Protocol
1 эмбриоида тела (EB) Формирование
- Желатин-адаптации ЭСК, которые были сохранены на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). Пассаж ЭСК 3 раза по 6 луночного планшета для культуры, покрытые 0,1% желатина удалить MEFs.
- Рост клеток в ESC обслуживания сред с LIF для поддержания недифференцированного клетки (Таблица 1). Убедитесь, что клетки никогда не превышает 80% слияния. Используйте низкий проход (10 или менее отрывки после удаления из MEFs) клеток к дифференциации.
- За день до ЭСК культивируют для EB дифференциации, прохождение клетки таким образом они будут примерно 50-70% сливной на следующий день. Продолжить культивирования клеток в ESC поддерживающую среду, чтобы сохранить сотовый плюрипотентности.
- В день дифференциации, технического обслуживания средств массовой информации аспирации ESC и промывают 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, и 11,9 мМ фосфатном буфере, рН 7,4) на лунку 6-луночного планшета.
- Добавить 200 мкл 0,25% trypsв / ЭДТА в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин.
- Инактивации трипсина / ЭДТА с 800 мкл дифференцировки. Пипеткой вверх и вниз в 2 мл серологической пипеткой с наконечником P200, чтобы сломать вверх клеток в суспензии отдельных клеток. Убедитесь, что наконечник p200 плотно на конце, поэтому СМИ не подняться между пипеткой и интерфейсе проводов.
- Внесите вверх и вниз примерно в 5-10 раз. Позаботьтесь, чтобы не создавать пузыри во время пипетки.
- Передача клетки 15 мл коническую трубку. Принесите объема до 10 мл PBS. Центрифуга при 315 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант. Мыть два раза с 5 мл PBS, чтобы удалить остатки бумаги, содержащие LIF. Центрифуга, как в шаге 1.4 для каждой стирки.
- Ресуспендируют конечный осадок клеток в 2 мл в среде для дифференцировки (таблица 2).
- Граф клеток с гемоцитометра или мобильный прилавок и пластины 6,000-10,000 клеток / мл в 10 см чашку Петри(Не тканевой культуры обработанных).
- Определить точное клеток / мл эмпирически для каждой линии ESC. Используйте стерильные чашки Петри, обычно используемые для бактериальной работы или низкой приверженности пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов дифференциации, что ЭТ должны формировать сферы, которые остаются во взвешенном состоянии, не подключая к пластине. Проверьте несколько марок плит, чтобы найти те, с наименьшим приверженности. - Выдержите дифференцирующие ЭСК в C культуры ткани инкубаторе с 5% CO 2 37 °.
- Определить точное клеток / мл эмпирически для каждой линии ESC. Используйте стерильные чашки Петри, обычно используемые для бактериальной работы или низкой приверженности пластин.
| Реагент | Фото | Конечная концентрация | Объем | Компания | Номер по каталогу |
| DMEM | 1x | 410 мл | S IGMA / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES экранированный) | 100% | 15% | 75 мл | Hyclone | SH30070.03E |
| Номера для незаменимых аминокислот | 100x | 1x | 5 мл | Life Technologies | 11140 |
| L-глютамин | 100x | 1x | 5 мл | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / стрептомицина | 100x | 1x | 5 мл | Life Technologies | 15070 |
| β-меркаптоэтанол | 14.3 M | 114 мкМ | 4 мкл | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Фактор ингибирования лейкоза (LIF) | 10 7 единиц / мл | 1000 ед / мл | 50 мкл | Millipore | ESG1107 |
| Реагент | Фото | Конечная концентрация | Объем | Компания | Номер по каталогу |
| DMEM | 1x | 410 мл | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (Пользователь скринингу на оптимальное дифференциации) | 100% | 15% | 75 мл | Hyclone | SH30070.03E |
| Номера для незаменимых аминокислот | 100x | 1x | 5 мл | Life Technologies | 11140 |
| L-глютамин | 100x | 1x | 5 мл | Жизнь Technoloгии | 35050 |
| Penncillin / стрептомицина | 100x | 1x | 5 мл | Life Technologies | 15070 |
| β-меркаптоэтанол | 14.3 M | 114 мкМ | 4 мкл | Sigma / Aldrich | M3148 |
Таблица 2: среде для дифференцировки.
