Protocol
1. embrioide Cuerpo (EB) Formación
- Gelatina-ADAPT CES que se han mantenido en fibroblastos de embrión de ratón (MEFs). CES Passage 3 veces en 6 así placa de cultivo tisular recubiertas con gelatina al 0,1% para eliminar MEFs.
- Se cultivan las células en medio de mantenimiento con ESC LIF para mantener las células no diferenciadas (Tabla 1). Hacer seguras las células nunca exceden el 80% de confluencia. Utilice el paso bajo (10 o menos pasajes después de la eliminación de los MEF) para la diferenciación de las células.
- En el día antes de los CES se cultivan durante la diferenciación EB, el paso de las células para que sean aproximadamente 50-70% de confluencia el día siguiente. Continuar el cultivo de células en un medio de mantenimiento ESC para mantener la pluripotencia celular.
- En el día de la diferenciación, los medios de mantenimiento aspirado de ESC y se lava con 1 ml de tampón fosfato salino (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, y 11,9 mM de tampón de fosfato, pH 7,4) por pocillo de una placa de 6 pocillos.
- Añadir 200 l de 0,25% trypsen / EDTA a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
- Inactivar la tripsina / EDTA, con 800 l de medio de diferenciación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo en un 2 ml pipeta serológica con una punta de p200 a ruptura de las células en una suspensión de células individuales. Asegúrese de que la punta p200 encaje perfectamente en el extremo para medios de comunicación no suben entre la pipeta y la interfaz de punta.
- Pipet arriba y abajo aproximadamente 5-10 veces. Tenga cuidado de no crear burbujas durante el pipeteado.
- Células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Abra el volumen a 10 ml con PBS. Centrifugar a 315 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante. Lavar dos veces con 5 ml de PBS para eliminar residuos de medios que contienen LIF. Centrifugar como en el paso 1.4 para cada lavado.
- Resuspender el sedimento celular final en 2 ml de medio de diferenciación (Tabla 2).
- Contar las células con un hemocitómetro o contador de células y la placa 6.000-10.000 células / ml en una placa de Petri de 10 cm(Cultura no tejido tratado).
- Determinar las exactas células / ml empíricamente para cada línea de ESC. Utilice placas de Petri estériles normalmente utilizados para el trabajo bacteriana o placas de baja adherencia.
NOTA: Para obtener los mejores resultados de la diferenciación, los EBS deben formar esferas que permanecen en suspensión sin conectar a la placa. Pruebe varias marcas de placas para encontrar que tienen la menor adherencia. - Incubar los CES diferenciadores en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos con 5% de CO 2.
- Determinar las exactas células / ml empíricamente para cada línea de ESC. Utilice placas de Petri estériles normalmente utilizados para el trabajo bacteriana o placas de baja adherencia.
| Reactivo | Stock | Concentración final | Volumen | Empresa | Número de catálogo |
| DMEM | 1x | 410 ml | S igma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES apantallado) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Los ácidos no esenciales Amino | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamina | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35050 |
| Penncillin / estreptomicina | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoetanol | 14,3 M | 114 M | 4 l | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) | 10 7 unidades / ml | 1000 unidades / ml | 50 l | Millipore | ESG1107 |
| Reactivo | Stock | Concentración final | Volumen | Empresa | Número de catálogo |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (User Proyectado para la diferenciación óptima) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Los ácidos no esenciales Amino | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11140 |
| L-Glutamina | 100x | 1x | 5 ml | Vida Technologías | 35050 |
| Penncillin / estreptomicina | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15070 |
| β-mercaptoetanol | 14,3 M | 114 M | 4 l | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabla 2: Diferenciación Media.
2. preparar células EB para la infección del Virus
- En la fase de desarrollo deseado (entre el día 2 y el día 3), transferir los EBS de la placa de 10 cm Petri a 15 ml tubo cónico. Lavar la placa con 5 ml de PBS y añadir el lavado al tubo cónico.
- Sedimentar las EBS a 315 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Lávese las EB células con 5 ml de PBS.
- Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular descongelado (proteolítica que contiene enzimas y colagenolíticas) y colocar los tubos en un baño de agua a 37 ° C (o incubadora) durante 30 minutos con occagitación asional (de parpadeo o la luz agitación).
- Añadir 1 ml de medio de diferenciación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 2 ml con una punta de pipeta p200. Se coloca el tubo en el baño a 37 ° C de nuevo por 30-60 min.
- Centrifugar las células a 315 xg durante 5 min y se lavan las células con PBS.
Infección 3. Virus
- Resuspender las células en 1,5 ml de medio de diferenciación. Transferir la suspensión celular a una placa de cultivo no tisular de 6 pocillos tratada.
