Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Normal ve Hastalıklı Devletleri'nde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

Bir kan geminin endotel astar yaralanması hemostatik yanıt, ya da bir kan pıhtısı oluşumu ile tamir edilir. Kan hücre dışı matris içine nüfuz zaman, doku faktörleri koagülasyon kaskad başlatılmasını kolaylaştırmak, kan akışında trombositleri aktive. Bu iyileşme sürecinin önemli mekanik parça son derece esnek olan fibrin liflerden oluşan fibrin matrisi, ve büyük kuvvetler 1-4 muhafaza eder. Birçok araştırmacı yoğun geçmiş yıllarda 5-13 fibrin oluşumu yapısı ve fonksiyonu inceledik.

Diabetes mellitus ve orak hücre olarak hastalıkları olan hastalar gibi miyokard enfarktüsü, iskemik kalp hastalığı gibi trombotik komplikasyonların gelişme riski, ve 14-19 okşar. 2 milyondan fazla insan yeni Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl diyabet tanısı konur. Tip I nerede,: diyabet iki türü vardırvücut insülin dirençli hale insülin ve Tip II, yeterli miktarda üretemez. Diyabetik hastalarda, kardiyovasküler hastalık (CVD) hastalığı 20,21 ile ilişkili morbidite ve mortalitenin% 80 nedenidir.

Orak hücre hastalığı (SCD) Amerika Birleşik Devletleri 22 100.000'den fazla insanı etkileyen bir genetik kan hastalığıdır. OHA zor hücreler, kan damar 23 geçmesi için yapım, hilal şeklinde olmak üzere, kırmızı kan hücrelerinin neden olan bir nokta mutasyon hastalıktır. Bu hastalık durumlarının her iki gövde aterosklerotik durumları geliştirme ihtimalini artırır. Bunun nedenlerinden biri, hastalıklı devletlerin 14,24-26 değişmiş fibrin yapısı ve fonksiyonu bir sonucudur.

Her iki diyabet ve orak hücre hastalığında, hiperkoagülasyon ve Aterotrombozu ve kardiyovasküler hastalık neden olur hipofibrinolizin aktivitesi (C varVD) sağlıklı hastalarda 17,27,28 ile karşılaştırıldığında. Bu hipofibrinolizin aterosklerozun ilerlemesini teşvik eder ve erken koroner arter hastalığı 29 olan hastalar için tekrarlayan iskemik olayları doğurur bilinmektedir. Mevcut yazıda, bu özel ortamda fibrin fiziksel özelliklerinin rolü araştırıldı. Olmayan hastalıklı hastalarda fibrin pıhtısı yapıları, ince lifler, daha büyük gözenekleri ve daha az yoğun, genellikle 14,24 oluşmaktadır. Sağlıklı hastalarda artan bir geçirgenliğe ve daha az yoğun bir fibrin pıhtısı fibrinoliz 16 kolaylaştırmak için tespit edilmiştir. Diyabetik ve orak hücre hastalığı gibi hyperthrombotic koşullarda sağlıklı hastalarda 30-33 2.5 mg / ml, normal seviyelerine artış fibrinojen neden fibrinojen üretiminde bir artış vardır. Sağlıklı, sigara dia göre diyabetik hastalarda oluşan fibrin pıhtılar daha fazla dal noktalarını, ve daha yoğun, daha sert ve daha az gözenekli olduğu tespit edilmiştirdiyabetik hastalarda 14,24,33-35. değiştirilmiş fibril bağları pıhtı oluşumunda rol oynayan proteinlerde meydana gelen glikozilasyon mekanizmasının bir sonucudur. Glukoz molekülleri, uygun bir şekilde çapraz bağlama glutamin ve lisin tortuları 33,36,37 insan faktör XIIIa (FXIIIa) inhibe fibrinojen molekülü, lizin artıklarının bağlanan zaman Enzimatik olmayan (geri dönüşümsüz) glikasyonu oluşur.