2. Подготовка EB Клетки для вирусной инфекции
- На определенной стадии развития (между 2-й день и 3 дня), передать ЭТ от 10 см чашки Петри с 15 мл коническую трубку. Промыть пластины с 5 мл PBS и добавить мытье в конической трубе.
- Гранул ЭТ на 315 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин. Вымойте клетки EB с 5 мл PBS.
- Добавьте 1 мл талой раствора клеточной отряда (Содержит протеолитических и коллагенолитических ферментов) и поместить пробирки в водяной бане при 37 ° (или инкубатор) в течение 30 мин с OCCasional агитация (от стряхивая или светло встряхиванием).
- Добавьте 1 мл дифференцировки. Внесите вверх и вниз с 2 мл пипеткой с наконечником p200 пипетки. Поместите пробирку в водяной бане 37 ° снова в течение 30-60 мин.
- Спин вниз клетки при 315 мкг в течение 5 мин и промыть клетки с PBS.
3 Вирус Инфекция
- Ресуспендируют клеток в 1,5 мл в среде для дифференцировки. Передача клеточной суспензии в 6-луночный не-культуры ткани, обработанной пластины.
- Подготовьте ретровирус при помощи стандартных приемов загодя. Добавить 5 до 100 мкл вирусного супернатанта клеток в зависимости от титра вируса. Не добавляйте полибрена, чтобы добавлять инфекции, поскольку это тормозит последующее реформирование ЭТ.
- Spinoculate клетки с вирусом центрифугированием при 2120 х г в течение 90 мин при комнатной температуре.
4 Дифференцируя Вирусные инфицированных клеток EB в висячей капли
- Добавить 2 мл дифференцировки в каждую лунку Infected EB клеточной суспензии.
- Внесите 3,5 мл зараженной EB клеточной суспензии в стерильной водохранилища реагентов для multipipettors. Используйте multipipettor в пипетируйте 15-20 строк восьми 20 мкл капли на перевернутой крышке 15 см чашку Петри.
- Добавьте 10 мл стерильного PBS или воды в нижней части чашки Петри. Тогда инвертировать крышку с каплями и место на чашку Петри. Убедитесь, что капли висит вниз головой с крышкой с PBS или воды ниже, чтобы держать камеру увлажняется.
- Поместите посуду в 37 ° C культуре ткани инкубаторе с 5,0% СО 2.
- После 2 дней, собирают ЭТ, образованных в висячей капли путем инвертирования крышку и промывки 4,5 мл в среде для дифференцировки.
- Передача информации и ЭТ на новый 10 см без культуры ткани чашку Петри. Вымойте крышку еще раз с 3 мл дифференциации средств массовой информации и передачи в 10 см пластины.
- Урожай клетки для анализа с помощью проточной цитометрии после в общей сложности 8дней культуры, начиная с первоначального перевода клеток в среде для дифференцировки (-LIF).
5. Подготовка Клетки для анализа расхода Цитометр
- Передача клеток в 15 мл коническую пробирку с пипеткой 10 мл. Промыть пластины с 5 мл PBS и передать то же коническую трубку.
- Пелле клетки в 315 х г. Вымойте гранул с 10 мл PBS.
- Добавить 1 мл раствора талой открепления клеток и поместите пробирки в водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Для обнаружения некоторых антигенов клеточной поверхности, трипсин, может быть использован вместо.
- Добавить 1 мл дифференциации СМИ и пипетки вверх и вниз с 2 мл пипетки. Используйте кончик P200 к концу пипетки, чтобы помочь разбить-переваривают до EB в суспензии отдельных клеток.
