inférieure à la formation de caillots de fibrine avec ou sans glyquées réduite par rapport à la plasmine en bonne santé, la fibrine normal. Les résultats ont montré que, pour la formation de caillots de fibrine glyquées, des résultats sensiblement différents de taux de lyse n'a été observée que dans des conditions de concentration de la plasmine réduite. Cette technique expérimentale de l'utilisation de la microscopie confocale offre des avantages significatifs par rapport à d'autres méthodes d'imagerie parce que les cellules et les protéines restent dans leur état natif, ce qui permet la capture de vidéo en temps réel de l'activité de coagulation. Cette méthode de coagulation synthétiquement induction est également moins coûteux et plus efficace du temps que l'obtention d'échantillons de patients et le filtrage out individueldes protéines et des enzymes. En outre, en utilisant des protéines et des enzymes séparés de synthétiser des caillots, les caillots ont été normalisées de sorte qu'il n'y avait pas variabilité entre les échantillons à la suite d'autres protéines dans le plasma.

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Protocol

REMARQUE: Le protocole suivant est conforme aux orientations fixées par le Conseil d'examen institutionnel (IRB) à Georgia Tech.

1. Collecte de sang et de globules rouges Isolation procédure

  1. Recueillir 40 à 120 ml de sang provenant de donneurs dans 10 ml tubes Vacutainer héparinisés. Lancer PBMC (cellules mononucléées du sang périphérique) isolement au sein de quatre heures de la collecte. Pendant ce temps, maintenir le sang à température ambiante.
    REMARQUE: O / N stockage du sang en RT ou 4 ° C ne est pas recommandé car cela se traduira par un rendement plus faible CMSP.
  2. Diluer sang total 1: 1 dans de la glace-froid (4 ° C) PBS stérile.
  3. Pipette 10 ml de glace-froid polysaccharide hydrophile en un, 50 ml tube conique stérile vide. Transférer doucement sang total dilué sur le dessus du polysaccharide hydrophile.
  4. Utiliser une pipette de 25 ml dans le sang et à prise lente de la pipette le long du côté du tube très lentement. Assurez-vous que le sang ne est pas mélangé avec le saccharide avant Centrifugation parce que le polysaccharide hydrophile est toxique pour les cellules et les autres, le rendement PBMC sera plus faible.
  5. Centrifuger des échantillons de sang pour 30 min à 400 g à 4 ° C. Le cas échéant, réduire la vitesse de frein de la centrifugeuse à la moitié du maximum pour une meilleure séparation après centrifugation.
  6. Aspirer la fraction plasma / plaquettes de l'échantillon de sang centrifugé. Aspirer soigneusement la couche de polysaccharide hydrophile directement au-dessus de la couche de RBC emballé.
  7. Recueillir 8-10 ml de globules rouges emballés et diluer 1: 1 avec 0,9% de NaCl non stérile saline.

2. confocale Microscopie évaluation de glyquée Structures Clot (simulées diabétiques caillots)

  1. Dégivrage fibrinogène humain marqué par fluorescence et de fibrinogène humain conjugué à 37 ° C.
  2. Pipetter le suivant dans un 0,5 ml tube gradué à centrifuger.
    1. Pour les caillots de fibrinogène, normaux en bonne santé, mélanger fibrinogène humain avec 10% marqué par fluorescence fibrinogène humainconjugué dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM à une concentration de 5 mg / ml.
    2. Pour fibrinogène glyquée artificiellement (pour simuler les caillots diabétiques), incuber fibrinogène humain et de 10% de fibrinogène marqué par fluorescence conjugué dans une solution à 5 mM de glucose dissous dans Tris / NaCl 100 mM 50 pour une concentration résultante de 6,8 mg / ml.
  3. Couvrir les tubes micro-centrifugeuse en utilisant un matériau opaque pour éviter l'exposition à la lumière. Incuber les tubes dans un bain d'eau à 37 ° pendant 48 heures.
  4. Faites une chambre sur une lame de microscope en verre par l'apposition d'une mince adhésif sur 2 côtés de la lame.
  5. Après la période d'incubation de 48 heures, préparer des réactifs pour la formation de fibrine par la thrombine et la décongélation FXIIIa alpha humain à TA.
  6. Diluer FXIIIa à 80 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2.
  7. Diluer la thrombine à 4 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2.
    1. Pour caillots normaux, se assurer que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 2,5 mg / ml, 20 U / ml et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul.
    2. Pour les caillots glyquées, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont 3,4 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul.
  8. Immédiatement pipette 30 ul de la solution de fibrine dans la chambre formée par l'adhésif.
  9. Placez un 22 mm x 22 mm lamelle de verre d'une épaisseur de 0,15 mm sur le dessus des deux couches d'adhésif. Sceller les côtés ouverts avec adhésif transparent pour empêcher le caillot de fibrine de se dessécher. Se assurer que l'adhésif ne interagit pas avec le caillot de fibrine.
  10. Autoriser les caillots de fibrine polymériser à 21-23 ° C pendant 2 heures avant l'imagerie confocale.
  11. Prendre des images de microscopie confocale des caillots utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1,30 huile M27 avec un laser à argon 488 nm.