Fibrin ağlarının yapısal analiz son zamanlarda yoğun çalışılmıştır. Özellikle, araştırmacılar elektron mikroskobu ve intravasküler (endotel) hücreleri ve ekstravasküler (fibroblastlar ve düz kas) hem hücreler fibrin yapıları 40 analiz fibrin yapısı 39, kullanılan viskoelastik ve spektral analiz nasıl etkilediğini araştırdık fibrin ağları 38, 3D rekonstrüksiyon ve kullanmıştır Fibrin yapısı ve mekanik özellikleri arasında gelişmiş korelasyon deneysel kullanarak ve hesaplamalı yaklaşımlar 41 in vitro olarak fibrinojen glikasyonunu uyarılması için glikoz çözeltisi içinde kuluçkalanmıştır. Orak hücre hastalığı pıhtılaşma koşulları simüle etmek için, artmış fibrinojen konsantrasyonları grubumuza 42 tarafından daha önce yapıldığı gibi hastalardan toplanan orak hücre hematokrit ile karıştırıldı. Bu yöntemler, yapı ve hastalıklı koşullar altında, fibrin pıhtısı oluşumu ve fibrinolizde rol alan ve fonksiyonları, yanı sıra CVD neden mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu hastalıklar hakkında güncel bilgilere dayanarak, glike fibrin pıhtı yapıları daha az a ile yoğun olduğunund küçük gözenekler. Orak hücre hastalarında (eritrositler) kırmızı kan hücreleri ile fibrin pıhtıları da yoğun ve eritrosit agregasyonunu ve aglomere fibrin kümeleri görüntülenir. Bu, daha önce 43 tespit edilmiştir köklü bir olgudur. Ayrıca fibrinoliz oranı ile sağlıklı, normal bir fibrin kıyasla azalmış plazmin olmadan glike fibrin pıhtıları anlamlı olarak düşük olacağı varsayılmıştır. Sonuçlar, glikolize fibrin pıhtılaşması için önemli ölçüde farklı lisis oranı sonuçları yalnızca sınırlı plazmin konsantrasyonu durumunda görüldüğünü göstermiştir. Hücreler ve proteinler pıhtılaşma faaliyetinin gerçek zamanlı video yakalama sağlayan kendi ana devlet kalır, çünkü konfokal mikroskopi kullanılarak bu deneysel tekniği diğer görüntüleme yöntemlerine göre önemli avantajlar sunmaktadır. Sentetik indükleyici pıhtılaşma Bu yöntem, hasta örnekleri elde etmek ve bireysel filtreleyerek daha da ucuz ve daha fazla zaman verimliproteinler ve enzimler. Örnekler arasında değişkenlik plazma diğer proteinler sonucu olmadığını Bundan başka, pıhtı sentezlenmesi için ayrılmış proteinler ve enzimler kullanarak, pıhtılar standardize edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Aşağıdaki protokol Georgia Tech Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uyar.

1. Kan Toplama ve Eritrosit İzolasyon Prosedürü

  1. 10 ml heparinli boşaylı tüpler içinde bağışçılardan kan 40-120 ml toplayın. Toplama 4 saat içinde PBMC (periferal kan mononükleer hücre) izolasyon başlatın. Bu süre boyunca, oda sıcaklığında kan tutun.
    NOT: Bu alt PBMC verim neden olacak gibi RT ya da 4 ° C kan O / N depolama tavsiye edilmez.
  2. Tam kan 1 seyreltin: 1 buz soğukluğundaki (4 ° C) steril PBS içinde.
  3. Pipet boş bir steril 50 ml konik bir tüp içine buz soğukluğunda hidrofilik polisakarit 10 mi. Yavaşça hidrofilik polisakaritin üzerine seyreltilmiş tam kan aktarın.
  4. Çok yavaş tüpün kenarı boyunca yavaş ayarı ve pipet kanda 25 ml'lik pipet kullanın. Kan CENTRI önce sakkaritte ile karışık olmadığından emin olunhidrofilik polisakkaridler, aksi hücreleri ve toksik olan fugation için PBMC verimi daha düşük olacaktır.
  5. 4 ° C'de 400 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj kan örneği alındı. Varsa, santrifüj sonra daha iyi ayrılması için maksimum yarısına santrifüj fren hızını azaltır.
  6. Santrifüj kan örneğinin plazma / trombosit fraksiyonu kapalı aspire. Dikkatle doğrudan paketlenmiş RBC katman üzerinde hidrofilik polisakkarit tabakası aspire.
  7. Paketlenmiş RBCs 8-10 ml toplayın ve 1 sulandırmak: steril olmayan% 0.9 NaCl serum fizyolojik ile 1.

