Protocol
1 embryoid शरीर (ईबी) संरचना
- माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) पर बनाए रखा गया है कि ESCs जिलेटिन अनुकूलन. पारित होने ESCs MEFs दूर करने के लिए 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर 3 बार.
- (1 टेबल) undifferentiated कोशिकाओं रखने के लिए LIF साथ ईएससी रखरखाव मीडिया में कोशिकाओं को विकसित. यकीन कोशिकाओं कभी नहीं 80% संगम को पार करें. भेदभाव के लिए कोशिकाओं (MEFs से हटाने के बाद 10 या उससे कम अंश) कम बीतने का प्रयोग करें.
- ESCs ईबी भेदभाव के लिए संवर्धित कर रहे हैं इससे पहले दिन में, पारित होने कोशिकाओं ताकि वे लगभग 50-70% मिला हुआ अगले दिन किया जाएगा. सेल pluripotency बनाए रखने के लिए ईएससी रखरखाव मध्यम में संवर्धन कोशिकाओं जारी रखें.
- 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति: भेदभाव, महाप्राण ईएससी रखरखाव मीडिया और के दिन 1 मिलीलीटर फास्फेट buffered खारा (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, और 11.9 मिमी फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 पीबीएस) से धो लें.
- 0.25% tryps के 200 μl जोड़ें/ प्रत्येक के लिए EDTA अच्छी तरह से और में 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- भेदभाव मीडिया के 800 μl के साथ / trypsin EDTA निष्क्रिय. Pipet और नीचे एक P200 टिप के साथ एक 2 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet में तोड़ अप करने के लिए कोशिकाओं को एक एकल कक्ष निलंबन में. मीडिया pipet और टिप इंटरफेस के बीच ऊपर नहीं जाती है तो P200 टिप छोर पर फिट बैठता है कि सुनिश्चित करें.
- Pipet और नीचे लगभग 5-10 बार. Pipetting दौरान बुलबुले बनाने के लिए नहीं ख्याल रखना.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. पीबीएस के साथ 10 मिलीलीटर मात्रा को ले आओ. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 315 XG पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें. LIF युक्त शेष मीडिया को दूर करने के लिए 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार धोएं. प्रत्येक धोने के लिए 1.4 कदम के रूप में अपकेंद्रित्र.
- भेदभाव मीडिया (तालिका 2) के 2 मिलीलीटर में अंतिम सेल गोली Resuspend.
- एक hemocytometer या सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना और एक 10 सेमी पेट्री थाली में 6,000-10,000 कोशिकाओं / एमएल थाली(गैर टिशू कल्चर इलाज).
- प्रत्येक ईएससी लाइन के लिए अनुभव से सटीक कोशिकाओं / एमएल का निर्धारण करते हैं. सामान्य रूप से जीवाणु काम या कम पालन प्लेटों के लिए प्रयोग किया जाता बाँझ पेट्री प्लेटों का प्रयोग करें.
नोट: सबसे अच्छा भेदभाव परिणामों के लिए, ईबीएस प्लेट को संलग्न बिना निलंबन में रहते हैं कि क्षेत्रों फार्म चाहिए. कम से कम पालन के साथ लोगों को खोजने के लिए प्लेटों के कई ब्रांडों का परीक्षण करें. - 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में फर्क ESCs सेते हैं.
- प्रत्येक ईएससी लाइन के लिए अनुभव से सटीक कोशिकाओं / एमएल का निर्धारण करते हैं. सामान्य रूप से जीवाणु काम या कम पालन प्लेटों के लिए प्रयोग किया जाता बाँझ पेट्री प्लेटों का प्रयोग करें.