3. microscopie confocale évaluation des caillots de fibrine contenant des hématies de patients Sickle Cell

  1. Dégivrage fibrinogène humain marqué par fluorescence et de fibrinogène humain conjugué à 37 ° C.
  2. Pipetter le suivant dans un 0,5 ml tube gradué à centrifuger.
    1. Pour la bonne santé, un caillot de fibrine normale, mélanger le fibrinogène humain avec 10% de conjugué marqué par fluorescence du fibrinogène humain dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM à une concentration de 5 mg / ml.
    2. Pour les caillots contenant des globules rouges SCD, mélanger le fibrinogène humain et de 10% de conjugué marqué par fluorescence du fibrinogène humain dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM de sorte que la concentration résultante du fibrinogène est de 10 mg / ml.
  3. Étiqueter les globules rouges isolés (à la fois normales et ceux provenant de patients drépanocytaires obtenues à partir du protocole d'isolement RBC) en utilisant une solution cellulaire étiquetage.
    1. Suspendre les cellules à une densité de 1 x 10 6 par ml dans un milieu de culture sans sérum choisi.
    2. Ajouter 5 ul / ml de la suspension cellulaire à la solution de cellules étiquetage. Mélangez bien par pipetage doux doucement.
    3. Centrifuger les tubes de suspension marqués à 1500 rpm pendant 5 min à 37 ° C.
    4. Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 37 ° C moyenne.
    5. Répétez la procédure de lavage (3.3.4 et 3.3.5) deux fois de plus.
  4. Diluer FXIIIa à 80 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2.
  5. Diluer la thrombine à 4 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2.
    1. Pour caillots normaux, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 2,5 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul.
    2. Pour les caillots contenant SCD globules rouges, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 5 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul.
  6. Introduire à la pipette 10 ul des globules rouges marqués dans la solution de fibrine. Pipette 30 ul de la fibrine avec des hématies sur le verre de microscope (voir glisser préparation glycated caillots).
  7. Laisser la fibrine polymériser à 21-23 ° C pendant 2 heures avant l'imagerie confocale.
  8. Prenez images confocales des caillots à l'aide du microscope confocal, et d'utiliser des lasers d'excitation avec des longueurs d'onde de 488 nm et 633 nm pour exciter la fibrine marqué par fluorescence et de globules rouges.

4. microscopie confocale évaluation de la fibrinolyse Tarifs en glyquée Structures Clot

  1. Répétez le protocole de microscopie confocale de caillots glyquée (Protocole Step 2) pour l'évaluation du taux de la fibrinolyse dans caillots glyquée.
  2. Ne pas fermer les extrémités de la chambre avec un adhésif clair. Laisser les caillots de fibrine à polymériser pendant 1,5 heures à 21-23 ° C dans une enceinte étanche contenant 250 ml d'eau pour éviter la déshydratation.
  3. Après polymérisation, d'obtenir des images des caillots à l'aide du microscope confocal.
  4. Pipette plasmine dans l'extrémité ouverte de la chambre et disperser la plasmine par l'intermédiaire du caillot par action capillaire.
    1. Pourles expériences de la fibrinolyse normales et avec des concentrations normales glyquées, pipette 25 ul à 200 pg / ml de plasmine dans l'ouverture de la chambre.
    2. Pour les caillots glyquées, avec des concentrations réduites pipette 25 ul à 50 ug / ml dans l'ouverture de la chambre.
  5. Utilisez la fonction de séries chronologiques (voir la figure 1) dans le logiciel de microscope confocal à capturer en temps réel des séquences vidéo de la plasmine lyse du caillot.
    1. Cliquez sur le mode d'acquisition, puis sélectionnez «Time Series". Sélectionnez le nombre de cycles et l'intervalle de temps d'enregistrement.