2. Konfokal Mikroskopi Değerlendirme Glike ve pıhtı Yapıları (Simüle Diyabetik pıhtısı)

  1. 37 ° C 'de, insan fibrinojen ve floresan etiketli insan fibrinojen konjugatı defrost.
  2. Pipet 0.5 ml aşağıdaki mikrosantrifüj tüp mezun oldu.
    1. Sağlıklı normal fibrinojen pıhtılaşması için,% 10 floresan etiketli insan fibrinojen insan fibrinojen karıştırın5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 50 mM Tris / 100 mM NaCI tampon maddesi içinde konjugat.
    2. Yapay glikozile fibrinojen için, (diyabetik pıhtıları gibi örneğin) 6.8 mg / ml'lik bir konsantrasyon elde edilen 50 mM Tris / 100 mM NaCI içinde çözülmüş glikoz 5 mM bir çözeltisi içindeki insan fibrinojen ve% 10 floresan etiketli fibrinojen konjugatı inkübe edilir.
  3. Işığa maruz kalmasını önlemek için bir opak malzeme kullanılarak mikro-santrifüj tüplerine örtün. 48 saat süre ile 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin.
  4. Sürgünün 2 tarafı üzerinde ince bir yapışkan sabitlenmesiyle, bir cam mikroskop lamı üzerine bir bölme yapın.
  5. 48 saatlik bir bekletme süresinden sonra, oda sıcaklığında FXIIIa ve insan alfa trombini çözülüp, fibrin oluşumu için reaktifler hazırlamak.
  6. 5 mM CaCl2 tampon içinde 80 U / ml FXIIIa seyreltin.
  7. 5 mM CaCl2 tamponu içinde 4 U / ml trombin seyreltin.
    1. Normal pıhtılar için, fibrinojen, FXIIIa ve trombinin nihai konsantrasyonlar 2.5 m sağlamakg / ml, 20 U / ml, ve sırasıyla 50 ul bir hacimde, 1 U / ml olmuştur.
    2. Glikozillenmiş pıhtıları için, fibrinojen FXIIIa ve trombin nihai konsantrasyonları sırası ile 50 ul'lik bir hacimde, 3.4 mg / ml, 20 U / ml ve 1 U / ml olduğundan emin olun.
  8. Hemen yapışkanın oluşturduğu odasına fibrin çözeltisi 30 ul pipetle.
  9. Yapışkan 2 kat üstüne 0.15 mm'lik kalınlığa sahip bir 22 mm x 22 mm ebadındaki bir cam kapak kayma yerleştirin. Kurumasını fibrin pıhtısı önlemek için açık yapıştırıcı ile açık yanlarını Seal. Yapışkan fibrin pıhtısı ile etkileşim olmadığından emin olun.
  10. Fibrin pıhtıları konfokal görüntüleme önce 2 saat 21-23 ° C'de polimerize izin verin.
  11. 488 nm Argon lazer ile 40X / 1.30 Yağ M27 lens ile bir konfokal mikroskop kullanılarak pıhtıları konfokal mikroskopi görüntüleri çekmek.

Orak Hücre Hastalarda gelen eritrositlerde İçeren Fibrin pıhtısı 3. Konfokal Mikroskopi Değerlendirme

  1. 37 ° C 'de, insan fibrinojen ve floresan etiketli insan fibrinojen konjugatı defrost.
  2. Pipet 0.5 ml aşağıdaki mikrosantrifüj tüp mezun oldu.
    1. Sağlıklı normal fibrin pıhtısı için, 5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 50 mM Tris / 100 mM NaCI tampon maddesi içinde% 10 floresan etiketli insan fibrinojen konjügatı ile insan fibrinojen karıştırın.
    2. SCD eritrositlerde ihtiva eden pıhtılar için, fibrinojen sonuçtaki konsantrasyonunun 10 mg / ml olan bir 50 mM Tris / 100 mM NaCI gibi insan fibrinojen ve% 10 floresan etiketli insan fibrinojen konjugatı karıştırın.
  3. Bir hücre-etiketleme çözümü kullanılarak izole eritrositlerde (normal ve RBC izolasyon protokolü elde orak hücre hastalardan olanlar ikisi) Etiket.
    1. Seçilen herhangi bir serum içermeyen kültür ortamı içinde ml başına 1 x 10 6 yoğunluğunda süspanse.
    2. Hücre etiketleme çözeltisine hücre süspansiyonu 5 ul / ml ilave edilir. Nazik pipetleme ile iyice karıştırın yavaşça.
    3. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 rpm'de etiketli süspansiyon tüpleri santrifüjleyin.
    4. 37 ° C orta hücreleri yeniden askıya hafifçe Süpernatantı ve.
    5. Yıkama işlemi (3.3.4 ve 3.3.5) iki kez daha tekrarlayın.
  4. 5 mM CaCl2 tampon içinde 80 U / ml FXIIIa seyreltin.
  5. 5 mM CaCl2 tamponu içinde 4 U / ml trombin seyreltin.
    1. Normal pıhtılar için, fibrinojen, FXIIIa ve trombin nihai konsantrasyonları sırası ile 50 ul'lik bir hacimde, 2.5 mg / ml, 20 U / ml ve 1 U / ml olduğundan emin olun.
    2. SCD eritrositlerde ihtiva eden pıhtılar için, fibrinojen, FXIIIa ve trombin nihai konsantrasyonları sırası ile 50 ul'lik bir hacimde 5 mg / ml, 20 U / ml ve 1 U / ml olduğundan emin olun.
  6. Pipet fibrin çözeltisi içine etiketli eritrosit 10 ul. Pipet mikroskop camı üzerine eritrosit ile fibrin 30 ul (gl için hazırlık slayt bakınycated pıhtıları).
  7. Fibrin konfokal görüntüleme önce 2 saat 21-23 ° C'de polimerize izin verin.
  8. Konfokal mikroskop kullanılarak pıhtıları konfokal görüntüleri çekmek ve floresan etiketli fibrin ve eritrositlerde heyecanlandırmak için 488 nm ve 633 nm dalga boylarında ile uyarım lazerleri kullanıyoruz.