- Preparar el retrovirus mediante técnicas estándar de anticipación. Añadir 5 a 100 l de sobrenadante viral a las células en función de la titulación viral. No agregue polibrene para mejorar la infección, ya que inhibe la posterior reforma de EBS.
- Spinoculate las células con virus por centrifugación a 2120 xg durante 90 min a temperatura ambiente.
4. Diferenciar virales EB células infectadas en gotas colgantes
- Añadir 2 ml de medio de diferenciación a cada pocillo de infected EB suspensión celular.
- Pipetear 3,5 ml de suspensión celular infectado EB en un depósito de reactivo estéril para multipipettors. Utilice la multipipettor pipetear 15-20 filas de ocho 20 l cae sobre la tapa invertida de la placa de Petri de 15 cm.
- Añadir 10 ml de PBS estéril o agua a la mitad inferior de la placa de Petri. Luego invierta la tapa con las gotas y el lugar en la placa de Petri. Asegúrese de que los cuelguen gotas boca abajo de la tapa con PBS o agua por debajo para mantener la cámara húmeda.
- Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos con 5,0% de CO 2.
- Después de 2 días, recoger EBS formados en el ahorcamiento gotas por invertir la tapa y el lavado con 4,5 ml de medio de diferenciación.
- Medios de transferencia y EB a una nueva cultura de 10 cm no tejido placa Petri. Lavar la tapa una vez más con 3 ml de medio de diferenciación y la transferencia a la placa de 10 cm.
- Cosecha células para el análisis por citometría de flujo después de un total de 8días de cultivo a partir de la transferencia inicial de las células a medio de diferenciación (-LIF).
5. células Preparación para el Análisis citómetro de flujo
- Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta de 10 ml. Lavar la placa con 5 ml de PBS y transferir al mismo tubo cónico.
- Células de pellets a 315 x g. Lavar pellets con 10 ml de PBS.
- Añadir 1 ml de solución de desprendimiento de las células descongeladas y se colocan los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min con agitación ocasional. Para la detección de algunos antígenos de la superficie celular, la tripsina puede usarse en su lugar.
- Añadir 1 ml de medio de diferenciación y pipetear arriba y abajo con una pipeta de 2 ml. Utilice una punta de p200 a la final de la pipeta para ayudar a romper-up digiere EB en suspensión de células individuales.
- Se coloca el tubo en un baño a 37 ° C de nuevo durante 60 minutos para que las proteínas integrales de membrana para reciclar a la superficie celular.
- Pellet células a 315 xg durante 5 min.
- Lave el wi célulasº 0,1% albúmina de suero bovino fracción V (BSA) preparado en PBS (PBS / BSA) y se incuban las células con anticuerpos específicos marcados con fluorescencia.
6. Flow Analysis Citometría de Progenitores Hematopoyéticas
- Coloque 10 6 células EB derivados en un 5 ml 12 x 75 mm ronda tubo inferior. Para ajustar la compensación de citómetro de flujo, utilizar cuentas de compensación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Células de pellets a 315 x g. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en solución de PBS / BSA residual en el tubo.
- Para la detección de ESC HPC, incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescencia: anti-ratón CD41-PE (R-ficoeritrina) y anti-CD117 de ratón (cKit) -APC / CY7 (aloficocianina Cyanine 7).
- Diluir los anticuerpos 1: 100 en PBS / BSA. Añadir 100 l de anticuerpo diluido a cada muestra. Determinar la correcta dilución de anticuerpo para cada proveedor, clon, y mucho o anticuerpo. Determinar dilución óptima para el etiquetado de las células individualmente.
- Incubar las muestras en hielo en la oscuridad durante 30 min.
- Añadir 2 ml de células PBS / BSA y pellets a 315 g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 300 l de PBS u otro tampón isotónico.
- Filtro resuspendieron las células a través de una tapa de filtro de células (0,35 M) para eliminar grandes agregados de células.
- Analice las células en un citómetro de flujo.
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Representative Results
En estos estudios gelatinizadas RW4 (derivada de la cepa de ratón 129X1 / SvJ) CES se utilizaron. EBS se aislaron a los 3 días de la diferenciación. Para obtener los mejores resultados los OC deben estar esférica y no adherente (Figura 1A, B). Después de la espinoculación con el virus de co-expresión de la GFP marcador fluorescente junto con un gen de interés, EBS se reformó por el método de la gota colgante. EBS se reformaron con éxito a partir de suspensiones celulares preparadas a partir de 2,0, 2,5 y 3,0 días EBS. Sin embargo, EBS no podía ser reformada a partir de suspensiones celulares preparadas a partir de 4,0 días EBS. El quimerismo de los EBS entre células infectadas y no infectadas se observó por microscopía de fluorescencia a 8 días de diferenciación (Figura 2A, B). La densidad de la EBS a menudo hace que los OC parecen ser 100% GFP positiva. Sin embargo, centrándose en diferentes planos focales puede revelar la contribución de las células GFP positivas y negativas al EBS (Figura 2B).