- Поместите пробирку в водяной бане при 37 ° в течение 60 мин для того, чтобы интегральные мембранные белки, чтобы переработать на поверхность клетки.
- Гранул клетки при 315 мкг в течение 5 мин.
- Вымойте Wi клетокго 0,1% бычьего сывороточного альбумина фракции V (БСА) подготовлена в PBS (PBS / BSA) и инкубировали клетки с конкретными флуоресцентно помеченные антитела.
6 проточной цитометрии для гемопоэтических прародителей
- Поместите 10 6 EB полученные клетки в 5 мл 12 х 75 мм с круглым дном трубки. Для регулировки проточной цитометрии установками компенсации, использовать компенсационные бусы соответствии с инструкциями производителя.
- Пелле клетки в 315 х г. Слить супернатант и ресуспендируют осадок в остаточном растворе PBS / BSA в трубке.
- Для обнаружения ESC HPCS, инкубировать клетки с люминесцентными меченые антитела: анти-мышь CD41-PE (R-Phycoerytherin) и анти-мышь CD117 (cKit) -APC / CY7 (аллофикоцианин цианиновых 7).
- Развести антител 1: 100 в ЗФР / БСА. Добавьте 100 мкл разведенного антитела к каждому образцу. Определите правильное разведение антител для каждого поставщика, клона, и много или антитела. Определить оптимальную разбавления для маркировки клеток индивидуально.
- Инкубируйте образцы на льду в темноте в течение 30 мин.
- Добавить 2 мл PBS / BSA и пеллет клетки при 315 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 300 мкл PBS или другой изотонического буфера.
- Фильтр ресуспендировали клетки через ячейки сетчатого фильтра крышкой (0,35 мкМ) для удаления крупных клеточных агрегатов.
- Анализ клеток на цитометром потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этих исследованиях желатинированных RW4 (Производные от деформации 129X1 / SVJ мыши) ЭСК были использованы. ЭТ были выделены на 3 суток дифференцировки. Для достижения наилучших результатов в ЭТ должна быть сферической и не соблюдают (1А, Б). После spinoculation с вирусом совместно экспрессирующих флуоресцентный маркер GFP вместе с интересующего гена, ЭТ были преобразованы с помощью метода висячей капли. ЭТ были успешно реформирована из клеточных суспензий, приготовленных из 2,0, 2,5 и 3,0 дня EBS. Тем не менее, ЭТ не может быть реформирована из клеточных суспензий, приготовленных из день 4,0 EBS. Химеризм из ЭТ между инфицированных и неинфицированных клеток наблюдалось с помощью флуоресцентной микроскопии на 8-й день дифференцировки (Фигура 2А, В). Плотность ЭТ часто делает ЭТ-видимому, 100% GFP положительные. Однако, ориентируясь на различных фокусных плоскостей может выявить вклад GFP положительных и отрицательных клеток в ЭТ (Рисунок 2B).