Glike pıhtı Yapılarında Fibrinolizis Oranları 4. Konfokal Mikroskopi Değerlendirme

  1. Glike pıhtıları içinde fibrinoliz oranı değerlendirmesi için glike pıhtıları (Protokol Adım 2) konfokal mikroskopi protokolünü tekrarlayın.
  2. Net yapıştırıcı ile odasının uçlarını mühür yok. Fibrin pıhtısı kaybını önlemek için 250 ml suyla ihtiva eden kapalı bir muhafaza içinde 21-23 ° C de 1.5 saat süre ile polimerize olmaya bırakın.
  3. Polimerizasyon sonra, konfokal mikroskop kullanılarak pıhtı görüntüleri elde edebilir.
  4. Pipet bölmesinin açık ucuna plazmin ve kılcal hareket aracılığı ile pıhtı ile plazmin dağıtılır.
    1. IçinNormal konsantrasyonlar, pipet odasının açıklığı içine plazmin, 200 ug / ml'de 25 ul normal glikozile fibrinoliz deneyleri.
    2. Düşük konsantrasyonlarda pipet odasının açıklığı içine 50 ug / ml'de 25 ul ile glikolize pıhtı için.
  5. Pıhtı yokedici plazminin gerçek zamanlı video görüntüleri yakalamak için konfokal mikroskop yazılımındaki zaman serisi özelliğini (bkz Şekil 1) kullanın.
    1. Satın alma modunu tıklayın ve ardından "Zaman Serisi." Döngü sayısını ve kayıt süresi aralığını seçin.

5. Fibrinolizis Fiyatlarını Hesaplama

  1. Pıhtı sabit alanı çözmek için gerekli geçen süreyi bir alanı (2,500 mikron 2) ayarlayarak ve hesaplayarak parçalama hızını belirleyin. Aşağıdaki denklem (Şekil 2) kullanılarak parçalama hızını hesaplayın:
    Denklem 1

Fibrinolizis Oranlarının 6. İstatistiksel Analiz

  1. İstatistiksel analiz yazılımı kullanılarak lizis verileri analiz. Bir tek-yönlü ANOVA ve hoc Tukey-Kramer testi 44,45 bir yazı gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Glike Fibrin pıhtı Yapıların Konfokal Mikroskopi Analizi

Normal ve glikolize pıhtı konfokal mikroskobu görüntüleri. Şekil 3'te sunulmuştur normal ve glikolize pıhtı mikroskopisi analizi Glike pıhtılar daha yoğun olan ve pıhtı polimerizasyon sırasında FXIIIa ilavesi olmadan hem normal pıhtıları daha küçük gözeneklere sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 3A ve 3B, daha yüksek bir fibrin konsantrasyonu (Şekil 3C ve 3D) ile glikolize pıhtıları daha az yoğun bir yapıya oluşturulan daha düşük bir fibrin konsantrasyonu vardır.