5. Calcul de la fibrinolyse Tarifs

  1. Déterminer le taux de lyse en définissant un espace (2500 um 2) et en calculant le temps écoulé nécessaire pour dissoudre une zone fixe du caillot. Calculer le taux de lyse à l'aide de l'équation suivante (figure 2):
    Equation 1

6. Analyse statistique de la fibrinolyse Tarifs

  1. Analyser les données de lyse en utilisant un logiciel d'analyse statistique. Effectuer une analyse de variance à une voie et un post hoc de Tukey-Kramer 44,45 essai.

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Representative Results

Microscopie confocale Analyse des glyquée fibrine Structures Clot

Les images de microscopie confocale de caillots normaux et glyquée sont présentés dans la figure 3. Confocale analyse au microscope des caillots normaux et glyquée révèle que caillots glyquée sont plus denses avec des pores plus petits que les caillots normaux à la fois avec et sans l'ajout de FXIIIa cours de la polymérisation caillot. Sur la figure 3A et 3B, il ya une concentration plus faible de fibrine qui a créé une structure moins dense que les caillots glyquée avec une concentration plus élevée de fibrine (figures 3C et 3D).

La plus grande densité observée (nombre de fibres par unité de surface) dans les caillots glyquées est le résultat de l'augmentation de la concentration en fibrinogène qui se produit chez les personnes atteintes de diabète. Dans les caillots normaux, les fibres de fibrine sont plus linéaire et formées lors de la polymérisation des fibres plus longues avec FXIIIa, quiest probablement le résultat de la FXIIIa former des reticulations entre les fibres. Dans le cas des caillots glyquées, les fibres semblent être plus courte, même avec addition de FXIIIa. Ceci est probablement le résultat du procédé de polymérisation qui a été modifiée en raison de la présence de régions glyquées sur la molécule de fibrinogène. En outre, l'analyse de la figure 3, il est probable que l'épaisseur de la fibre est également réduit en raison de la glycation, ce qui est probablement la raison pour laquelle la fluorescence des fibres glyquées semblent avoir une intensité plus faible.

Microscopie confocale Analyse des caillots de fibrine contenant des hématies de patients Sickle Cell

Les images de microscopie confocale de la structure de caillots avec la normale et les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose caillot de fibrine sont présentés à la figure 4. Comme prévu, les images confocales des caillots de fibrine contenant des globules rouges à partir de patients atteints de drépanocytose avaient des structures plus denses que celles de santé fibrine clots. La figure 4A montre une répartition homogène de la fibrine et des globules rouges normaux. Cependant, la figure 4B, il ya des amas de fibrine et vides où aucun réseau de fibrine formé. Les globules rouges de patients drépanocytaires ont pas été homogène dispersés, mais ont été intégrés dans les amas de fibrine. La densité accrue (nombre de fibres par unité de surface) est le résultat de l'augmentation de la concentration en fibrinogène qui se produit à la suite d'hypercoagulabilité dans drépanocytaires. En outre, la tendance naturelle des globules rouges de patients drépanocytaires à former des agrégats engendré amas de globules rouges qui sont devenus entrelacés dans le réseau de fibrine. Il en est résulté la formation de structures de caillots aberrantes qui sont sensiblement différentes de la morphologie que celles des patients normaux. D'après la figure 4B, on observe que les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose provoqué une plus grande hétérogénéité dans l'échantillon de fibrine et également provoqué une distribution spatiale plus large de globules rouges dans l'échantillon de fibrine, lorsque comcomparé à l'caillots de fibrine en bonne santé avec des globules rouges normaux. En revanche, les caillots de fibrine avec des globules rouges sains normaux ont montré une dispersion plus homogène de cellules dans le réseau de fibrine.