For análisis del desarrollo HPC, EBS quiméricos se disociaron en suspensiones de células individuales después de 8 días de diferenciación. Antagonizar la actividad de los genes miARN (s) del clúster mirn23a (miRs-23a, 24-2, y -27) resulta en una incapacidad de los CES de diferenciarse en progenitores de sangre (manuscrito en preparación). Para determinar si la sobreexpresión de la agrupación mirn23a tiene el efecto opuesto, CES se infectaron en el inicio de la diferenciación. Sin embargo, esto resulta en la generación de la disminución de HPC. Desde el clúster mirn23a puede estar implicada en TGFß / BMP / Smad señalización 18-21, el clúster puede tener efectos distintos cuando se expresa en diferentes etapas de desarrollo EB similares a la proteína BMP4 Smad1 activado 12,13. El uso de este protocolo, EB suspensiones unicelulares se infectaron después de 3 días de diferenciación. EBS se reformaron a gota colgando, y posteriormente analizados en el día 8 para la generación de HPC ensayando y CD41 de la superficie celular CD117 expression por citometría de flujo. Células positivas CD41 + individuales son un grupo de HPCs primitivos y definitivas, mientras que las células CD41 + CD117 + contienen sólo HPCs definitivas 22,23. Se observó un aumento significativo en la población general de CD41 + HPC en las células MSCV-mirn23a infectados en comparación con las células infectadas MSCV virus de control (Figura 3). La figura también demuestra que una alta contribución de las células infectadas al EBS reformados se puede lograr. Es importante para infectar EBS tanto con un virus control que expresa la proteína fluorescente por sí sola, así como la infección de células con el virus experimental. Las poblaciones infectadas (GFP +) deben ser comparados a las diferencias en el fenotipo. El examen de las diferencias entre las células no infectadas frente a las células infectadas pueden dar resultados erróneos. La comparación de GFP (no infectada), y GFP + (infectados) poblaciones hay una diferencia en las poblaciones CD41 tanto en el MSCV y culturas MSCV-mirn23a (Figura 3). Este aumento puede ser debidoa retrovirus que infectan células proliferativas.
Figura 1: Día Representante 3 cuerpos embrionarios RW4 CES fueron cambiados de ESC medios de mantenimiento en medio de diferenciación y cultivadas en placas de 10 cm (A) 4X y (B) 10X imágenes se muestran de cuerpos embrionarios que se desarrollaron después de 3 días de cultivo... En la imagen de la barra representa 4X 1,000 m, mientras que en la imagen 10 veces la barra representa 400 micras.
Figura 2: Ocho días Cuerpos embrioides (EB) reformados de infectados día 3 EB células retrovirales. (A) Izquierda imágenes laterales de la mano son de campo claro. (B) Las tres columnas fluorescentes de imágenes fluorescentes a la derecha son los mismos EB tomada en difrentes planos focales. En las imágenes 4X la barra representa 1,000 m, mientras que en las imágenes 10X la barra representa 400 micras.
Figura 3:. Análisis de citometría de células progenitoras hematopoyéticas producidas en EBS quiméricos de flujo de suspensiones de células individuales se prepararon a partir d3 EBS, y se infectaron con los retrovirus indicados. EBS se reformaron a gota colgando, y cultivó un adicional de 8 días. Las suspensiones de células individuales se generaron y se incuban con anticuerpos marcados con fluorescencia a CD41, CD117 y. Histogramas mano izquierda muestran la GFP (células no infectadas) y GFP + (células infectadas) puertas. Los paneles de la derecha muestran de color gráfico de puntos de células positivas para CD41, CD117 y de expresión en el GFP y GFP + puertas. Los progenitores hematopoyéticos primitivos se encuentran en las fracciones CD41 +, progenitores y definitivos están presentes tanto en el CD + CD41117- y CD41 + CD117 + fracciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como se discutió anteriormente, los clones que expresan induciblemente ESC un gen de interés se pueden generar utilizando sistemas de doxiciclina, sin embargo, la generación de estas líneas es mucho tiempo y mano de obra intensiva. Descrito en este protocolo es un método para expresar un gen de interés en suspensión de células individuales preparado a partir de ESC derivado EBS. Estas células infectadas son luego reformaron en EBS en la horca caída examinar posterior diferenciación. En el ejemplo (Figura 3), se demostró que la expresión de la agrupación mirn23a mejora el desarrollo hematopoyético cuando se expresa en el día 3 de diferenciación. En este punto se ha producido el desarrollo de tejido capa germinal naciente incluyendo mesodermo temprano que da lugar a progenitores de sangre. En el día 2 y 3 de la diferenciación RW4 ESC, la expresión de genes que representan ectodermo (Pax6), endodermo (FoxA2), y el mesodermo (T, Twist, y Tbx6) son detectados por PCR cuantitativa la transcriptasa inversa (Q-RT-PCR, datos no se muestra). Para mirn23a para mejorar la producción de HPC, puede ser necesario que se expresa en el mesodermo temprano. Esta técnica permite la capacidad de determinar si un transgén tiene diferentes efectos sobre su expresión temporal sin gastar mucho esfuerzo para generar nuevos reactivos. Al observar fenotipos asociados con la expresión temporal distinto, un investigador puede querer pasar ahora el esfuerzo para generar líneas inducibles donde la expresión del transgén puede ser estrechamente controlada.