glikozillenmiş pıhtılar gözlenen yüksek yoğunluklu (birim alan başına lif sayısı) diyabetli kişilerde ortaya çıkar artmış fibrinojen konsantrasyonunun bir sonucudur. Normal pıhtılar fibrin lifleri daha doğrusal ve FXIIIa ile polimerizasyon üzerine uzun lifleri oluşmuşturmuhtemelen lifler arasında çapraz bağlar oluşturan FXIIIa bir sonucudur. Glikolize pıhtı durumunda dahi elyaf FXIIIa ilavesi ile, daha kısa olduğu görülmektedir. Bu büyük olasılıkla nedeni fibrinojen molekül üzerinde glikolize bölgelerin varlığı değiştirildi polimerizasyon işleminin bir sonucudur. Buna ek olarak, Şekil 3 analiz edilerek, büyük olasılıkla elyaf kalınlığı glikozile elyaftan floresan daha düşük bir yoğunluğa sahip görünmektedir muhtemel neden glikasyonu bir sonucu olarak azalmış olmasıdır edilir.

Orak Hücre Hastalarda gelen eritrositlerde İçeren Fibrin pıhtısı Konfokal Mikroskopi Analizi

Orak hücre hastalarında normal olan pıhtı ve eritrosit fibrin pıhtı yapısının konfokal mikroskop görüntüleri Şekil 4'te sunulmaktadır. Tahmin edildiği gibi, orak hücreli hastaların eritrositlerde içeren fibrin pıhtıları konfokal görüntüleri sağlıklı fibrin c daha yoğun yapılar vardıçok. Şekil 4A fibrin ve normal eritrosit homojen bir dağılım gösterir. Bununla birlikte, Şekil 4B'de herhangi bir fibrin ağı oluşan fibrin ve boşlukların kümeleri vardır. Orak hücre hastadan alınan eritrositler homojen bir şekilde dağılana değil, ama daha çok, fibrin yığınlarda yerleştirilmiştir. Arttınlmış bir yoğunluk, (birim alan başına lif sayısı) OHA hastalarında kan pıhtılaşması bir sonucu olarak ortaya çıkan, artmış fibrinojen konsantrasyonu bir sonucudur. Ayrıca, agrega oluşturmak için orak hücre hastalardan eritrosit doğal eğilimi fibrin ağı içine dokunmuş oldu eritrosit kümeleri doğurmuş. Bu, normal hastalarda daha morfolojisinde belirgin bir şekilde farklı olan anormal pıhtı yapıların oluşmasına neden oldu. Şekil 4B, bu orak hücre hastaların eritrosit fibrin numunede daha heterojenite neden ve ayrıca fibrin numune, içinde eritrosit daha geniş bir mekansal dağılımını neden olduğu görülmektedir zaman comNormal RBCs sağlıklı fibrin pıhtıları ile karşılaştırıldığında. Bunun aksine normal eritrositlerde sağlıklı fibrin pıhtısı fibrin ağı boyunca hücrelerin daha homojen bir dağılım gösterdi.

Çok HbS (orak hemoglobin) orak hücre hastadan alınan eritrositlerin içinde polimerize edilir ve örnekler içerdiği kadar bilinmemektedir. Bilinen, ancak, HbS herhangi bir miktarda bulunması, normal HbA molekülleri genel olarak birim hacim başına HbS molekül sayısı hücrelerin daha büyük bir toplanmayı neden olmasıdır. Pan ve ark. 46 oksi-HbS ve oksi-hemoglobin normal erişkin, HBA, karşılaştırma için, onlar deoksi--HbS toplama / kümelenme etkileri karşılaştırıldı bir çalışmada bu olguyu gösterdi ve oylandı. Çözelti hazırlama ve onların boyutları ve sayılardan sonra bir kaç saniye içinde oluşan kümeler 3 saat kadar nispeten sabit kalmıştır. Çalışmanın sonuçlarından biri, hem oksi-HbS ve deoksi-HbS molekülleri daha yüksek bir sayı den kümelenmiş olduSıcaklığın bir fonksiyonu olarak oksi-HbA (normal) moleküllere göre dalına. Mevcut çalışmada Dair, bu orak hücre hastalardan eritrositler birlikte küme olasılığı vardı, ve fibrinojen öncüsü gelen polimerize ediliyordu olarak fibrin tuzağa anlamına gelir.