On ne sait pas combien d'HbS (faucille hémoglobine) a été polymérisé dans les érythrocytes de patients drépanocytaires et est contenue dans les échantillons. Ce qui est connu, cependant, est que la présence de toute quantité de HbS provoque une plus grande agrégation des cellules en nombre de molécules HbS par unité de volume par rapport aux molécules de HbA normales. Pan et al. 46 ont démontré ce phénomène dans une étude où ils ont comparé les effets d'agrégation / regroupement de désoxy-HbS, et, à titre de comparaison, d'oxy-HBs et de l'hémoglobine adulte oxy-normale, HbA. Les groupes formés en quelques secondes après la préparation de la solution et de leurs tailles et leur nombre est demeuré relativement stable jusqu'à 3 h. Une des conclusions de l'étude est que les deux molécules oxy-HBs et désoxy-HBs regroupées à un certain nombre den supérieursité de molécules oxy-HBA (normal) en fonction de la température. Se rapportant à la présente étude, cela signifie que les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose étaient susceptibles de se regrouper et piégés comme il a été fibrine étant polymérisé à partir du précurseur de fibrinogène.

Microscopie confocale Lysis analyse du taux de la normale et glyquée Clots

Il a émis l'hypothèse que les taux de la fibrinolyse seraient plus de caillots de fibrine normales par rapport à la formation de caillots de fibrine glyquée avec diminution de la concentration de plasmine. Pour tester cette hypothèse, la microscopie confocale a été utilisée pour évaluer le taux de formation de caillots de fibrine de lyse avec l'addition de plasmine. La moyenne (moyenne) des taux de fibrine normale avec l'ajout de 200 pg / ml de plasmine de lyse était de 43,2 ± 26,5 pm 2 / s et la moyenne (moyenne) des taux de lyse de la fibrine glyquée avec l'ajout de 200 pg / ml de plasmine a été 29,7 ± 11,2 pm 2 / sec. Pour le caillot de fibrine glyquée lysées avec50 pg / ml de plasmine, le taux de lyse moyenne était de 12,8 ± 3,1 um 2 / se. Un total de 10 échantillons chacune (30 échantillons) ont été utilisés pour déterminer les valeurs moyennes et l'écart type. Ces valeurs sont présentées dans la figure 5. Une valeur p de 0,05 a été utilisé pour déterminer la signification entre les groupes expérimentaux indépendants. L'analyse des taux de fibrinolyse a démontré que la valeur pour les caillots normaux par rapport aux diabétiques simulées (caillots) glyquée a diminué avec la plasmine étaient significativement différentes.

Figure 1
, Imagerie continue de caillot de fibrine lyse. Figure 1. Exemple de capture d'écran d'un logiciel de microscope confocal méthode pour obtenir en temps réel détaillant Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de this figure.

Figure 2
Figure 2. Exemple image confocale avec zone fixe utilisé pour calculer le taux d'échantillon de caillot de fibrine de lyse. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Images confocales (diabétiques) de caillots de fibrine en bonne santé et glyquées. Fluorescence verte représente le réseau de fibrine. La fibrine unglycated représente caillots formés chez les patients en bonne santé, alors que la fibrine glyquée représente caillots formés chez les patients diabétiques. (A) de la fibrine Unglycated sans addition de FXIIIa. (B) de fibrine Unglycated avec FXIIIa. (C (D) de fibrine glyquée avec FXIIIa. La barre d'échelle rouge indique 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Les images confocales de caillots de fibrine en bonne santé avec des globules rouges normaux et des caillots de fibrine avec des globules rouges de patients drépanocytaires. Fluorescence verte représente le réseau de fibrine et magenta représente étiquetés en bonne santé et les globules rouges de patients drépanocytaires. (A) des globules rouges sains dans la concentration de fibrine normale avec FXIIIa et (B) Augmentation de la fibrine avec FXIIIa et les globules rouges provenant d'un patient drépanocytaire. La barre d'échelle blanc indique 50 um. Les cercles blancs dans l'image (B) indiquent hématies falciformes reconnaissables.

Figure 5
Figure 5. Taux de fibrinolyse de caillots de fibrine normales par rapport à glyquée caillots (diabétique) de fibrine et de caillots glyquée avec la concentration de plasmine réduite. La signification statistique a été déterminée sur la base d'une ANOVA à une voie et un hoc Tukey-Kramer test post de comparaisons multiples. L'analyse ANOVA a montré qu'il y avait une différence significative entre les moyennes des taux de lyse. Le test de Tukey-Kramer a montré qu'il y avait une différence significative dans les moyennes entre les caillots normaux et des caillots avec diminué plasmine avec un p <0,05. Le * indique une différence significative de caillots normaux.