Otras aplicaciones de esta técnica incluyen la realización de experimentos de rescate en CES, donde se han eliminado los dos alelos de un gen de interés (Doble Knockout CES, DKOs). El gen de tipo salvaje o versiones mutadas del gen suprimido podrían ser reintroducidos en las células EB diferenciadores. Además de un fenotipo de rescate por los genes aguas abajo del gen suprimido puede ser ensayada. Este método puede ser utilizado para examinar la naturaleza intrínseca de células de los fenotipos observados. Por ejemplo, en hematopoiesis, los defectos se han observado en los genes que afectan ya sea la madre hematopoyéticas y las propias células progenitoras o, a veces el defecto puede afectar a las células en el microambiente que se necesitan para apoyar el desarrollo de las células madre y progenitoras 16,24. En este sistema, si el defecto es intrínseco a las células progenitoras hematopoyéticas, a continuación reintroducción del gen de tipo salvaje será sólo rescatar el desarrollo hematopoyético en las células infectadas (retrovirales) GFP +. Si el defecto eran no de células autónomas, entonces la infección retroviral daría lugar a un rescate de desarrollo hematopoyético observándose en ambos GFP + y poblaciones GFP.
En este protocolo de citometría de flujo se utiliza para identificar las células progenitoras hematopoyéticas por la expresión de la superficie celular de CD41 y CD117. Alternativamente, después de 8 días de diferenciación infectaron células GFP + podría ser aislados por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las células aisladas pueden ensayarse luego en cuanto a la presencia de spprogenitores hematopoyéticos e cifica por ensayos de colonias hematopoyéticas en medios metilcelulosa como hemos descrito anteriormente 25,26. Del mismo modo, el ARN se puede extraer de células clasificadas y se analizó para la expresión de genes específicos de linaje.
La ventaja de la técnica descrita es que requiere un esfuerzo mínimo para generar los reactivos necesarios, y permite la expresión temporal de un transgén en el EB en desarrollo. Si un vector viral co-expresar el gen de interés con una proteína fluorescente ya está disponible el experimento se puede realizar inmediatamente. Hay algunas limitaciones que deben ser considerados con la elección de utilizar este protocolo. La técnica descrita aquí requiere la capacidad de producir retrovirus alto título para tener un número suficiente de células para el análisis. Tenga en cuenta también que el uso del retrovirus puede dar como resultado mutagénesis insercional que podría producir un fenotipo. Sin embargo Dado que este protocolo está examinando un conjunto de células infectadas en lugar de unpoblación clonal, es menos probable que un fenotipo debido a la mutagénesis de inserción se observó en el corto tiempo de cultivo. La principal limitación de la técnica (en comparación con un sistema inducible tal como al sistema tet) es que la expresión del transgén no puede ser silenciado en un punto de tiempo más tarde, y no hay capacidad de controlar los niveles de expresión. CES que expresan un transgén bajo el control de la regulación de la doxiciclina es ventajoso ya que permite no sólo para encender el gen de una manera temporal, sino que también permite la desactivación del gen en un punto de tiempo más tarde. La variación de la cantidad de un inductor, como la doxiciclina también permitirá al usuario ajustar la expresión. Por último los sistemas inducibles permiten la expresión reproducible del transgén en todas las células, mientras que en este protocolo retroviral hay expresión quimérico del transgén. Como se discutió anteriormente, aunque esta expresión quimérico podría ser valiosa para algunas aplicaciones. Los sistemas inducibles ofrecen claramente unamontón de ventajas. Sin embargo, debido a la facilidad y la disminución de los gastos de la técnica descrita aquí, muchos investigadores encontrarán útil para sus estudios de diferenciación de células madre embrionarias.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
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