Normal ve Glike pıhtı Konfokal Mikroskopi Liziz Oranı Analizi

Bu fibrinoliz oranları plazmin konsantrasyonda azalma ile glike fibrin pıhtıları kıyasla normal fibrin pıhtıları için büyük olacağını varsayılmıştır. Bu hipotezi test etmek için, konfokal mikroskopi plazmin ilavesiyle fibrin pıhtısı parçalama oranlarını değerlendirmek için kullanıldı. Ortalama (ortalama) plazmin, 200 ug / ml 'sinin ilave normal fibrin parçalama oranları 43.2 ± 2 / saniye ve plazmin, 200 ug / ml' sinin ilave ile glikolize fibrin ortalama (ortalama) liziz oranları um 26.5 oldu 29.7 ± 11.2 mikron 2 / sn. Ile lize Glike fibrin pıhtısı içinPlazmin 50 ug / ml, ortalama parçalama oranının 12.8 ± 3.1 um 2 / se idi. 10 numune her bir (30 numune) toplam ortalama ve standart sapma değeri belirlemek için kullanıldı. Bu değerler, Şekil 5'te sunulmaktadır. 0.05'lik p değeri, deneysel gruplar arasında önemliliği belirlemek için kullanılmıştır. Fibrinoliz oranlarının analizi plazmin anlamlı farklılık azalmış normal pıhtıların değeri glike (simüle diyabetik) pıhtı ile karşılaştırıldığında olduğunu göstermiştir.

Şekil 1,
Gerçek zamanlı alma yöntemi ayrıntılı konfokal mikroskop yazılımı Şekil 1. Örnek ekran görüntüsü, fibrin pıhtı lizis sürekli görüntüleme. Thi daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızs rakam.

Şekil 2,
Fibrin pıhtı örnek erimesi oranını hesaplamak için kullanılan sabit alanı Şekil 2. Örnek konfokal görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Sağlıklı ve glikolize (diyabetik) fibrin pıhtılarının Konfokal görüntüler. Yeşil floresan fibrin ağı temsil eder. Glike fibrin diyabetik hastalarda oluşan pıhtıları temsil etmektedir unglycated fibrin, sağlıklı hastalarda oluşan pıhtıları temsil eder. (A), FXIIIa eklenmeden Unglycated fibrin. (B) FXIIIa ile Unglycated fibrin. (Cı (D) FXIIIa ile Glike fibrin olmadan strong>) Glike fibrin. Kırmızı ölçek çubuğu 50 mikron gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil orak hücreli hastaların eritrosit normal eritrosit ve fibrin pıhtısı ile sağlıklı fibrin pıhtıları 4. Konfokal görüntüleri. Yeşil floresan fibrin ağı temsil eder ve kırmızı orak hücre hastalarında sağlıklı ve eritrositler etiketli temsil etmektedir. (A), FXIIIa normal fibrin konsantrasyonu ve orak hücre hastadan FXIIIa ve eritrositler (B) Artan fibrin Sağlıklı eritrositler. Beyaz ölçek çubuğu 50 mikron gösterir. Görüntünün (B) beyaz daireler tanınabilir oraklaşmış eritrositlerde gösterir.

Şekil 5,
Şekil glikozile (diyabetik) fibrin pıhtı ve azaltılmış plazmin konsantrasyonu ile glike pıhtıları kıyasla normal fibrin pıhtıları 5. Fibrinolizis oranları. İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA ve post hoc Tukey-Kramer çoklu karşılaştırma testine göre belirlenmiştir. ANOVA analizi parçalama oranı ortalamaları arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermiştir. Tukey-Kramer testi ap <0.05 azalmıştır plazmin normal pıhtıları ve pıhtı arasında da anlamlı bir fark olduğunu göstermiştir. * Normal pıhtıları gelen önemli bir fark gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hastalık durumlarında, pıhtılaşma mekanizmalarının yapısı anlamlı veriler elde etmek için, bu koşullar altında, protein ve hücre etkilerini belirlemek için pıhtılaşma faktörleri izole etmek için önemlidir. Bu protokol in vitro diyabetik ve OHA devletler fibrin pıhtı yapısını araştıran amacıyla geliştirilmiştir.