| अभिकर्मक | शेयर | अंतिम एकाग्रता | वॉल्यूम | कंपनी | सूची संख्या |
| DMEM | 1x | 410 मिलीलीटर | एस igma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ते जांच) | 100% | 15% | 75 मिलीलीटर | Hyclone | SH30070.03E |
| गैर आवश्यक अमीनो एसिड | 100x | 1x | 5 मिलीलीटर | जीवन टेक्नोलॉजीज | 11140 |
| एल Glutamine | 100x | 1x | 5 मिलीलीटर | जीवन टेक्नोलॉजीज | 35,050 |
| Penncillin / स्ट्रेप्टोमाइसिन | 100x | 1x | 5 मिलीलीटर | जीवन टेक्नोलॉजीज | 15,070 |
| β-mercaptoethanol | 14.3 एम | 114 माइक्रोन | 4 μl | सिग्मा / Aldrich | M3148 |
| ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (LIF) | 10 7 इकाइयों / मिलीलीटर | 1,000 इकाइयों / मिलीलीटर | 50 μl | Millipore | ESG1107 |
| अभिकर्मक | शेयर | अंतिम एकाग्रता | वॉल्यूम | कंपनी | सूची संख्या |
| DMEM | 1x | 410 मिलीलीटर | सिग्मा / Aldrich | D5796 | |
| FBS (उपयोगकर्ता इष्टतम भेदभाव के लिए जांच) | 100% | 15% | 75 मिलीलीटर | Hyclone | SH30070.03E |
| गैर आवश्यक अमीनो एसिड | 100x | 1x | 5 मिलीलीटर | जीवन टेक्नोलॉजीज | 11140 |
| एल Glutamine | 100x | 1x | 5 मिलीलीटर | जीवन Technologies | 35,050 |
| Penncillin / स्ट्रेप्टोमाइसिन | 100x | 1x | 5 मिलीलीटर | जीवन टेक्नोलॉजीज | 15,070 |
| β-mercaptoethanol | 14.3 एम | 114 माइक्रोन | 4 μl | सिग्मा / Aldrich | M3148 |
तालिका 2: भेदभाव मीडिया.
वायरस के संक्रमण के लिए 2 तैयारी ईबी प्रकोष्ठों
- विकास के वांछित स्तर पर (दिन 2 और 3 दिन के बीच), 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 10 सेमी पेट्री डिश से ईबीएस हस्तांतरण. 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ थाली धो लें और शंक्वाकार ट्यूब धोने जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 315 XG पर ईबीएस गोली. 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ ईबी कोशिकाओं को धो लें.
- Thawed सेल टुकड़ी समाधान (युक्त प्रोटियोलिटिक और collagenolytic एंजाइमों) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ओसीसी के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब (या इनक्यूबेटर) जगह(flicking या प्रकाश vortexing से) asional आंदोलन.
- भेदभाव मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें. Pipet और नीचे एक P200 pipet टिप के साथ एक 2 मिलीलीटर pipet साथ. 30-60 मिनट के लिए फिर से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब रखें.
- 5 मिनट के लिए 315 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
3 वायरस के संक्रमण
- भेदभाव मीडिया की 1.5 एमएल में कोशिकाओं Resuspend. 6 अच्छी तरह से गैर टिशू कल्चर इलाज थाली सेल निलंबन स्थानांतरण.
- समय से आगे मानक तकनीक से रेट्रोवायरस तैयार करें. वायरल अनुमापांक के आधार पर कोशिकाओं को वायरल सतह पर तैरनेवाला के 5-100 μl जोड़ें. इस ईबीएस के बाद सुधार रोकता के रूप में संक्रमण को बढ़ाने के लिए polybrene न जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए 2120 XG पर centrifuging द्वारा वायरस के साथ कोशिकाओं Spinoculate.
4 हैंगिंग बूंदों में वायरल संक्रमित ईबी प्रकोष्ठों फर्क
- मैं के प्रत्येक अच्छी तरह से भेदभाव मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ेंnfected ईबी सेल निलंबन.
- Pipet multipipettors के लिए एक बाँझ अभिकर्मक जलाशय में संक्रमित ईबी सेल निलंबन की 3.5 मिलीलीटर. आठ से 20 μl के 15-20 पंक्तियों 15 सेमी पेट्री प्लेट के उल्टे ढक्कन पर बूँदें pipet को multipipettor का प्रयोग करें.
- पेट्री प्लेट के नीचे आधा बाँझ पीबीएस या पानी की 10 मिलीलीटर जोड़ें. फिर पेट्री थाली पर बूंदों और जगह के साथ ढक्कन पलटना. बूंदों चैम्बर humidified रखने के लिए उल्टा पीबीएस या नीचे पानी से ढक्कन से लटक रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
- 5.0% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में बर्तन रखें.