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Discussion

Pour obtenir des données significatives sur la structure des mécanismes de coagulation dans des états pathologiques, il est important d'isoler les facteurs impliqués dans la coagulation pour déterminer les effets des protéines et des cellules dans ces conditions. Ce protocole a été développé pour les fins de l'enquête sur la structure du caillot de fibrine dans les états diabétiques et SCD in vitro.

Il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans la formation de fibrine et de la fibrinolyse dans les états pathologiques depuis conditions modifiées provoquent hypercoagulation, athérothrombose, et les maladies cardiovasculaires. A partir des images confocales obtenus dans cette expérience, il est évident que l'activité de hypercoagulation se produit dans des états diabétiques et SCD, ce qui provoque une augmentation de la concentration en fibrinogène. Une augmentation des résultats de concentration en fibrinogène dans un réseau de fibrine plus dense avec plus de points de branchement et des pores plus petits à travers le réseau. Dans les réseaux de fibrine des drépanocytaires, non seulement est-il plus la fibrine présente, but la nature agrégation des érythrocytes de patients drépanocytaires modifie également la structure du réseau car il emprisonne la fibrine en grappes. L'agglomération des globules rouges de patients drépanocytaires réduit également la porosité des amas de fibrine dans le réseau, mais semble augmenter la concentration vide dans l'ensemble du réseau. Les résultats de l'analyse de la fibrinolyse des caillots glyquée appuyé l'hypothèse du taux de lyse de caillots glyquée étant inférieure avec la plasmine réduite que celle de caillots normaux, sains. Cependant, les résultats ne ont pas fourni de preuves concluantes sur les taux de caillots glyquée avec des concentrations normales de plasmine de lyse. Ainsi, il peut être conclu que pour les patients diabétiques présentant une concentration normale de la plasmine, il peut y avoir une activité de fibrinolyse suffisante pour dégrader les caillots de fibrine d'une manière efficace.

Pour les expériences réalisées dans cette étude de recherche, des protéines et des globules rouges isolés ont été utilisés, au lieu de sang total et de plasma. En utilisantprotéines séparées pour synthétiser les caillots de fibrine, les causes de structures modifiées entre la normale vs caillots malades ont pu être déterminées. Cela réduit grandement la possibilité d'avoir d'autres protéines plasmatiques interfèrent avec la structure et la morphologie des caillots de fibrine. Toutefois, en utilisant des protéines isolées, il est crucial pour stocker et manipuler les cellules et les protéines correctement, car ils sont plus vulnérables à la mort cellulaire et la dégradation des protéines.

La technique d'imagerie par microscopie confocale choisi pour cette étude est due à la possibilité d'obtenir des images des structures fibrine des caillots tout en conservant les propriétés antithrombotiques naturels des cellules et des protéines. La microscopie confocale a également été montré pour donner un meilleur contraste et une résolution optique de l'échantillon avec un bruit réduit par rapport à microscopie lumineuse traditionnelle. La lumière laser est dirigé dans un trou d'épingle qui bloque la lumière de pénétrer dans le vague. L'utilisation de la microscopie confocale évité la nécessité de laaddition de produits chimiques de fixateur; ainsi les cellules et les protéines ont été en mesure de maintenir leur activité de la protéine naturelle de la formation de caillots de fibrine. En conséquence, les cellules, les protéines et les enzymes fonctionnent dans leur état natif, ce qui permet l'utilisation de la microscopie confocale pour capturer des images vidéo et de l'activité en temps réel. Avec la microscopie confocale, des images 3D des caillots de fibrine ont été capturés et vidéos de digestion à la plasmine de caillots de fibrine ont été obtenues en temps réel. Lors de l'ajout de la plasmine caillot pour capturer une vidéo de la série chronologique du procédé de lyse de caillot, il est important d'utiliser l'action capillaire par l'intermédiaire de plasmine pour disperser de manière homogène de l'enzyme à travers la matrice de fibrine. Cela a été fait pour se assurer que la concentration de la plasmine a été ajoutée et on laisse la précision enzyme pour lyser l'ensemble du caillot, contrairement à la zone locale que la plasmine a été ajouté.

Le procédé et les résultats obtenus dans cette étude étaient similaires à une étude effectuée par Dunn et al, qui a trouvé que la lyse du caillotles taux étaient significativement plus faibles chez les sujets diabétiques que les sujets témoins 25. Dans les deux études, il y avait des différences significatives dans les taux de diabétiques caillots (glyquée) de lyse; Toutefois, le protocole actuel peut représenter fidèlement États diabétiques en raison des niveaux de plasmine réduits. De plus, dans cette étude fibrinolyse a été capturé en continu en temps réel à l'aide du microscope confocal, contrairement à l'analyse de sections discrètes à des intervalles de temps différents. Wooton et al. 47 ont étudié caillot de fibrine lyse et utilisé une vitesse de lyse avant (cm / s) pour enquêter sur le taux de lyse de caillots. Ils ont utilisé l'analyse d'image confocale dans leur étude pour déterminer la vitesse du front. Dans la présente étude, à la place d'une vitesse de lyse avant, une vitesse de zone de lyse a été utilisé (à cause de la façon dont l'image a été analysée sur la confocal). Afin de valider la méthode développée dans notre étude, les auteurs ont décrit en 48 un modèle mathématique de la lyse du caillot de fibrine par la plasmine, dans laquelle ils prescrivent la vitesse de lyse avant en fonction de la constante de vitesse effective de la fibrinolyse. L'équation est donnée comme suit:
Equation 2

Ici, Équation 3 représente la constante de vitesse effective de la fibrinolyse, K a est la constante d'adsorption, C h est la concentration de la plasmine, et Fn ρ est la densité de la fibrine. Si la grandeur mesurée Equation 4 (Mesurée à partir de l'analyse confocale dans l'étude en cours) est utilisée et la règle de la chaîne est utilisé, ce qui conduit à:
Equation 5

t "> En supposant une seule dimension change par unité de temps conduit à:

Equation 6

Equation 7

Ainsi, la constante de vitesse de la fibrinolyse efficace pour l'expérience conduit à:
Equation 8

Cette relation en déduit que la constante de taux effectif de la fibrinolyse ( Equation 9 ) Est une fonction de la concentration de la plasmine (C h) et du taux de lyse de surface Equation 10 .

Cette technique est également importante pour l'étude de la thrombose chezDrépanocytaires, car il sait très peu sur la fibrine et les mécanismes de coagulation à l'égard de cette maladie. Il ya eu très peu d'études menées sur les effets de la SCD sur la structure de caillots de fibrine; ainsi les images confocales recueillies par cette étude fournit la visualisation rare de la structure de caillot avec des hématies falciformes incorporés.

Pour comparer les différences de moyens entre les groupes, utiliser une analyse de variance à une voie et un test post hoc de Tukey-Kramer. A une analyse de la variance est un test statistique utilisée pour déterminer une différence statistiquement significative entre les moyennes de groupes indépendants. Le post-test de Tukey-Kramer est utilisé pour comparer les moyens de chaque groupe indépendant et déterminer les moyens de les groupes sont statistiquement différents les uns des autres. Avant d'effectuer un aller-simple analyse de la variance, il ya six hypothèses qui doivent être remplies pour se assurer que les résultats sont valides. Les six hypothèses sont: une variable (taux de lyse) dépendante continue, une varia indépendanteble constitué par deux ou plusieurs groupes indépendants catégoriques (normal, glyquée, et glycosylée réduite avec la plasmine), et indépendamment observé données dans chaque groupe de telle sorte que l'un événement survenant ne affecte pas l'autre cas (ce qui garantit qu'il n'y a pas de chevauchement dans les données). , l'ensemble de données ne contenant pas de valeurs aberrantes importantes, normalement distribué données vérifiées par le test statistique de Shapiro-Wilk, et l'homogénéité des variances dans les données vérifiées par le test statistique Levene. Une fois ces hypothèses ont été remplies, une analyse de variance à une voie et un test post hoc de Tukey-Kramer ont été réalisées avec une valeur p de 0,05 comme seuil pour déterminer la signification statistique. Pour un détail rigoureuse de l'une ANOVA et test de Tukey-Kramer post-hoc, reportez-vous à 44,45.

Dans l'ensemble, cette méthode permet pour l'imagerie de caillots de fibrine normaux et anormaux (en raison de états pathologiques) dans leurs états indigènes. Le procédé fournit également des détails pour l'imagerie en temps réel de la lyse du caillot etque l'analyse statistique des taux de lyse. La facilité avec laquelle le thrombus peut être produite et reproduite in vitro est utile pour une large gamme d'applications en génie cellulaire et tissulaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).

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