Bu değiştirilmiş koşullar hiperkoagülasyon, Aterotrombozu ve KVH neden beri hastalık durumlarında fibrin oluşumu ve fibrinoliz yer alan mekanizmaları anlamak için gereklidir. Bu deneyde elde edilen odaklı görüntü bakıldığında, hiperkoagülasyon aktivitesi artmış fibrinojen neden diyabetik ve OHA devletler meydana olduğu açıktır. Ağ boyunca daha branş noktası ve daha küçük gözeneklere sahip bir yoğun fibrin ağı içinde bir artmış fibrinojen konsantrasyonu ortaya çıkarır. OHA hastalarının fibrin ağlarda, daha fazla fibrin mevcut, bu var sadecebu kümeler halinde fibrin hapseden aynı zamanda ağın yapısını değiştirir orak hücre hastalardan alınan eritrositlerin araya doğasını t. Orak hücre hastaların eritrosit yığını da ağda fibrin kümeleri gözenekliliğini azaltır, ancak genel ağda geçersiz konsantrasyonunu artırmak için görünür. Glike pıhtı fibrinoliz analizi sonuçları, sağlıklı, normal bir pıhtı daha düşük plazmin düşük olması Glike pıhtıları içinde erimesi oranı hipotezini desteklemektedir. Ancak sonuçlar plazmin normal konsantrasyonlarda glikolize pıhtıların parçalama oranları hakkında kesin kanıt vermedi. Böylece normal plazmin konsantrasyonu ile diyabetik hastalarda, verimli bir şekilde fibrin pıhtıları aşağılamak için yeterli fibrinoliz aktivitesi olabileceği sonucuna varılabilir.

Bu araştırmada yapılan deneyler için, izole edilmiş bir protein ve RBC yerine, tam kan ve plazma kullanılmıştır. Kullanılarakayrılan proteinler, fibrin pıhtıların sentezlemek için, hastalıklı pıhtı karşı normal arasında değiştirilmiş yapılar için nedenler belirlenebilir. Bu büyük ölçüde diğer plazma proteinleri, fibrin pıhtıları yapısı ve morfolojisi ile müdahale sahip olma olasılığı azalır. Bu, hücre ölümüne ve protein bozulmaya karşı daha hassas olan Ancak, izole edilmiş bir protein kullanılarak, bu depolama ve düzgün hücreleri ve proteinleri işlemek için çok önemlidir.

Bu çalışma için seçilen konfokal mikroskopi görüntüleme tekniği hücreleri ve proteinleri doğal trombotik özellikleri muhafaza ederken gelen fibrin pıhtısı yapılarının görüntü elde etme özelliği gibi kaynaklanmaktadır. Mikroskopisi da geliştirilmiş kontrast ve geleneksel ışık microcopy kıyasla azaltılmış gürültü ile numunenin optik çözünürlük vermek için gösterilmiştir. Lazer ışığı girmesini engelleyen odaklanmamış ışık deliğine yöneliktir. Konfokal mikroskopi kullanımı için zorunlu kıldısabitleyici kimyasal maddelerin eklenmesi; Böylece hücreler ve proteinler fibrin pıhtıları oluşturma doğal protein aktivitesini korumak için başardık. Sonuç olarak hücreler, proteinler, enzimler ve gerçek zamanlı faaliyet fotoğraf ve video çekimi için konfokal mikroskopi kullanımına izin kendi doğal halde görev. Konfokal mikroskobu ile fibrin pıhtıları 3D görüntüler yakalanan ve fibrin pıhtı plazmin sindirim videoları gerçek zamanlı olarak elde edilmiştir. Pıhtı erimesi sürecinin bir zaman serisi video yakalamak için pıhtılaşmasına plazmin eklerken, bu homojen fibrin matrisi ile enzim dağıtmak için plazmin yoluyla kılcal eylemini kullanmak için önemliydi. Bu ilave plazmin konsantrasyonu, doğru ve plazmin ilave edildi yerel alan aksine, tüm pıhtı lize enzimin izin sağlamak için yapıldı.

yöntem ve bu çalışmada elde edilen sonuçlar bu pıhtı erimesi bulundu Dunn ve ark tarafından yapılan bir çalışmada benzeroranları kontrol grubuna 25 daha diyabetik hastalarda anlamlı olarak düşüktü. Her iki çalışmada da, diyabetik (glikozile) pıhtı erimesi oranlarında önemli farklılıklar vardı; Ancak, mevcut protokol doğru çünkü azaltılmış plazmin seviyeleri diyabetik durumlarını temsil edebilir. Ayrıca, bu araştırma çalışması fibrinolizde farklı zaman aralıklarında ayrı ayrı bölümler analiz aksine, konfokal mikroskop kullanılarak gerçek zamanlı olarak sürekli yakalandı. Wooton ark. 47 fibrin pıhtı erimesi incelenmiş ve pıhtıların için lizis oranını araştırmak için bir parçalama ön hızı (cm / s) istihdam var. Onlar ön hız belirlemek için yaptıkları çalışmada konfokal görüntü analizi kullanıldı. Mevcut çalışmada, yerine parçalama ön hızının, bir parçalama alanı hızı (çünkü görüntü konfokal analiz edilmiştir yolu) kullanıldı. Daha da çalışmada geliştirilen yöntem doğrulamak için, 48 Yazarlar bir matematiksel model tarif var bunlar fibrinoliz etkin hız sabitinin bir fonksiyonu olarak parçalama ön hızı reçete olan plazmin tarafından fibrin pıhtı erimesi görülmüştür. denklem olarak verilir:
Denklem 2