- 2 दिनों के बाद, भेदभाव मीडिया की 4.5 मिलीलीटर के साथ ढक्कन और धोने inverting द्वारा बूँदें फांसी में गठित ईबीएस इकट्ठा.
- एक नए 10 सेमी गैर टिशू कल्चर पेट्री थाली पर स्थानांतरण मीडिया और ईबीएस. भेदभाव मीडिया और 10 सेमी की थाली पर स्थानांतरण के 3 मिलीलीटर के साथ एक बार फिर ढक्कन धो लें.
- Cytometry 8 की कुल बाद प्रवाह द्वारा विश्लेषण के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओंभेदभाव मीडिया (-LIF) के लिए कोशिकाओं की प्रारंभिक हस्तांतरण से शुरू दिनों संस्कृति.
फ्लो cytometer विश्लेषण के लिए 5 तैयारी प्रकोष्ठों
- एक 10 मिलीलीटर pipet के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ थाली धो लें और एक ही शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण.
- 315 x जी पर गोली कोशिकाओं. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ छर्रों धो लें.
- Thawed सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सामयिक आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों की जगह. कुछ सेल सतह एंटीजन का पता लगाने के लिए, trypsin बजाय प्रयोग किया जा सकता है.
- 1 मिलीलीटर भेदभाव मीडिया जोड़ें और ऊपर pipet और एक 2 मिलीलीटर pipet के साथ नीचे. मदद करने के लिए pipet के अंत तक एक P200 टिप का उपयोग तोड़ अप एकल कक्ष निलंबन में ईबी पच.
- अभिन्न झिल्ली प्रोटीन कोशिका की सतह को रीसायकल करने के लिए आदेश में 60 मिनट के लिए फिर से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब रखें.
- 5 मिनट के लिए 315 XG पर गोली कोशिकाओं.
- कोशिकाओं वाई धोएंवें 0.1% गोजातीय सीरम albumin अंश पीबीएस (पीबीएस / बीएसए) में तैयार वी (बीएसए) और विशिष्ट के साथ कोशिकाओं को सेते fluorescently एंटीबॉडी चिह्नित.
Hematopoietic progenitors के लिए 6 फ्लो विश्लेषण
- एक 5 मिलीलीटर 12 एक्स 75 दौर मिमी नीचे ट्यूब में 10 6 ईबी ली गई कोशिकाओं रखें. मुआवजा सेटिंग्स प्रवाह को एडजस्ट करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार मुआवजा मोती का उपयोग करें.
- 315 x जी पर गोली कोशिकाओं. ट्यूब में अवशिष्ट पीबीएस / BSA समाधान में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली डालो.
- ईएससी HPCs पता लगाने के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं सेते: विरोधी माउस CD41 पीई (आर Phycoerytherin) और विरोधी माउस CD117 (cKit) -APC / CY7 (Allophycocyanin जाती 7).
- एंटीबॉडी 1 पतला: पीबीएस / BSA में 100. प्रत्येक नमूने के लिए पतला एंटीबॉडी के 100 μl जोड़ें. प्रत्येक विक्रेता, क्लोन, और बहुत या एंटीबॉडी के लिए एंटीबॉडी का सही कमजोर पड़ने का निर्धारण करते हैं. व्यक्तिगत रूप से कोशिकाओं लेबलिंग के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करते हैं.
- 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर नमूने सेते हैं.
- 5 मिनट के लिए 315 XG पर 2 मिलीलीटर पीबीएस / बीएसए और गोली कोशिकाओं जोड़ें.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 300 पीबीएस के μl या किसी अन्य isotonic बफर में resuspend गोली.
- एक सेल झरनी टोपी (0.35 माइक्रोन) के माध्यम से फिल्टर resuspended कोशिकाओं बड़े सेल समुच्चय को दूर करने के लिए.
- एक प्रवाह कोशिकामापी पर कोशिकाओं का विश्लेषण.
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Representative Results
RW4 gelatinized इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया ESCs (129X1 / SVJ माउस तनाव से प्राप्त). ईबीएस भेदभाव के 3 दिन में अलग थे. सर्वोत्तम परिणामों के लिए ईबीएस गोलाकार और गैर पक्षपाती (चित्रा 1 ए, बी) होना चाहिए. वायरस ब्याज की एक जीन के साथ फ्लोरोसेंट मार्कर GFP सह व्यक्त साथ spinoculation के बाद, ईबीएस फांसी ड्रॉप विधि द्वारा सुधार किया गया. ईबीएस सफलतापूर्वक 2.0, 2.5, और 3.0 दिन ईबीएस से तैयार सेल निलंबन से सुधार किया गया. हालांकि, ईबीएस दिन 4.0 ईबीएस से तैयार सेल निलंबन से सुधार नहीं किया जा सका. संक्रमित और गैर संक्रमित कोशिकाओं के बीच ईबीएस की काइमेरावाद भेदभाव की सुबह 8 (चित्रा 2A, बी) में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया. ईबीएस के घनत्व अक्सर ईबीएस 100% GFP सकारात्मक होना प्रकट करता है. हालांकि, विभिन्न फोकल विमानों पर ध्यान केंद्रित ईबीएस (चित्रा 2 बी) के लिए GFP सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं का योगदान प्रकट कर सकते हैं.
एफओएचपीसी विकास के अनुसंधान विश्लेषण, काइमेरिक ईबीएस भेदभाव के 8 दिन बाद एकल कक्ष निलंबन में अलग थे. Mirn23a क्लस्टर की miRNA (एस) की गतिविधि नाराज (MIRS-23A, 24-2, और -27) ESCs की असमर्थता में परिणाम (तैयारी में पांडुलिपि) खून progenitors में अंतर करने के लिए. Mirn23a क्लस्टर की overexpression विपरीत प्रभाव पड़ता है, तो यह निर्धारित करने के लिए, ESCs भेदभाव की शुरुआत में संक्रमित थे. हालांकि, इस HPCs कमी आई की पीढ़ी में यह परिणाम है. Mirn23a क्लस्टर 18-21 संकेत TGFß / बीएमपी / Smad में शामिल किया जा सकता है के बाद से BMP4 सक्रिय Smad1 प्रोटीन 12,13 के समान ईबी विकास के विभिन्न चरणों में व्यक्त करते हैं, तो क्लस्टर अलग प्रभाव पड़ सकता है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, ईबी एकल कक्ष निलंबन भेदभाव के 3 दिन के बाद संक्रमित थे. ईबीएस CD41 और CD117 कोशिका की सतह expressio परख करने की क्रिया द्वारा ड्रॉप फांसी से सुधार किया, और बाद में एचपीसी पीढ़ी के लिए सुबह 8 बजे विश्लेषण किया गयाफ्लो द्वारा एन. CD41 + CD117 + कोशिकाओं ही निश्चित HPCs 22,23 होते हैं जबकि CD41 + एक सकारात्मक कोशिकाओं, आदिम और निश्चित HPCs की एक पूल हैं. हम MSCV नियंत्रण वायरस संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 3) की तुलना में MSCV-mirn23a संक्रमित कोशिकाओं में CD41 + HPCs की कुल आबादी में उल्लेखनीय वृद्धि मनाया. आंकड़ा भी सुधार ईबीएस को संक्रमित कोशिकाओं के एक उच्च योगदान प्राप्त किया जा सकता है कि यह दर्शाता है. यह एक नियंत्रण वायरस दोनों अकेले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त, साथ ही प्रयोगात्मक वायरस के साथ कोशिकाओं को संक्रमित साथ ईबीएस संक्रमित करने के लिए महत्वपूर्ण है. संक्रमित आबादी (GFP +) तो phenotype में मतभेद के लिए तुलना की जानी चाहिए. संक्रमित कोशिकाओं बनाम असंक्रमित कोशिकाओं के बीच जांच मतभेद गलत परिणाम दे सकता है. (असंक्रमित) GFP-, और GFP + (संक्रमित) मुकाबले MSCV और MSCV-mirn23a संस्कृतियों (चित्रा 3) दोनों में CD41 आबादी में एक अंतर है आबादी. यह वृद्धि की वजह से हो सकता हैरेट्रोवायरस को proliferative कोशिकाओं को संक्रमित.
चित्रा 1: प्रतिनिधि दिवस 3 embryoid निकायों RW4 ESCs भेदभाव मीडिया में ईएससी रखरखाव मीडिया से बंद है और 10 सेमी प्लेटों में सुसंस्कृत थे (ए) 4X और (बी) 10X छवियों संस्कृति के 3 दिन के बाद विकसित की कि embryoid निकायों के दिखाए जाते हैं... 10X छवि में बार 400 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि 4X छवि में बार, 1000 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2: रेट्रोवायरल संक्रमित दिन 3 ईबी कोशिकाओं से सुधार आठ दिन embryoid निकायों (ईबी). (ए) बाएं हाथ की ओर छवियों उज्ज्वल क्षेत्र हैं. (बी) सही करने के लिए फ्लोरोसेंट छवियों के तीन फ्लोरोसेंट कॉलम अलग में लिया वही ईबी हैंफोकल विमानों अलग. 10X छवियों में बार 400 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि 4X छवियों में बार, 1000 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3:. काइमेरिक ईबीएस में उत्पादित hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण एकल कक्षों निलंबन संकेत रेट्रोवायरस साथ ईबीएस डी 3 से तैयार है, और संक्रमित थे. ईबीएस बूंद फांसी से सुधार, और एक अतिरिक्त 8 दिन सुसंस्कृत थे. एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न और CD41, और CD117 के लिए fluorescently लेबल एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे. वाम हाथ हिस्टोग्राम भूखंडों GFP- (गैर संक्रमित कोशिकाओं) और GFP + (संक्रमित कोशिकाओं) फाटकों दिखा. दाहिने हाथ पैनल CD41 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का रंग डॉट साजिश, और CD117 अभिव्यक्ति GFP- में और GFP + द्वार दिखा. आदिम hematopoietic progenitors CD41 + भागों में पाए जाते हैं, और निश्चित progenitors CD41 + सीडी दोनों में मौजूद हैं117-, और CD41 + CD117 + अंशों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
ऊपर चर्चा की, inducibly ब्याज की एक जीन व्यक्त कि ईएससी क्लोन डॉक्सीसाइक्लिन सिस्टम का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, हालांकि, इन लाइनों की पीढ़ी समय लेने वाली और श्रम प्रधान है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित ईबीएस व्युत्पन्न ईएससी से तैयार एकल कक्ष निलंबन में ब्याज की एक जीन व्यक्त करने के लिए एक विधि है. इन संक्रमित कोशिकाओं को फिर बाद में भेदभाव की जांच करने के लिए ड्रॉप फांसी से ईबीएस में सुधार कर रहे हैं. उदाहरण (चित्रा 3) में, यह भेदभाव के दिन 3 में व्यक्त जब mirn23a क्लस्टर की कि अभिव्यक्ति hematopoietic विकास को बढ़ाता है दिखाया गया है. इस बिंदु पर नवजात रोगाणु परत ऊतक के विकास के खून progenitors को जन्म देता है कि जल्दी mesoderm सहित आ गई है. RW4 ईएससी भेदभाव, (Pax6), अन्तर्जनस्तर (FoxA2), और mesoderm (टी, ट्विस्ट, और Tbx6) (क्यू आरटी पीसीआर, डाटा नहीं मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर से पता चला रहे हैं बाह्य त्वक स्तर का प्रतिनिधित्व जीनों की अभिव्यक्ति का दिन 2 और 3 पर दिखाया गया है). मील के लिएrn23a एचपीसी उत्पादन बढ़ाने के लिए, यह जल्दी mesoderm में व्यक्त करने की आवश्यकता हो सकती है. इस तकनीक को एक transgene उपन्यास अभिकर्मकों उत्पन्न करने के प्रयास के एक बहुत खपा बिना अपनी लौकिक अभिव्यक्ति पर अलग अलग प्रभाव पड़ता है, तो यह निर्धारित करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है. अलग लौकिक अभिव्यक्ति के साथ जुड़े phenotypes देखने पर एक अन्वेषक अब transgene की अभिव्यक्ति कसकर नियंत्रित किया जा सकता है, जहां inducible लाइनों उत्पन्न करने के प्रयास खर्च कर सकते हैं.