Фог анализ развития HPC, химерные ЭТ диссоциировали до одноклеточных суспензий после 8 дней дифференцировки. Антагонистической активности микроРНК (ы) в mirn23a кластера (Мирс-23а, 24-2, и -27) приводит к неспособности ЭСК к дифференцировке в предшественников крови (Рукопись в стадии подготовки). Чтобы определить, избыточная экспрессия mirn23a кластера имеет противоположный эффект, ЭСК были инфицированы в начале дифференциации. Однако, это приводит к генерации из снизился HPCS. Поскольку mirn23a кластера могут быть вовлечены в TGFß / BMP / Smad сигнализации 18-21, кластер может иметь различные последствия, когда выразил на разных стадиях развития EB похожих на BMP4 активирована Smad1 белка 12,13. Используя этот протокол, EB одного клеточные суспензии были инфицированы через 3 дня дифференциации. ЭТ были реформированы на висячей капли, и затем анализировали на 8-й день для поколения HPC путем анализа CD41 и CD117 на поверхности клетки expressioN с помощью проточной цитометрии. CD41 + одиночные положительные клетки бассейн примитивных и окончательных HPCS, в то время как CD41 + CD117 + клетки содержат только окончательные HPCS 22,23. Мы наблюдали значительное увеличение в общей численности населения CD41 + HPCS в MSCV-mirn23a инфицированных клеток по сравнению с контрольным вирусом MSCV инфицированных клеток (рисунок 3). На рисунке также показано, что высокий вклад инфицированных клеток в реформированных ЭТ может быть достигнуто. Важно, чтобы инфицировать ЭТ как с вирусом контроль выражая флуоресцентный белок один, а также инфицировать клетки с экспериментальным вирусом. Зараженные населения (GFP +) должен быть по сравнению различий в фенотипа. Экспертизы различия между неинфицированных клеток против инфицированных клеток может давать ошибочные результаты. Сравнивая GFP- (неинфицированных) и GFP + (инфицирован) популяций есть разница в популяциях CD41 как в MSCV и MSCV-mirn23a культур (рис 3). Это увеличение может быть обусловленочтобы ретровирусов инфицировать пролиферативные клетки.
Рисунок 1: представитель День 3 эмбриональных телец RW4 ЭСК были переведены с ESC обслуживания СМИ в дифференциации СМИ и культивированный в 10 см пластинах () 4X и (B) 10X изображения показаны из эмбриональных телец, которые развивались после 3 дней культуры... В изображении 4X бар представляет 1000 мкм, в то время как в образе 10X бар представляет 400 мкм.
Рисунок 2: Восемь дней эмбриональные тельца (EB) реформированных ретровирусных инфицированных день 3 EB клеток. (A) левостороннем образы яркие поле. (B) Три люминесцентные колонны флуоресцентных изображений справа одинаковы EB приняты в дифных фокальных плоскостей. На изображениях 4X бар представляет 1000 мкм, в то время как в 10-кратного изображений бар представляет 400 мкм.
Фигура 3:. Анализ проточной цитометрией гемопоэтических клеток-предшественников, полученных в химерных ЭТ суспензии отдельных клеток получают из D3 ЭТ, и инфицировали указанными ретровирусами. ЭТ были реформированы на висячей капли, и культивировали еще 8 дней. Отдельные клеточные суспензии были получены и инкубировали с флуоресцентно меченных антител к CD41, CD117 и. Левой рукой Гистограмма показать GFP- (неинфицированных клеток) и GFP + (инфицированные клетки) ворота. Правым панели показывают цветовую точка участок клеток, позитивных по CD41 и CD117 выражение в GFP- и GFP + ворота. Примитивные кроветворные предшественники находятся в CD41 + фракции, и окончательные предшественники присутствуют как в CD41 + CD117-и CD41 + CD117 + фракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как обсуждалось выше, ESC клоны, которые экспрессируют индуцибельно представляющий интерес ген может быть сгенерирован с использованием доксициклина системы, однако, поколение этих линий отнимает много времени и трудоемким. Описанные в данном протоколе это метод для экспрессии гена интереса к суспензии отдельных клеток, полученной из ESC полученной ЭТ. Эти инфицированные клетки затем преобразовано в ЭТ по висячей капли изучить последующую дифференциацию. В примере (рисунок 3), было показано, что выражение mirn23a кластера усиливает развитие гемопоэтических при экспрессии в день 3 дифференцировки. В этот момент развитие возникающей зародышей слоя ткани имеет место в том числе ранней мезодермы, что приводит к образованию предшественников крови. В день 2 и 3 RW4 ESC дифференциации, экспрессии генов, представляющих эктодермы (Рах6), энтодерма (Foxa2), и мезодерма (T, Twist, и Tbx6) определяются в ходе количественного обратной ПЦР транскриптазы (Q-RT-PCR, данных не показано). Для миrn23a для увеличения производства HPC, это возможно, должны быть выражены в начале мезодермы. Эта методика позволяет за умение определить, если трансген имеет различные эффекты на его временной выражения, не затрачивая много усилий, чтобы генерировать новые реагенты. После наблюдения фенотипы, связанные с отдельной временной выражения, следователь можете теперь тратить усилия для создания индуцибельные линии, где выражение трансгена может быть под жестким контролем.