İşte, Denklem 3 fibrinoliz etkin hız sabitini temsil eder, K tutma sabit Cı am plazmin konsantrasyonu ve ρ Fn fibrin yoğunluğu vardır. Ölçülen miktar ise Denklem 4 (Mevcut çalışmada konfokal analiz ölçülür) kullanılmaktadır ve zincir kuralı kullanılır, bu yol açar:
Denklem 5

Sadece bir boyut varsayarsak t "> zaman neden birim değişiyor:

Denklem 6

Denklem 7

Böylece deney için fibrinoliz efektif oran sabiti yol açar:
Denklem 8

Bu ilişki fibrinoliz o efektif oran sabiti (infers Denklem 9 ) Plazmin konsantrasyonu (Cı pm) ve alan parçalama oranının bir fonksiyonudur Denklem 10 .

Bu teknik aynı zamanda tromboz çalışmada önemlidirOHA hastalar, az bu hastalığa göre fibrin ve pıhtılaşma mekanizmaları hakkında orada bilindiğinden. Fibrin pıhtı yapısına SKD etkileri üzerine yapılan çok az çalışma olmuştur; Böylece bu çalışmada toplanan konfokal görüntüleri dahil oraklaşmış RBCs ile pıhtı yapısının nadir görselleştirme sağlar.

Gruplar arasındaki ortalamaların farklılıkları karşılaştırmak için, tek yönlü ANOVA ve post hoc Tukey-Kramer testi kullanın. Bir tek-yönlü ANOVA, bağımsız gruplar arasındaki ortalamaların istatistiksel olarak anlamlı bir fark belirlemek için kullanılan bir istatistiksel bir testtir. Tukey-Kramer son test her bir bağımsız grup araçlar karşılaştırmak ve grupların araçları birbirinden istatistiksel olarak farklı olduğunu belirlemek için kullanılır. Bir tek-yönlü ANOVA gerçekleştirmeden önce, sonuçları geçerli olmasını sağlamak için karşılanması gereken altı varsayımlar vardır. Altı varsayımlar şunlardır: sürekli bağımlı değişken (lizis oranı), bağımsız bir çeşitleme-bir olayı olay etkilemez meydana gelen bu tür her grup verileri gözlenmiştir, bağımsız bir, iki ya da daha fazla bağımsız kategorik gruplarından oluşan ble (glikozile normal ve indirgenmiş plazmin ile glikozile) ve (bu veri hiçbir üst üste binme yoktur temin eder.) , herhangi bir önemli aykırı içermeyen veri seti, normal Shapiro-Wilk testi istatistiksel tarafından doğrulanmadı verileri ve Levene istatistik testi tarafından doğrulandı verilerdeki varyansların homojenliği dağıttı. Bu varsayımlar karşılandı kez, bir tek-yönlü ANOVA ve post hoc Tukey-Kramer testi istatistiksel anlamlılık belirlemek için eşik olarak 0.05 p-değeri ile yapılmıştır. Tek yönlü ANOVA ve post-hoc Tukey-Kramer testi titiz ayrıntı için, 44,45 bakınız.

Genel olarak, bu yöntem doğal hallerine normal ve (nedeniyle hastalıklı devletlere) anormal fibrin pıhtılarının görüntüleme için izin verir. Yöntem ayrıca, hem de Pıhtının eriyip gerçek zamanlı görüntülenmesi için ayrıntıları vermektedirparçalama oranlarının istatistiksel analizi gibi. trombüs üretilen ve in vitro olarak görüntülenebilir kolaylık, hücre ve doku mühendisliği uygulamalarında geniş bir aralığı için yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).

Tags

Tıp Sayı 98 fibrin pıhtı hastalık konfokal mikroskopi diyabet glikasyon eritrosit orak hücreli
Normal ve Hastalıklı Devletleri&#39;nde Fibrin pıhtısı Yapıları incelenmesi için deneysel ve Görüntüleme Teknikleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. … More

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter