Protocol
1. embryoid Body (EB) Dannelse
- Gelatin-tilpasse ESCs som har blitt vedlikeholdt på mus embryo fibroblaster (MEFs). Passage ESCs tre ganger på seks godt vevkulturplate belagt med 0,1% gelatin for å fjerne MEFs.
- Dyrk celler i ESC opprettholdelsemedia med LIF til å holde cellene udifferensiert (tabell 1). Sørg for at cellene ikke overstige 80% samløpet. Bruk lav passasje (10 eller færre passeringer etter fjerning fra MEFs) celler for differensiering.
- På dagen før ESCs dyrkes for EB differensiering, passasje cellene slik at de vil være omtrent 50-70% konfluent neste dag. Fortsett dyrking celler i ESC vedlikehold medium å beholde celle pluripotency.
- På dagen for differensiering, aspireres ESC vedlikeholds medier og vask med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, og 11,9 mM fosfatbuffer, pH 7,4) per brønn i en 6-brønns plate.
- Tilsett 200 pl av 0,25% Trypsi / EDTA til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.
- Inaktivere trypsin / EDTA med 800 mL av differensiering media. Pipetter opp og ned i et 2 ml serologisk pipette med et P200 spiss for å bryte opp cellene til en enkelt cellesuspensjon. Kontroller at P200 spissen passer perfekt på slutten så media ikke går opp mellom pipette og tips grensesnitt.
- Pipet opp og ned ca 5-10 ganger. Pass på å ikke lage bobler under pipettering.
- Overfør cellene til en 15 ml konisk rør. Bring volumet opp til 10 ml med PBS. Sentrifuger ved 315 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten. Vask to ganger med 5 ml PBS for å fjerne resterende medier som inneholder LIF. Sentrifuger som i trinn 1.4 for hver vask.
- Resuspender den endelige cellepelleten i 2 ml differensieringsmedium (tabell 2).
- Telle celler med en hemocytometer eller celleteller og plate 6,000-10,000 celler / ml i en 10 cm Petri plate(Ikke-vevskultur behandlede).
- Fastslå den eksakte celler / ml empirisk for hver ESC linje. Bruk sterile petriplater som normalt anvendes for bakteriell arbeid eller dårlig feste platene.
MERK: Du får best differensiering resultat, bør EBS danne kuler som forblir i suspensjon uten feste til platen. Teste flere merker av plater for å finne de med minst etterlevelse. - Inkuber differensierende ESCs i en 37 ° C vev kultur inkubator med 5% CO 2.
- Fastslå den eksakte celler / ml empirisk for hver ESC linje. Bruk sterile petriplater som normalt anvendes for bakteriell arbeid eller dårlig feste platene.
| Reagens | Lager | Endelig konsentrasjon | Volume | Selskapet | Katalognummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | S igma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES Skjermet) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Ikke-essensielle aminosyrer | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoethanol | 14.3 M | 114 mikrometer | 4 mL | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Leukemi Inhibitory Factor (LIF) | 10 7 enheter / ml | 1000 enheter / ml | 50 mL | Millipore | ESG1107 |
| Reagens | Lager | Endelig konsentrasjon | Volume | Selskapet | Katalognummer |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (Bruker Skjermet for optimal differensiering) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Ikke-essensielle aminosyrer | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Livet TechnoloGies | 35050 |
| Penncillin / streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoethanol | 14.3 M | 114 mikrometer | 4 mL | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabell 2: Differensiering Media.
2. Å EB Cells for virus infeksjon
- På den ønskede utviklingstrinn (mellom dag 2 og dag 3), overføre EBS fra 10 cm petriskål til 15 ml konisk tube. Vask plate med 5 ml PBS og tilsett vaske til den koniske tube.
- Pellet EBS ved 315 xg ved romtemperatur i 5 min. Vask de EB-celler med 5 ml PBS.
- Tilsett 1 ml tint celle avløsning løsning (som inneholder proteolytiske og collagenolytic enzymer) og plassere rørene i en 37 ° C vannbad (eller inkubator) for 30 min med OCCasional agitasjon (fra flikking eller lys virvling).
- Tilsett 1 ml av differensieringsmediet. Pipetter opp og ned med en 2 ml pipette med et P200 pipettespiss. Plasser røret på 37 ° C vannbad på nytt i 30-60 min.
- Spinn ned cellene ved 315 xg i 5 minutter og vaskes cellene med PBS.
3. Virus Infeksjon
- Resuspender cellene i 1,5 ml av differensieringsmediet. Overfør cellesuspensjonen til en 6-brønn vevskultur ikke-behandlet plate.