ब्याज की एक जीन की दोनों alleles (डबल नॉकआउट ESCs, DKOs) हटा दिया गया है, जहां इस तकनीक के लिए अन्य अनुप्रयोगों ESCs में बचाव प्रयोगों प्रदर्शन शामिल है. wildtype जीन या नष्ट जीन की उत्परिवर्तित संस्करणों फर्क ईबी कोशिकाओं में पुनः शुरू किया जा सकता है. हटाए गए जीन के बहाव के जीन से एक phenotype के साथ ही बचाव assayed किया जा सकता है. इस विधि मनाया phenotypes की सेल स्वभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Hematopo में उदाहरण के लिएiesis, दोष स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं 16,24 के विकास का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं कि microenvironment में कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं स्वयं या कभी कभी दोष या तो प्रभावित करने वाले जीनों में मनाया गया है. दोष hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं के लिए स्वाभाविक है अगर इस प्रणाली में, तो wildtype जीन के reintroduction केवल GFP + (रेट्रोवायरल संक्रमित) कोशिकाओं में hematopoietic विकास बचाएगा. दोष गैर सेल स्वायत्त थे, तो रेट्रोवायरल संक्रमण + GFP और GFP- आबादी दोनों में मनाया जा रहा है hematopoietic विकास के बचाव में नतीजा होगा.
इस प्रोटोकॉल फ्लो में CD41 और CD117 की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति द्वारा hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. भेदभाव के 8 दिन GFP संक्रमित होने के बाद वैकल्पिक रूप से, + कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा अलग किया जा सकता है. अलग कक्षों तो सपा की उपस्थिति के लिए assayed किया जा सकता हैmethylcellulose मीडिया में hematopoietic कॉलोनी assays के द्वारा ecific hematopoietic progenitors हम पहले 25,26 वर्णित किया है. इसी तरह, आरएनए क्रमबद्ध कोशिकाओं से निकाले और वंश विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.
वर्णित तकनीक का लाभ यह आवश्यक अभिकर्मकों उत्पन्न करने के लिए कम से कम प्रयास की आवश्यकता है, और विकासशील ईबी में एक transgene की लौकिक अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है. एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ ब्याज की जीन सह व्यक्त एक वायरल वेक्टर पहले से ही उपलब्ध है, तो प्रयोग तुरंत किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए चुनने के साथ विचार किया जा करने के लिए कुछ सीमाएं हैं. यहाँ उल्लिखित तकनीक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या है उच्च अनुमापांक रेट्रोवायरस उत्पादन करने की क्षमता की आवश्यकता होती है. इसके अलावा रेट्रोवायरस का उपयोग करें कि एक phenotype उपज सकता है कि insertional mutagenesis में परिणाम कर सकते हैं. हालांकि इस प्रोटोकॉल एक के बजाय संक्रमित कोशिकाओं का एक पूल की जांच कर रहा है के बाद सेप्रतिरूप जनसंख्या, यह insertional mutagenesis के कारण एक phenotype संस्कृति से कम समय के साथ मनाया जाएगा कि कम होने की संभावना है. (जैसे TET प्रणाली के रूप में एक inducible प्रणाली की तुलना में) तकनीक की प्रमुख सीमा एक बाद में समय बिंदु पर खामोश नहीं किया जा सकता transgene की कि अभिव्यक्ति है, और अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने की क्षमता है. यह न केवल एक लौकिक ढंग से जीन पर बदल के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक बाद timepoint पर जीन को बंद करने के लिए अनुमति देता है के बाद से डॉक्सीसाइक्लिन विनियमन के नियंत्रण के अधीन एक transgene लाभप्रद है कि एक्सप्रेस ESCs. ऐसे डॉक्सीसाइक्लिन के रूप में एक inducer की राशि बदलती भी ठीक धुन अभिव्यक्ति के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देगा. इस रेट्रोवायरल प्रोटोकॉल में transgene की काइमेरिक अभिव्यक्ति है जबकि अन्त में inducible प्रणाली, सभी कोशिकाओं में transgene की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि जैसा कि ऊपर चर्चा इस काइमेरिक अभिव्यक्ति कुछ अनुप्रयोगों के लिए मूल्यवान हो सकता है. inducible प्रणाली स्पष्ट रूप से एक की पेशकशलाभ में से बहुत कुछ. हालांकि, आसानी के कारण और यहाँ वर्णित तकनीक की कीमत में कमी आई है, कई जांचकर्ताओं भ्रूण स्टेम सेल भेदभाव के अपने अध्ययन के लिए यह उपयोगी पाएंगे.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
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