Другие приложения для этой техники выполнения спасательных эксперименты в ЭСК, где оба аллеля гена интереса были удалены (Double Knockout ЭСК, DKOS). Ген дикого типа или мутантные варианты удален ген может быть вновь в дифференциации клеток ЕВ. Кроме спасение фенотипа по генов ниже удаляемого гена можно быть проанализированы. Этот метод может быть использован для изучения клеток внутреннюю природу наблюдаемых фенотипов. Например, в hematopoiesis, дефекты были обнаружены в генах, которые влияют либо гемопоэтических стволовых и сами клетки-предшественники или иногда дефект может повлиять клетки в микросреды, которые необходимы для поддержки развития стволовых и прогениторных клеток 16,24. В этой системе, если дефект присуща гемопоэтических клеток-предшественников, то повторное введение гена дикого типа только спасти гемопоэтических развитие в ретровирусные (инфицированных) клеток GFP +. Если дефект, были не-клеточно-автономными, то ретровирусный инфекции приведет к спасения гемопоэтических развития наблюдается в обоих GFP + и GFP- населения.
В этом цитометрии потока протокол используется для идентификации гемопоэтических клеток-предшественников с помощью клеточной поверхности экспрессии CD41 и CD117. Кроме того, после того, как 8 сутки дифференцировки инфицированных GFP + клетки могут быть выделены путем сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Выделенные клетки могут быть затем анализировали на присутствие SPecific гемопоэтические клетки-предшественники по гемопоэтических колоний анализов в метилцеллюлозы СМИ как мы уже описано 25,26. Аналогичным образом, РНК можно экстрагировать из отсортированных клеток и анализировали на экспрессию определенных генов клона.
Преимущество описанного метода является то, что требуется минимальное усилие для получения необходимых реагентов, и позволяет временной экспрессии трансгена в развивающихся EB. Если вирусный вектор ко-экспрессии гена интереса с флуоресцентным белком уже доступна эксперимент может быть выполнено немедленно. Есть несколько ограничений, которые необходимо учитывать при выборе использовать этот протокол. Техника изложил здесь требует способность производить высокого титра ретровирус иметь достаточное количество клеток для анализа. Также отметим, что использование ретровируса может привести к инсерционного мутагенеза, что могло бы дать фенотип. Однако, так как этот протокол рассматривает пул инфицированных клеток вместоклональной населения, менее вероятно, что фенотип за счет инсерционного мутагенеза будет наблюдаться в течение короткого промежутка времени культуры. Основным недостатком метода (по сравнению с индуцируемого системы, такие как системы на TET) является то, что экспрессию трансгена не может быть подавлен в более поздний момент времени, и нет возможности контролировать уровни экспрессии. ESCs, которые экспрессируют трансген под контролем регулирования доксициклина является предпочтительным, так как он позволяет не только для включения гена во временном порядке, но также позволяет выключением гена на более поздней временной точке. Изменение количества индуктора, такие как доксициклин также позволит пользователю выполнять тонкую настройку различных выражения. И наконец индуцибельной системы позволяют воспроизводимой экспрессии трансгена во всех клетках, в то время как в этом ретровирусной протокола существует химерный экспрессии трансгена. Как обсуждалось выше, хотя это химерное выражение может быть полезен для некоторых приложений. Индуцибельных системы четко предложитьмного преимуществ. Тем не менее, благодаря легкости и снижение расходов по методике, описанной здесь, многие исследователи он будет полезен для их исследований эмбриональной дифференцировки стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