- Forbered retrovirus av standard teknikker på forhånd. Legg 5 til 100 pl av virale supernatanten til cellene avhengig av viral titer. Ikke legg polybrene å forbedre infeksjon som dette hemmer den påfølgende reformasjon av EBS.
- Spinoculate cellene med virus ved sentrifugering ved 2120 xg i 90 min ved romtemperatur.
4. Skille Viral Infiserte EB Cells i hengende Drops
- Tilsett 2 ml differensiering media til hver brønn av Infected EB cellesuspensjon.
- Pipetter 3,5 ml av infiserte EB cellesuspensjonen i et sterilt reagens reservoar for multipipettors. Bruk multipipettor å pipettér 15-20 rader med åtte 20 pl dråper på den omvendte lokket på 15 cm Petri plate.
- Tilsett 10 ml steril PBS eller vann til den nedre halvdel av Petri-plate. Deretter snu lokket med dråpene, og plasser den Petri plate. Sørg for at dråpene henger opp ned fra lokket med PBS eller vann under for å holde kammeret fuktet.
- Plasser rettene i 37 ° C vev kultur inkubator med 5,0% CO 2.
- Etter 2 dager, samle EBS dannet i hengende dråper ved å invertere lokket og vasking med 4,5 ml av differensieringsmediet.
- Overfør media og EBS til en ny 10 cm non-vev kultur Petri plate. Vask lokket en gang med 3 ml av differensierings media og overføring til 10 cm plate.
- Slakte celler for analyse ved strømningscytometri etter totalt åttedager kultur som starter fra den første overføring av cellene til differensieringsmedium (-LIF).
5. Klar Cells for Flowcytometer Analyse
- Overfør cellene til en 15 ml konisk rør med en 10 ml pipette. Vask plate med 5 ml PBS og overføres til den samme koniske tube.
- Pellet cellene ved 315 x g. Vask pellets med 10 ml PBS.
- Tilsett 1 ml tint celle løsgjøring løsning og plassere rørene i et 37 ° C vannbad i 30 minutter med sporadisk omrøring. For påvisning av noen celleoverflateantigener, trypsin kan brukes i stedet.
- Tilsett 1 ml differensierings medier og pipetter opp og ned med en 2 ml pipette. Bruk en P200 spissen til enden av pipetten for å bidra til å bryte opp fordøyd EB i enkeltcellesuspensjon.
- Plasser røret på et 37 ° C vannbad igjen i 60 min for at de integrerte membranproteiner til å resirkulere til celleoverflaten.
- Pellet cellene ved 315 xg i 5 min.
- Vask cellene with 0,1% bovint serumalbumin fraksjon V (BSA) fremstilt i PBS (PBS / BSA) og inkuberes cellene med spesifikke fluorescerende merket antistoff.
6. flowcytometrisystemer Analyse for Hematopoietiske stamfedre
- Plasser 10 6 EB avledede celler i en 5 ml 12 x 75 mm rundbunnet rør. For justering flowcytometer kompensasjonsinnstillinger, bruker kompensasjon perler i henhold til produsentens instruksjoner.
- Pellet cellene ved 315 x g. Hell av supernatanten og resuspender pelleten i rest PBS / BSA løsning i røret.
- For å avdekke ESC HPCS, ruge cellene med fluorescerende merket antistoffer: anti-mus CD41-PE (R-Phycoerytherin) og anti-mus CD117 (cKit) -APC / Cy7 (Allophycocyanin cyanine 7).
- Fortynn antistoffer 1: 100 i PBS / BSA. Tilsett 100 pl av fortynnet antistoff til hver prøve. Bestemme riktig fortynning av antistoff for hver leverandør, klone, og mye eller antistoff. Bestem optimal utvanning for merking av celler individuelt.
- Inkuber prøvene på is i mørket i 30 min.
- Tilsett 2 ml PBS / BSA, og pellet cellene ved 315 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 300 mL PBS eller annen isotonisk buffer.
- Filtrer resuspenderes cellene gjennom en celle sil lokket (0,35 uM) for å fjerne store celleaggregater.
- Analyser cellene med et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I disse studiene gelatin RW4 (avledet fra 129X1 / SVJ mus belastningen) ESCs ble brukt. EBS ble isolert på tre dager med differensiering. For best resultat EBS bør være sfærisk og ikke-tilhenger (figur 1A, B). Etter spinoculation med virus co-uttrykke den fluoriserende fargestoff GFP sammen med et gen av interesse, ble EBS reformert ved hengende slipp-metoden. EBS ble vellykket reformert fra cellesuspensjoner utarbeidet fra 2,0, 2,5, og 3,0 dag EBS. Men EBS kunne ikke reformeres fra cellesuspensjoner forberedt fra dag 4,0 EBS. Den kimerisme av EBS mellom infiserte og ikke-infiserte celler ble observert ved fluorescensmikroskopi ved dag 8 av differensiering (figur 2A, B). Tettheten av EBS ofte gjør EBS ser ut til å være 100% GFP positive. Men, med fokus på ulike fokus flyene kan avsløre bidrag av GFP positive og negative celler til EBS (figur 2B).
For analyse av HPC-utvikling, ble kimære EBS dissosiert til enkeltcellesuspensjoner etter 8 dager med differensiering. Antagonisere aktiviteten av miRNA (e) av mirn23a klyngen (Mirs-23a, 24-2, og -27) resulterer i en manglende evne til å differensiere i ESCs blod progenitorer (manuskript under forberedelse). For å avgjøre om overekspresjon av mirn23a klyngen har motsatt effekt, ble ESCs smittet ved utbruddet av differensiering. Men dette resulterer i generering av redusert HPCS. Siden mirn23a klyngen kan være involvert i TGFß / BMP / Smad signale 18-21, kan klyngen har forskjellige effekter når det uttrykkes på ulike stadier av EB utvikling ligner på BMP4 aktivert Smad1 protein 12,13. Ved hjelp av denne protokollen, ble EB enkeltcellesuspensjoner smittet etter 3 dager med differensiering. EBS ble reformert ved å henge slipp, og senere analysert ved dag 8 for HPC generasjon ved å analysere CD41 og CD117 celleoverflaten expression av flowcytometri. CD41 + enkelt positive celler er en pool av primitive og definitive HPCS, mens CD41 + CD117 + celler inneholder bare definitive HPCS 22,23. Vi observerte en betydelig økning i den totale befolkningen i CD41 + HPCS i MSCV-mirn23a infiserte celler sammenlignet med MSCV kontroll virusinfiserte celler (figur 3). Figuren viser også at et høyt bidrag av infiserte celler til de reformerte EBS kan oppnås. Det er viktig å infisere EBS med både en kontroll-virus som uttrykker det fluorescerende protein alene, så vel som å infisere celler med den eksperimentelle virus. Infiserte populasjoner (GFP +) sammenholdes deretter for forskjeller i fenotype. Undersøke forskjeller mellom ikke-infiserte celler versus infiserte celler kan gi feil resultater. Sammenligning GFP- (infisert), og GFP + (smittet) populasjoner det er en forskjell i CD41 bestander i både MSCV og MSCV-mirn23a kulturer (figur 3). Denne økningen kan skyldestil retrovirus infiserer proliferative celler.
Figur 1: Representant Dag 3 embryoid Bodies RW4 ESCs ble byttet fra ESC vedlikehold medier i differensiering media og dyrket i 10 cm plater (A) 4X og (B) 10X bilder blir vist av embryoid organer som utviklet etter 3 dager med kultur... I 4X bilde søylen representerer 1,000 mikrometer, mens det i 10X bilde søylen representerer 400 mikrometer.
Figur 2: Åtte dagers embryoid Bodies (EB) reformert fra retrovirale infiserte dag tre EB celler. (A) venstre side bildene er lyse feltet. (B) De tre fluorescerende kolonner med fluorescerende bildene til høyre er de samme EB tatt i diflige fokale plan. I 4X bildene baren representerer 1000 mikrometer, mens i 10x bildene baren representerer 400 mikrometer.
Figur 3:. Flowcytometri analyse av blodkreft stamceller produsert i kimære EBS enkeltceller suspensjoner ble forberedt fra d3 EBS, og infisert med de indikerte retrovirus. EBS ble reformert ved å henge slipp, og dyrket en ekstra 8 dager. Enkeltcellesuspensjoner ble generert og inkubert med fluorescensmerkede antistoffer mot CD41 og CD117. Left Hand histogram tomter viser GFP- (ikke-infiserte celler) og GFP + (infiserte celler) porter. Den høyre panelene viser farge prikkplott av celler positive for CD41, og CD117 uttrykk i GFP- og GFP + porter. Primitive blodkreft stamceller finnes i CD41 + fraksjoner, og definitive stamfedre er til stede både i CD41 + CD117-, og CD41 + CD117 + fraksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som omtalt ovenfor, kan ESC kloner som uttrykker indusere et gen av interesse bli generert ved hjelp av doxycycline-systemer, er imidlertid generering av disse linjene tidkrevende og arbeidskrevende. Beskrevet i denne protokollen er en metode for å uttrykke et gen av interesse for enkelt celle suspensjon fremstilt fra ESC avledet EBS. Disse infiserte celler blir deretter reformert i EBS ved henging slipp for å undersøke påfølgende differensiering. I eksempelet (figur 3), er det vist at ekspresjon av mirn23a klyngen forbedrer hematopoetisk utvikling når den uttrykkes på dag 3 av differensiering. På dette punktet utviklingen av begynnende bakterie lag vev har oppstått inkludert tidlig mesoderm som gir opphav til blodstamfedre. På dag 2 og 3 av RW4 ESC differensiering, uttrykket av gener som representerer ektoderm (Pax6), endoderm (FoxA2), og mesoderm (T, Twist, og Tbx6) blir oppdaget av kvantitativ revers transkriptase PCR (Q-RT-PCR, Data ikke vist). For mirn23a å forbedre HPC produksjon, kan det være behov for å komme til uttrykk i tidlig mesoderm. Denne teknikken gjør det mulig for evnen til å avgjøre om et transgen har ulike effekter på sin timelige uttrykk uten å bruke mye krefter for å generere nye reagenser. Ved å observere fenotypene assosiert med distinkt temporal ekspresjon, kan en undersøker vil nå bruke krefter for å generere induserbare linjer hvor ekspresjonen av transgenet kan være strengt kontrollert.
Andre bruksområder for denne teknikken inkluderer utfører redningsforsøk i ESCs hvor begge alleler av et gen av interesse har blitt slettet (Double Knockout ESCs, DKOs). Den villtype-genet, eller muterte versjoner av den slettede genet kunne gjeninnføres inn i de differensierende celler EB. I tillegg redning av en fenotype av gener nedstrøms for genet slettet kan analyseres. Denne metoden kan bli brukt for å undersøke celle iboende natur av de observerte fenotyper. For eksempel i hematopoiesis, har defekter blitt observert i gener som påvirker enten blodkreft stilk og stamceller selv eller noen ganger mangelen kan påvirke celler i mikromiljøet som er nødvendig for å støtte utviklingen av stamceller og stamceller 16,24. I dette systemet, dersom mangelen er iboende til blodkreft stamceller, deretter gjeninnføring av villtype genet vil bare redde blodkreft utvikling i GFP + (retrovirale infiserte celler). Hvis feilen var ikke-celle autonome, da retroviral infeksjon ville resultere i en redning av blodkreft utvikling blir observert i både GFP + og GFP- populasjoner.
I denne protokoll flowcytometri brukes til å identifisere hematopoetiske progenitorceller ved celleoverflaten ekspresjon av CD41 og CD117. Alternativt, etter 8 dager med differensiering infisert GFP + celler kan bli isolert ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). De isolerte celler kan deretter bli analysert for tilstedeværelse av specific blodkreft stamceller av blodkreft koloniforsøk i methylcellulose media som vi har beskrevet tidligere 25,26. På samme måte kan RNA ekstraheres fra sortert celler og analysert for uttrykk av avstamning spesifikke gener.
Fordelen med den beskrevne teknikk er at den krever minimal innsats for å generere de nødvendige reagenser, og gir mulighet for temporal ekspresjon av et transgen i utviklings EB. Hvis en viral vektor ko-uttrykke genet av interesse med et fluorescent protein er allerede tilgjengelig eksperimentet kan utføres umiddelbart. Det er noen begrensninger for å bli vurdert med å velge å bruke denne protokollen. Teknikken beskrevet her krever evnen til å produsere høy-titer retrovirus for å ha et tilstrekkelig antall celler for analyse. Legg også merke til at bruken av retrovirus kan resultere i insertional mutagenese som kunne gi en fenotype. Men siden denne protokollen undersøker en pool av infiserte celler i stedet for enklonal populasjon, er det mindre sannsynlig at en fenotype grunn insertional mutagenese blir observert i løpet av den korte tid i kultur. Den viktigste begrensning av teknikken (sammenlignet med en induserbar system som på tet-systemet), er at ekspresjon av transgenet kan ikke slås av på et senere tidspunkt, og det er ingen mulighet til å kontrollere nivåene av ekspresjon. ESCs som uttrykker et transgenet under kontroll av doksycyklin regulering er fordelaktig siden det gjør det mulig, ikke bare for å slå på genet i en tidsmessig måte, men også gir mulighet for å slå av genet på et senere endepunktet. Variere mengden av en hemmer som doksycyklin vil også tillate brukeren å finjustere uttrykk. Til slutt de induserbare systemer tillater for reproduserbar ekspresjon av transgenet i alle celler, mens i dette retroviral protokollen er det chimeriske ekspresjon av transgenet. Som omtalt ovenfor, selv om dette kimære uttrykket kan være verdifulle for visse anvendelser. De induserbare systemer tydelig tilby enmange fordeler. Imidlertid, på grunn av den letthet og redusert bekostning av den teknikk som er beskrevet her, vil mange forskere finne det nyttig for deres studier av embryonal stamcelledifferensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
